基础生物化学-核酸合成

1、12 核酸的合成核酸的合成12.1 DNA的生物合成的生物合成12.2 RNA的生物合成的生物合成12.3 核酸合成抑制剂核酸合成抑制剂12.4 基因工程简介基因工程简介DNA是生物界遗传的主要物质基础。生物有是生物界遗传的主要物质基础。生物有机体的遗传特征以密码的形式编码在机体的遗传特征以密码的形式编码在DNA分分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序子上，表现为特定的核苷酸排列顺序即即遗传信息。遗传信息。在细胞分裂前通过在细胞分裂前通过DNA的复制，将遗传信息的复制，将遗传信息由亲代传递给子代，在后代的个体发育过程由亲代传递给子代，在后代的个体发育过程中，遗传信息自中，遗传信息自DNA转录给转录

2、给RNA，并指导，并指导蛋白质合成，以执行各种生命功能，使后代蛋白质合成，以执行各种生命功能，使后代表现出与亲代相似的遗传性状。表现出与亲代相似的遗传性状。80年代以后在某些致癌年代以后在某些致癌RNA病毒中发现遗传病毒中发现遗传信息也可存在于信息也可存在于RNA分子中，由分子中，由RNA通过通过逆转录的方式将遗传信息传递给逆转录的方式将遗传信息传递给DNA。遗传信息的传递方向即生物界遗传信息传递遗传信息的传递方向即生物界遗传信息传递的中心法则。的中心法则。RNADNA蛋白质蛋白质转录转录逆转录逆转录？翻译翻译DNA复制复制RNA复制复制（依赖（依赖DNA的的DNA聚合酶）聚合酶）（依赖（依赖

3、DNA的的RNA聚合酶）聚合酶）（依赖（依赖RNA的的DNA聚合酶）聚合酶）（依赖（依赖RNA的的RNA聚合酶）聚合酶）12.1 DNA的生物合成的生物合成12.1.1 DNA的复制的复制为了保证遗传的稳定性，在每次细胞分裂之为了保证遗传的稳定性，在每次细胞分裂之前，遗传信息载体必须精确地复制自己。前，遗传信息载体必须精确地复制自己。遗传信息的载体是遗传信息的载体是DNA，但许多病毒的遗传，但许多病毒的遗传信息载体是信息载体是RNA而不是而不是DNA。12.1.1.1 DNA复制的半保留性复制的半保留性DNA复制（复制（replication）：在亲代双链）：在亲代双链DNA分子的每一条链上按

4、碱基互补配对而准确地分子的每一条链上按碱基互补配对而准确地合成一条新的互补链，结果生成两个与亲代合成一条新的互补链，结果生成两个与亲代链相同的链相同的DNA双链的过程。双链的过程。半保留复制半保留复制(semi conservation replication)由于每个子代由于每个子代DNA的一条链来自亲代的一条链来自亲代DNA，另一条链则是新合成的。这种复制方式称为另一条链则是新合成的。这种复制方式称为半保留复制半保留复制。半保留复制的证据半保留复制的证据1958年年Meselson和和Stahl的实验首次支持了半保的实验首次支持了半保留复制方式。留复制方式。将大肠杆菌放在将大肠杆菌放在15

5、NH4C1培养基中生长培养基中生长15代，代，使使DNA被被15N标记后，再将细菌移到只含有标记后，再将细菌移到只含有14NH4C1的培养基中培养。的培养基中培养。在不同的时间取出样品裂解细胞后，将裂解液在不同的时间取出样品裂解细胞后，将裂解液进行密度梯度离心。进行密度梯度离心。离心后从管底到管口。离心后从管底到管口。DNA分子就停留在与其分子就停留在与其相当的相当的CsC1密度处，在紫外光下可以看到形密度处，在紫外光下可以看到形成的区带。成的区带。14N-DNA分子密度较轻分子密度较轻(1.7g/cm3)，停留在离管，停留在离管口这较近的位置；口这较近的位置；15N-DNA密度较大停留在密度

