火腿肠的检测方法

1、火腿肠的检测方法长沙理工大学生物与食品工程学院 何应洪 摘要：是人们经常食用的一种食品，其质量直接影响到消费者的身体健康。据业内人士讲，由于肉灌肠工艺较简单，设备投入不大，因此，小作坊式生产的厂家较多，质量难以保证。一些街头摊点经销的肉肠由于进货渠道较乱，加之储存、保鲜条件较差，质量更令人担忧。本文主要介绍火腿肠的检测方法。关键词：蛋白质 脂肪 淀粉 亚硝酸盐 山梨酸 微生物蛋白质、脂肪、淀粉国家有行业推荐标准，但绝大部分企业都执行企业标准，而企业标准在一些项目上明显低于国家行业标准。1.1 蛋白质 考马斯亮兰法（Bradford法）1.1.1 实验原理双缩脲法（Biuret法）和Folin酚

2、试剂法（Lowry法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比

3、。Bradford法的突出优点是：（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。 （2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。 （3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K 、Na 、Mg2 离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、

4、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。此法的缺点是： （1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作 标准曲线时通常选用 g球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。 （2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH。（如同0.1N的酸干扰Lowary法一样）。 （3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。 试剂与器材1. 试剂：（1）标准蛋白质溶液，用 g球蛋白或牛血清清蛋白(BS

5、A)，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。（2）考马斯亮兰G250染料试剂：称100mg考马斯亮兰G250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀释至1升。2. 器材：（1）可见光分光光度计 （2）旋涡混合器 （3）试管16支1.1.3 操作方法1. 标准方法（1）取16支试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分为两组按表中顺序，分别加入样品、水和试剂，即用1.0mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用无离子水补充到0.1ml。最后各试管中分别加入5.0ml考马

6、斯亮兰G250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）。未知样品的加样量见下表中的第8、9、10管。（2）加完试剂25分钟后，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值A595，空白对照为第1号试管，即0.1mlH2O加5.0mlG250试剂。注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。（3）用标准蛋白质量（mg）为横座标，用吸光度值A595为纵座标，作图，即得到一条标准曲线。由此标准曲线，根据测出的未知样品的A595

7、值，即可查出未知样品的蛋白质含量。0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.50。2. 微量法当样品中蛋白质浓度较稀时（10100mg/ml）,可将取样量（包括补加的水）加大到0.5ml或1.0ml, 空白对照则分别为0.5ml或1.0ml H2O, 考马斯亮蓝G250试剂仍加5.0ml, 同时作相应的标准曲线，测定595nm的光吸收值。0.05mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.29。1.2 脂肪 索氏抽提法1原理样品用无水乙醚或石油醚等溶剂抽提后，蒸去溶剂所得的物质，在食品分析上称为脂肪或粗脂肪。因为除脂肪外，还含色素及挥发油、蜡、树脂等物。抽提法所测得的脂肪为游离脂肪。2试剂

8、2.1无水乙醚或石油醚。2.2海砂：同GB 5009.385食品中水分的测定方法2.3。3仪器索氏提取器。4操作方法4.1样品处理固体样品：精密称取25g(可取测定水分后的样品)，必要时拌以海砂，全部移入滤纸筒内。液体或半固体样品：称取5.010.0g，置于蒸发皿中，加入海砂约20g于沸水浴上蒸干后，再于95105干燥，研细，全部移入滤纸筒内。蒸发皿及附有样品的玻棒，均用沾有乙醚的脱脂棉擦净，并将棉花放入滤纸筒内。4.2抽提：将滤纸筒放入脂肪抽提器的抽提筒内，连接已干燥至恒量的接受瓶，由抽提器冷凝管上端加入无水乙醚或石油醚至瓶内容积的2/3处，于水浴上加热，使乙醚或石油醚不断回流提取，一般抽提

9、612h。4.3称量：取下接受瓶，回收乙醚或石油醚，待接受瓶内乙醚剩12ml时在水浴上蒸干，再于95105干燥2h，放干燥器内冷却0.5h后称量。4.4计算1.3 淀粉 酸水解法原理：样品经除去脂肪及可溶性糖类后，其中淀粉用酸水解成具有还原性的葡萄糖，然后按还原糖测定，并折算成淀粉含量。换算系数为162/180=0.9。适用范围：适用于淀粉含量较高，而其它能被水解为还原糖的多糖含量较少的样品。因为酸水解法不仅使淀粉水解，其他多糖如半纤维素和多缩戊糖等也会被水解为具有还原性的木糖、阿拉伯糖等，使得测定结果偏高。因此，对于淀粉含量较低而半纤维素、多缩戊糖和果胶含量较高的样品不适宜用该法。特点：操作

10、简单、应用广泛，但选择性和准确性不如酶法。试剂：碱性酒石酸铜甲、乙液；2%（W/V%）盐酸溶液；6mol/L盐酸；10及40%氢氧化钠溶液；0.2标准葡萄糖溶液；甲基红指示剂。仪器：冷凝器或lm以上长玻璃管。1.3.2 测定步骤： 样品处理：乙醚除去脂肪；乙醇除去可溶性糖类 水解：于盛有样品处理液的250ml锥形瓶中，加入30毫升6N盐酸，接好冷凝管，置沸水浴中回流2小时。回流完毕后，立即置流水中冷却。待样品水解液冷却后，加入2滴甲基红指示液，先以40氢氧化钠溶液调至黄色，再以6N盐酸校正至水解液刚变红色为宜。若水解液颜色较深，可用精密PH试纸测试，使样品水解液的PH约为7。然后加20毫升20

