RNA浓度测定(紫外光吸收法)

1、精选优质文档-倾情为你奉上RNA浓度测定（紫外光吸收法） 一、 实验目的1. 了解紫外吸收法测定RNA浓度的原理。2. 熟悉紫外分光光度计的基本原理和使用方法。二、 实验原理核酸、核苷酸及其衍生物的分子结构中的嘌呤、嘧啶碱基具有共轭双健系统(CC一CC 一)，能够强烈吸收250280nm 波长的紫外光。核酸(DNA，RNA)的最大紫外吸收值在260nm 处。遵照Lambert-Beer 定律，可以从紫外光吸收值的变化来测定RNA物质的含量。在不同pH 溶液中嘌呤、嘧啶碱基互变异构的情况不同，紫外吸收光也随之表现出明显的差异，它们的摩尔消光系数也随之不同。所以，在测定核酸物质时均应在固定的pH溶

2、液中进行。三、 实验器材1. UV-9100型紫外可见分光光度计。2. 容量瓶100ml（*1）3. 试管 1.5cm*15cm（*9）4. 吸管四、 实验试剂1. 酵母RNA2. 标准RNA试剂（100微克每毫升）3. NaOH溶液五、 实验步骤1. RNA粗品的制备称取8g干酵母粉于100ml烧杯中，加入0.2%NaOH溶液40ml，沸水浴加热30min，经常搅拌。冷却，然后4000r|min离心15分钟。取上清液，加入95%酸性乙醇40ml，边加边搅。加毕，静置5-10min离心。滤液先用95%乙醇洗2次，继而用无水乙醇洗2次，洗涤时可用细玻璃棒小心搅动沉淀。乙醇滤干后，滤渣即为粗RNA

3、。2. 样品的处理：称取0.20.25g粗品RNA，加2ml0.2%NaOH和1ml H2O溶解，调成糊状，再加入4050mlH2O,溶解，调PH至7.0，后定容至100ml（再取2ml 定容至100ml待测，此过程重复三次）3. 标准曲线的绘制取六支试管，编号，按表加入试剂六、作表作图:260nmRNA m:0.2133g试管123456ABC标准RNA(ML)012345蒸馏水（ml）1098765RNA浓度g|ml01020304050吸光度0.0000.2320.4330.6270.8170.9810.5190.5230.522测得样品RNA浓度为25.3g|ml样品RNA质量为 25

4、.3g|ml×50×100ml=0.1265g样品RNA纯度：0.1265÷0.2133=59.3%七、误差分析1. 根据理论在545g|ml与吸光值成正比，而该范围的两个端点没有取到，六号试管RNA浓度已经超出了范围，不能作为曲线的参考值。2. 因为是做了三次平行试验，所以在样品三次定容时可能有些许误差。3. 在配置标准RNA浓度时可能导致RNA浓度有些许的误差。4. 样品中可能含有少量蛋白质，DNA，对紫外光也有强吸收作用会产生误差。八、思考题1采用紫外光吸收法测定样品的核酸含量，有何优点及缺点？用紫外光吸收法测定样品的核酸含量，具有简单、快速、灵敏度高的优点，并且待测核酸样品中含有的微量蛋白质和核苷酸等吸收紫外光物质，产生较小测定误差。但该法在测定样品内混杂有大量的上述吸收紫外光物质时，则会产生较大测定误差，需要设法事先除去。2若样品中含有核苷酸类杂质，应如何校正？当样品中含有核苷酸类杂质时，需要加钼酸铵-过氯酸沉淀