6、较大停留在较低的位置上。较低的位置上。当含有当含有15N-DNA的细胞在的细胞在14NH4C1培养液中培培养液中培养一代后，只有一条区带介于养一代后，只有一条区带介于14N-DNA与与15N-DNA之间，表明之间，表明DNA一条链来自一条链来自15N-DNA，另一条链为含有，另一条链为含有14N的新合成链。的新合成链。培养两代后则在培养两代后则在14N-DNA区又出现一条带。区又出现一条带。按照半保留复制方式培养两代，只能出现按照半保留复制方式培养两代，只能出现14N-15NDNA两种分子，随着代数的增加两种分子，随着代数的增加14N-DNA逐渐增加。而逐渐增加。而14N-15NDNA区带逐渐

7、减弱。区带逐渐减弱。Meselson和和Stahl的实验证实了保留复制的设想的实验证实了保留复制的设想。DNA的半不连续复制的半不连续复制DNA复制是半保留复制，并且是半不连续复制复制是半保留复制，并且是半不连续复制(Semi-ondisctinuous replication)。DNA双螺旋的两条链是反向平行的，因此，在双螺旋的两条链是反向平行的，因此，在复制起点处两条复制起点处两条DNA链解开成单链时，一条链解开成单链时，一条是是53方向，另一条是方向，另一条是35方向。方向。以这两条链为模板时，新生链延伸方向一条为以这两条链为模板时，新生链延伸方向一条为35，另一条为，另一条为53。但生

8、物细胞内所有。但生物细胞内所有催化催化DNA聚合酶都只能催化聚合酶都只能催化53延伸。延伸。在复制起点两条链解开形成复制泡在复制起点两条链解开形成复制泡(replication bubbles)，DNA向两侧复制形成两个复制叉向两侧复制形成两个复制叉(replication forks)。以复制叉移动的方向为基准，一条模板链是以复制叉移动的方向为基准，一条模板链是35，以此为模板的新生，以此为模板的新生DNA链合成沿链合成沿53方向连续进行，这条链称前导链方向连续进行，这条链称前导链(leading strand)。另一条模板链的方向为另一条模板链的方向为53，以此为模板的，以此为模板的DNA

9、合成也是沿合成也是沿53方向进行，但与复制方向进行，但与复制叉前进方向相反，且是分段、不连续合成的，叉前进方向相反，且是分段、不连续合成的，这条链称滞后链这条链称滞后链(lagging strand)，合成的片，合成的片段为冈崎片段段为冈崎片段(Okaxaki fragments) 。这些冈崎片段以后由这些冈崎片段以后由DNA连接酶连成完整的连接酶连成完整的DNA链。链。前导链的连续复制和滞后链的不连续复制，前导链的连续复制和滞后链的不连续复制，称为称为DNA合成的半不连续复制。合成的半不连续复制。12.1.1.2 DNA的复制酶和相关蛋白的复制酶和相关蛋白DNA复制就是复制就是DNA指导的指

10、导的DNA合成代谢，需合成代谢，需要有要有DNA作为复制的模板。作为复制的模板。三磷酸核苷酸三磷酸核苷酸(dNTP)是合成原料。是合成原料。有模板和合成原料后，细胞内还有许多酶和蛋有模板和合成原料后，细胞内还有许多酶和蛋白质参与白质参与DNA的复制。的复制。DNA聚合酶聚合酶(DNA Polymerases)DNA聚合酶的性质聚合酶的性质以脱氧核苷酸三磷酸以脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)为前体催化合成为前体催化合成DNA；需要模板和引物的存在；需要模板和引物的存在；不能起始合成新的不能起始合成新的DNA链；链；催化催化dNTP加到加到生长中生长中DNA链的链的3-OH末端；末端；催化催化DNA合