11、乙酸铅溶液，摇匀，放置10分钟，以沉淀蛋白质、有机酸、果胶等。再加20毫升10硫酸钠溶液，以除去过多的铅。摇匀后将全部溶液及残渣转入500毫升容量瓶中，用水洗涤锥形瓶，洗液合并于容量瓶中，加水稀释至刻度。过滤，弃去初滤液20毫升，滤液供测定用。标定：同“还原糖的测定”中的“直接滴定法”样液的测定：同“还原糖的测定”中的“直接滴定法”同时做试剂空白试验：取100mL水和30mL6mol/L盐酸于锥形瓶中，按上述方法操作。 计算：式中： F-10ml斐林试剂相当的葡萄糖量 V0-滴定时空白溶液消耗量 V-滴定时样品水解液消耗量 m-试样称取量（g） 0.9-葡萄糖转换为淀粉的系数 100-换算为1

12、00g试样 500样液总体积1.4 亚硝酸盐 单扫描示波极谱法测定香肠中的亚硝酸盐 量取一定量的NO2标准溶液于电解池中，加入0.2ml品红溶液，3ml0.1mol/L盐酸，直到混合液的颜色变为亮红色，然后加入0.2ml8-羟基喹啉溶液，4ml3.0mol/L的氨水。这时溶液呈橙色。再向其中加入用蒸馏水稀释到10mol。开始进行极谱分析。初始扫描电压0.5V（对饱和氯化亚汞电极）。峰的高度在0.7V时被记录下来。（与分光光度测定法相对比）。（图1）: 亚硝酸盐样品的检测称取5.000g香肠，在50ml烧杯中研磨。依据中华人民共和国的国家标准处理样品。通过蛋白质沉淀，脱脂后，量取2-3.00ml

13、到10ml容量瓶中。然后依据随后的操作程序在极谱记录仪上测定，根据工作曲线计算含量。分光光度测定法是依据美国国家标准。结果是一致的。1.5 山梨酸通过对液态、固液混合态食品前处理方法的改进,用气相色谱法快速测定山梨酸、苯甲酸的含量。样品酸化后用乙醚提取,直接取上清液进样分析,使用美国安捷伦公司6890型气相色谱仪,氢火焰离子化检测器(FID)和DB-FFAP123-3233色谱柱(30m320m)1h内可测得两种防腐剂的平均回收率为99.82%(n=6),平均相对标准偏差为1.265%,检测限为1 mg/kg。 方法气相色谱分析条件美国安捷伦公司6890型气相色谱仪,氢火焰离子化检测器(FID

14、);DB-FFAP123-3233色谱柱(30m320m0.5m);进样口温度250;升温程序:初始柱温180,保持15min;升温速率30/min,最终温度220,保持5min。FID检测器温度250,载气为高纯氮气,流量25mL/min,氢气流量40mL/min,空气流量450mL/min,尾气流量44.9mL/min,分流比81,进样体积为1L。标准溶液的配制精密称取山梨酸0.2575g,苯甲酸0.2508g,混合,用乙醚定容至100mL容量瓶,作为储备液。再稀释储备液,即依次吸取1mL、2mL、3mL、4mL、5mL储备液,分别用乙醚定容于50mL容量瓶作为标准溶液,用此五种标准溶液测

15、定有关防腐剂的检测限、线性范围并分析精密度。样品的前处理与测定方法前处理:称取23g混合均匀的样品,置于100mL的烧杯中,加适量去离子水,超声提取30min,过滤于50mL的比色管中,加盐酸(1+1)0.5mL酸化,准确加入10mL乙醚,振摇1min,静置备用。测定方法:直接吸取样品上层澄清液进样,测定峰面积与标准曲线比较定量。用本法处理样品,能够快速测定液态、固液混合态食品中的山梨酸、苯甲酸含量,且平均回收率为99.82%(n=6),平均相对标准偏差为1.265%,检出限为1mg/kg,因此本方法完全符合防腐剂检测要求,具有推广价值。1.6 沙门氏菌快速检测法 Transia沙门氏菌平板检

16、测法与耗时、昂贵的传统方法相比，此法快12天，且每次检测所需的操作时间缩短。该法建立在夹心ELISA法的基础上，利用多抗体混合物以保证检出所有的沙门氏菌血清型。反应的固相载体是一种有可见或不可见条纹的微量反应板。其小孔内包被有沙门氏菌的特异性单克隆抗体。第一阶段，在小孔内加入样品和抗体联合物(沙门氏菌属特异性单克隆和多克隆抗体的混合物)。孵育期间，沙门氏菌抗原和包被抗体形成了一种复合物：包被单克隆抗体-沙门氏菌抗原-抗体联合物。洗涤后，通过每孔加入基质溶液(过氧化脲)和色素原溶液(四甲基氨基丙苯)来显示上述复合物；酶催化色素原的氧化，结果产生蓝色。加入反应终止液终止催化反应，并使反应混合物酸化，颜色由蓝变黄。这种ELISA方法可对经选择性增菌及热休克作用后，释放了特异性沙门氏菌抗原的食品和环境样品进行检测。如采用黎兆滚等人的样品制备法，可大大缩短检测时间；此法可在没有酶标仪的实验室进行，从这点来说，Transia沙门氏菌平板检测法比黎兆滚等人的微量板ELISA法(Salmonella test 1)更适应于一般的