11、成合成的方向是的方向是53。1956年年Kornberg首先首先发现了发现了DNA聚合酶，聚合酶，又称又称Kornberg酶。酶。大肠杆菌大肠杆菌DNA polymerase (pol)DNA pol由一条多肽链组成，约含由一条多肽链组成，约含1000个氨个氨基酸残基，基酸残基，MW为为109KD。每个大肠杆菌细胞中含有约每个大肠杆菌细胞中含有约400个分子，每个个分子，每个分子分子37下能催化下能催化667bt/min掺入正在生长的掺入正在生长的DNA链。链。经过枯草杆菌蛋白酶处理后，酶分子分裂成两经过枯草杆菌蛋白酶处理后，酶分子分裂成两个片段，大片段分子量为个片段，大片段分子量为76KD，

12、通常称为，通常称为Klenow片段片段,有聚合酶活性和有聚合酶活性和35外切酶活外切酶活性；小片段的分子量为性；小片段的分子量为34KD，有，有53外切外切酶活性。酶活性。功能功能a. 聚合作用聚合作用在引物的在引物的3-OH末端，以末端，以dNTP为底物，按模为底物，按模板板DNA上的指令由上的指令由DNA pol逐个聚合上核逐个聚合上核苷酸。苷酸。b. 35外切酶活性（校对作用）外切酶活性（校对作用）35外切酶活性是从外切酶活性是从35方向识别和切除方向识别和切除不配对的不配对的DNA生长链末端的核苷酸。生长链末端的核苷酸。错误核苷酸进入错误核苷酸进入pol的结合位点不能与模板的结合位点不

13、能与模板配对，无法改变酶的构象而被配对，无法改变酶的构象而被35外切酶外切酶活性位点所识别并切除。活性位点所识别并切除。c. 53外切酶活性（切除修复作用）外切酶活性（切除修复作用）53外切酶活性是从外切酶活性是从53方向水解方向水解DNA生生长链前方的长链前方的DNA链。它只作用具切口的双螺链。它只作用具切口的双螺旋旋DNA，并在切口以外的配对区切割。，并在切口以外的配对区切割。DNA pol不是大肠杆菌中不是大肠杆菌中DNA复制的主要酶复制的主要酶的一些证据。的一些证据。a. 体内体内DNA合成速率比纯化的合成速率比纯化的DNA pol催化催化dNTP掺入速率（掺入速率（667nt/min

14、）高）高20倍；倍；b. 大肠杆菌的一个突变株中，大肠杆菌的一个突变株中， pol的活力正的活力正常，但染色体常，但染色体DNA复制不正常；复制不正常； c. 在一些突变株中，在一些突变株中，pol的活力只是野生型的活力只是野生型的的1%，但，但DNA复制却正常，而此突变株对复制却正常，而此突变株对辐射和化学诱变剂却高度敏感。辐射和化学诱变剂却高度敏感。DNA pol在在DNA修复中起着重要的作用。修复中起着重要的作用。大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶(DNA pol)1970年发现年发现DNA pol。MW为为120KD，每个，每个细胞内约有细胞内约有100个酶分子，但活性只有个酶分子，但

15、活性只有DNA pol的的5%。聚合作用聚合作用: pol催化催化DNA的聚合，它最适模板的聚合，它最适模板是双链是双链DNA而中间有小空隙而中间有小空隙(gap，50200个个核苷酸核苷酸)的单链的单链DNA部份。部份。pol具有具有35外切酶活性，但无外切酶活性，但无53外切外切酶活性。酶活性。pol缺陷的大肠杆菌突变株的缺陷的大肠杆菌突变株的DNA复制正常。复制正常。 表明表明pol不是不是DNA复制的主要酶，它可能复制的主要酶，它可能在在DNA损伤修复中起一定作用。损伤修复中起一定作用。 大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶(DNA pol)DNA pol 是至少以是至少以10种亚基组成

16、的复合物形种亚基组成的复合物形态存在并发挥功能，此复合物称为态存在并发挥功能，此复合物称为DNA聚合聚合酶全酶。酶全酶。 其中其中a a、e e及及q q等三个亚基构成核心聚合酶等三个亚基构成核心聚合酶(core polymerase)，它具有聚合酶和，它具有聚合酶和35核酸外核酸外切酶的活力切酶的活力。 DNA聚合酶聚合酶的主要亚基及其装配层次组成的主要亚基及其装配层次组成亚基亚基 MW(103) 组装层次组装层次 a 130 27.5 10 71 47.5 35 33 15 12 40.6pol pol pol *复合体复合体全酶全酶pol 全酶的结构是一种非对称二聚体。全酶的结构是一种非

17、对称二聚体。pol 在细胞内数量少（每个大肠杆菌细胞中在细胞内数量少（每个大肠杆菌细胞中只有只有10-20个酶分子），但催化个酶分子），但催化dNTP掺入掺入DNA链的速率链的速率是是DNA pol的的15倍。倍。pol 是细胞内是细胞内DNA复制所必需的酶，缺乏该复制所必需的酶，缺乏该酶的温度突变株在限制温度酶的温度突变株在限制温度(non permissive temperature)内是不能生长的，此种突变株内是不能生长的，此种突变株的裂解液也不能合的裂解液也不能合DNA，但加入，但加入pol 则可则可以恢复其合成以恢复其合成DNA的能力。的能力。引物酶引物酶(Primase) 和引发体

18、和引发体引物酶以单链引物酶以单链DNA为模板，利用核糖核苷酸合为模板，利用核糖核苷酸合成成RNA作为作为DNA合成的引物。合成的引物。大肠杆菌的引物酶由一条多肽链组成，大肠杆菌的引物酶由一条多肽链组成，MW为为60KD，每个细胞中有，每个细胞中有50-100个分子，由大肠个分子，由大肠杆菌的杆菌的dnaG基因编码。基因编码。引物酶与引物酶与DnaB、DnaC、DnaT、PriA、PriB、PriC等蛋白组成引发体才有活性。等蛋白组成引发体才有活性。DNA连接酶连接酶(DNA ligase )DNA连接酶的主要功能是借助连接酶的主要功能是借助ATP或或NAD水水解提供的能量，催化双链解提供的能量

19、，催化双链DNA上的单链间隙上的单链间隙的的5-端与端与3-端生成磷酸二酯键，封闭端生成磷酸二酯键，封闭DNA双链上的缺口。双链上的缺口。这两条链必须是与同一条互补链配对结合的，这两条链必须是与同一条互补链配对结合的，而且必须是两条紧邻而且必须是两条紧邻DNA链才能被链才能被DNA连连接酶催化连接。接酶催化连接。NAD+或或ATP将其腺苷酰将其腺苷酰基转移到基转移到DNA连接酶的连接酶的一个赖氨酸残基的一个赖氨酸残基的-氨氨基上。基上。酶酶-腺苷酸中间物上的腺腺苷酸中间物上的腺苷酰基转移到苷酰基转移到DNA的的5-磷酸基端。磷酸基端。被激活的被激活的5-磷酰基端和磷酰基端和DNA的的3-OH端

20、生成磷端生成磷酸二酯键酸二酯键。 螺旋酶螺旋酶(Helicase)DNA复制时，螺旋酶可以促使复制时，螺旋酶可以促使DNA在复制叉处打开双链在复制叉处打开双链DNA。螺旋酶可以和单链螺旋酶可以和单链DNA结合，结合，利用利用ATP的能量沿的能量沿DNA链向链向前运动促使前运动促使DNA双链打开。双链打开。单链单链DNA结合蛋白结合蛋白(SSB)螺旋酶沿复制叉方向推进产生了一段单链区，螺旋酶沿复制叉方向推进产生了一段单链区，细胞内大量的单链细胞内大量的单链DNA结合蛋白结合蛋白(single strand DNA binding protein SSB)能和单链能和单链DNA结合，防止其重新配对

21、形成双链结合，防止其重新配对形成双链DNA或或被核酸酶降解。被核酸酶降解。SSB与螺旋酶不同，它不具备酶的活性。在大与螺旋酶不同，它不具备酶的活性。在大肠杆菌细胞中主要肠杆菌细胞中主要SSB是是177肽所组成的四聚肽所组成的四聚体，可以和单链体，可以和单链DNA上相邻的上相邻的32个核苷酸结个核苷酸结合。合。一个一个SSB四聚体结合于单链四聚体结合于单链DNA上可以促进其上可以促进其他他SSB四聚体现相邻的单链四聚体现相邻的单链DNA结合，出现结合，出现协同结合协同结合(cooperative binding)，SSB结合到结合到单链单链DNA上后，使其呈伸展状态，有利于单上后，使其呈伸展状态

22、，有利于单链链DNA作为模板。作为模板。SSB可以可以重复使用，重复使用，当新生的当新生的DNA链合链合成到某一成到某一位置时，位置时，该处的该处的SSB便会便会脱落，并脱落，并被重复利被重复利用。用。DNA拓扑异构酶拓扑异构酶(DNA Topisomerase)DNA在细胞内以超螺旋状态存在，在细胞内以超螺旋状态存在，DNA拓扑酶拓扑酶催化同一催化同一DNA分子不同超螺旋状态之间的转分子不同超螺旋状态之间的转变。变。拓扑异构酶拓扑异构酶大肠杆菌大肠杆菌的的蛋白蛋白(MW-110000) ，作用是暂时，作用是暂时切断一条切断一条DNA链，形成酶链，形成酶-DNA共价中间物共价中间物而使超螺旋而

23、使超螺旋DNA松弛，然后再将切断的单链松弛，然后再将切断的单链DNA连接起来。连接起来。拓扑异构酶拓扑异构酶大肠杆菌中的大肠杆菌中的DNA旋转酶旋转酶(DNA gyrase)，能将，能将负超螺旋引入负超螺旋引入DNA分子，在分子，在ATP供能时酶能供能时酶能暂时性地切断和重新连接双链暂时性地切断和重新连接双链DNA。几乎所有天然状态的双链几乎所有天然状态的双链DNA均以负超螺旋的均以负超螺旋的方式存在，特别是进行半保留复制的方式存在，特别是进行半保留复制的DNA均均以种种拓扑异构体的形式存在。以种种拓扑异构体的形式存在。负超螺旋是负超螺旋是DNA复制的必需条件，负超螺旋可复制的必需条件，负超螺

24、旋可使使DNA双链碱基对打开所需要的能量降低双链碱基对打开所需要的能量降低4.1KJ/mol，因而，有利于，因而，有利于DNA的双链分开。的双链分开。12.1.1.3 DNA复制过程的顺序性复制过程的顺序性复制起点复制起点DNA复制从分子上特定位置（原点）开始，此复制从分子上特定位置（原点）开始，此位置称复制起点位置称复制起点(Origin of replication，ori)。 复制方向复制方向复制时，复制时，DNA双螺旋一边双螺旋一边解链一边合成新链。解链一边合成新链。大多数大多数DNA的复制是双向的复制是双向的。的。D N A 正 在 复 制 的 分 叉 部 位 称 为 复 制 叉正

25、在 复 制 的 分 叉 部 位 称 为 复 制 叉（replication fork）正在复制的部分在电镜下象只眼睛称复制眼正在复制的部分在电镜下象只眼睛称复制眼（泡）（泡）复制子复制子DNA复制从起点开始双向进行直到终点为止。复制从起点开始双向进行直到终点为止。含有一个复制原点并能在细胞中自主复制的含有一个复制原点并能在细胞中自主复制的DNA分子称为复制子或复制单元分子称为复制子或复制单元(replicon)。原核生物中，每个原核生物中，每个DNA分子上只有一个复制分子上只有一个复制子；子；真核生物中，每个真核生物中，每个DNA分子有多个复制子，分子有多个复制子，每个复制子长约每个复制子长约

26、50-200kb；其；其DNA复制是由复制是由多个复制子共同完成的。多个复制子共同完成的。复制起点的特性复制起点的特性DNA复制不是随机的从复制不是随机的从DNA分子上的任何一分子上的任何一点起始，而是从特定的区域开始。点起始，而是从特定的区域开始。复制起点几乎都是复制起点几乎都是富含富含A-T的序列；的序列；将一个复制起点连将一个复制起点连接到任一接到任一DNA上，上，都能支持其复制。都能支持其复制。已经分离出大肠杆菌染色体已经分离出大肠杆菌染色体DNA复制起点复制起点oriC。它由。它由245bp的的DNA片段组成，其核苷片段组成，其核苷酸序列已经搞清。酸序列已经搞清。很多细菌的很多细菌的

27、ori区在结构上相似，在核苷酸序区在结构上相似，在核苷酸序列上有相当的保守性，而且在分类关系上愈列上有相当的保守性，而且在分类关系上愈是接近的细菌之间其同源性愈高，这些反映是接近的细菌之间其同源性愈高，这些反映了了DNA复制起点的重要性。复制起点的重要性。12.1.1.4 原核生物的原核生物的DNA复制复制DNA复制的起始复制的起始尽管原核生物是较简单的单细胞生物体，但复尽管原核生物是较简单的单细胞生物体，但复制过程也很复杂，并且是一个顺序性过程，制过程也很复杂，并且是一个顺序性过程，涉及到多种酶和蛋白因子，是这些酶和蛋白涉及到多种酶和蛋白因子，是这些酶和蛋白因子协同作用的结果。因子协同作用的

28、结果。DNA复制的引发复制的引发起始识别起始识别解链解链 解旋解旋 引发体组装。引发体组装。大肠杆菌的复大肠杆菌的复制起始点制起始点(oriC)位于其基因组位于其基因组天冬酰胺合成天冬酰胺合成酶和酶和ATP合成合成酶操纵子间酶操纵子间， oriC包含包含245bp。oriC的结构为：的结构为：含有两个系列的重复单位，其中有含有两个系列的重复单位，其中有3个个13bp重重复序列和复序列和4个个9bp重复序列，均富重复序列，均富含含AT。此序列在所有细菌复制起始位点中都是保守此序列在所有细菌复制起始位点中都是保守的。的。DnaA蛋白识别起始序列并蛋白识别起始序列并结合于结合于oriC的的9bp重复

29、序重复序列，形成复合物：列，形成复合物：2040个个DnaA蛋白与蛋白与OriC中中的的4个个9bp重复区结合；重复区结合；DnaA蛋白识别蛋白识别3个个13bp串串联重复序列使联重复序列使DNA熔链熔链形成开放复合物；形成开放复合物；DnaB和和DnaC（引发体成员）蛋白进入熔链区。（引发体成员）蛋白进入熔链区。SSB结合在被解开的单链上，由结合在被解开的单链上，由n、n、n”、i蛋白、蛋白、dnaB蛋白和蛋白和dnaC蛋白等蛋白等6种蛋白质组种蛋白质组成引发前体成引发前体(preprimosome)。引发前体进一步与引物酶引发前体进一步与引物酶(primase)组装成引组装成引发体发体(p

30、rimosome)。引发体可在单链引发体可在单链DNA上移动，在上移动，在dnaB亚基的亚基的作用下识别作用下识别DNA复制起点位置。复制起点位置。引发体先在前导链上由引物酶催化合成引发体先在前导链上由引物酶催化合成RNA引引物，此过程称为转录激活物，此过程称为转录激活(transcriptional activation)；然后在滞后链上沿然后在滞后链上沿53方向相对移动，在一方向相对移动，在一定距离上反复合成定距离上反复合成RNA引物，供引物，供DNA聚合酶聚合酶合成冈崎片段使用。合成冈崎片段使用。 SSB和旋转酶也参与和旋转酶也参与了这一过程。了这一过程。许多因子协同作用才使引发体在滞后

31、链上移动，许多因子协同作用才使引发体在滞后链上移动，识别合适的引物合成位置，并将核苷酸在引识别合适的引物合成位置，并将核苷酸在引发位置上聚合成发位置上聚合成RNA引物。引物。在同一种生物体细胞中这些引物都具有相似的在同一种生物体细胞中这些引物都具有相似的序列，表明引物酶要在序列，表明引物酶要在DNA滞后链模板上比滞后链模板上比较特定的位置较特定的位置(序列序列)上才能合成上才能合成RNA引物。引物。 RNA引物形成后，引物形成后，DNA pol 的亚基组装成的亚基组装成非对称非对称DNA聚合酶聚合酶二聚体，它催化将第一二聚体，它催化将第一个脱氧核苷酸按碱基互补原则加在个脱氧核苷酸按碱基互补原则

32、加在RNA引物引物3-OH端而进入端而进入DNA链的延伸阶段。链的延伸阶段。DNA链的延伸链的延伸正超螺旋的消除正超螺旋的消除螺旋酶在复制叉处边移动边解开双链，螺旋酶在复制叉处边移动边解开双链，DNA聚聚合酶合酶催化催化DNA新生链的合成。新生链的合成。DNA解链时必产生正超螺旋，当达到一定程度解链时必产生正超螺旋，当达到一定程度后就会造成复制叉难以继续前进而终止后就会造成复制叉难以继续前进而终止DNA复制。而细胞内复制。而细胞内DNA复制不会因出现拓扑学复制不会因出现拓扑学问题而停止问题而停止。解除正超螺旋的机制解除正超螺旋的机制DNA在生物细胞中本身就是负超螺旋，当在生物细胞中本身就是负超

33、螺旋，当DNA解链而产生正超螺旋时，可以被原来存解链而产生正超螺旋时，可以被原来存在的负超螺旋所中和在的负超螺旋所中和;DNA拓扑异构酶拓扑异构酶可打开一条链，使正超螺旋可打开一条链，使正超螺旋状态转变成松弛状态；同时状态转变成松弛状态；同时DNA拓扑异构酶拓扑异构酶(旋转酶旋转酶)也可以在复制叉前方地将负超螺也可以在复制叉前方地将负超螺旋引入双链旋引入双链DNA。DNA链的延伸链的延伸前导链和滞后链的合成。由前导链和滞后链的合成。由DNA helicase解开解开双螺旋，由拓朴异构酶消除双螺旋，由拓朴异构酶消除DNA链上的扭曲链上的扭曲力，力，SSB结合使结合使DNA单链稳定。单链稳定。前导

34、链的合成：由前导链的合成：由DnaG（primase）在复制起）在复制起始位点附近合成一个始位点附近合成一个1060 nt的的RNA引物，引物，然后由然后由polII把把dNTP加到该引物上。加到该引物上。滞后链的合成：产生滞后链的合成：产生Okazaki fragments，消除，消除RNA引物并由引物并由DNA pol I补上一小段补上一小段DNA序序列，由列，由DNA Ligase把两个片段相连。把两个片段相连。在在DNA复制叉处由一个非对称复制叉处由一个非对称DNA聚合酶聚合酶二聚体在同一时间分别进行复制二聚体在同一时间分别进行复制DNA前导链前导链和滞后链。和滞后链。在复制叉附近，由

35、在复制叉附近，由DNA聚合酶聚合酶二聚体、引二聚体、引发体和发体和DnaB等构成的类似核糖体大小的复等构成的类似核糖体大小的复合体，称为合体，称为DNA复制体复制体(replisome)。复制体在复制体在DNA前导链模板和滞后链模板上移前导链模板和滞后链模板上移动时便合成了连续的动时便合成了连续的DNA前导链和由许多冈前导链和由许多冈崎片段组成的滞后链。崎片段组成的滞后链。如果滞后链模板环绕如果滞后链模板环绕DNA聚合酶聚合酶全酶，并全酶，并通过通过DNA聚合酶聚合酶，然后再折向与未解链的，然后再折向与未解链的双链双链DNA在同一方向上，则滞后链的合成可在同一方向上，则滞后链的合成可以和前导链

36、的合成在同一方向上进行。以和前导链的合成在同一方向上进行。DNA聚合酶聚合酶沿着沿着滞后链模板催化滞后链模板催化在在RNA引物上聚引物上聚合合DNA链。链。当合成的当合成的DNA链到链到达前一次合成的达前一次合成的冈崎片段的位置冈崎片段的位置时，滞后链模板时，滞后链模板及新合成的冈崎及新合成的冈崎片段便从片段便从DNA聚聚合酶合酶上释放出上释放出来。来。由于复制叉的不断迁移，便产生了又一段单链由于复制叉的不断迁移，便产生了又一段单链的滞后链模板，它重新环绕的滞后链模板，它重新环绕DNA聚合酶聚合酶全全酶，并通过酶，并通过DNA聚合酶聚合酶开始合成新的滞后开始合成新的滞后链冈崎片段。链冈崎片段。

37、因此，前导链的合成不会超过滞后链太多。而因此，前导链的合成不会超过滞后链太多。而且，这样引发体在且，这样引发体在DNA链上和链上和DNA聚合酶聚合酶以同一速度移动。以同一速度移动。当冈崎片段形成后当冈崎片段形成后，DNA pol通过其通过其53外外切酶活性切除冈崎片段上的切酶活性切除冈崎片段上的RNA引物；同时，引物；同时，利用后一个冈崎片段作为引物合成利用后一个冈崎片段作为引物合成DNA。最后的缺口由最后的缺口由DNA连接酶连接形成完整的滞后连接酶连接形成完整的滞后链。链。DNA复制的终止复制的终止DNA复制的终点复制的终点在在DNA上存在着复制终止位点，某些蛋白因子上存在着复制终止位点，某

38、些蛋白因子可识别终止位点的序列，使可识别终止位点的序列，使DNA复制在终止复制在终止位点终止。位点终止。E.coli的的DNA复制终点序列：复制终点序列：AATTAGTATGTTGTAACTAAAGTTTAATCATACAACATTGATTTCA大肠杆菌的两个复制叉在相距终点大肠杆菌的两个复制叉在相距终点100kb时，时，复制速度减慢，从而协调复制速度减慢，从而协调2个复制叉到达的时个复制叉到达的时间。间。DNA复制的真实性复制的真实性DNA聚合酶的校对作用聚合酶的校对作用大肠杆菌中，每复制大肠杆菌中，每复制109-1010个核苷酸便要出个核苷酸便要出现一个误差。由于大肠杆菌染色体中有现一个误

39、差。由于大肠杆菌染色体中有4.5106碱基对，这样每碱基对，这样每1000个细胞经过一个细胞经过一次分裂会插入一个不正常的核苷酸。次分裂会插入一个不正常的核苷酸。单纯以碱基对原则来维持其单纯以碱基对原则来维持其DNA复制准确性复制准确性时么误差出现的频率为时么误差出现的频率为10-410-5。DNA聚合酶具有校对作用，可以将不正确插入聚合酶具有校对作用，可以将不正确插入的核苷酸切除掉，重新加上正确的核苷酸。的核苷酸切除掉，重新加上正确的核苷酸。每个核苷酸的掺入就有两次被选择机会，首先每个核苷酸的掺入就有两次被选择机会，首先按碱基配对原则，错误核苷酸掺入的机率为按碱基配对原则，错误核苷酸掺入的机

40、率为10-410-5，然后，然后，DNA聚合酶本身的校对作聚合酶本身的校对作用又可使错误核苷酸掺入的机率为用又可使错误核苷酸掺入的机率为10-410-5。这样，每掺入一个核苷酸，发生错误的机会只这样，每掺入一个核苷酸，发生错误的机会只有有10-810-10。12.1.1.5 真核生物的真核生物的DNA复制复制一般选用结构简单的真核生物如：酵母、四膜一般选用结构简单的真核生物如：酵母、四膜虫以及真核病毒为材料。真核病毒虫以及真核病毒为材料。真核病毒DNA复制复制机制与真核染色体机制与真核染色体DNA复制相同。复制相同。真核生物的复制子真核生物的复制子多复制起点多复制起点真核和原核生物真核和原核生

41、物DNA复制的基本特征是相同复制的基本特征是相同的，但真核的，但真核DNA比原核远比比原核远比DNA大，并且大，并且大多数真核生物是由多细胞组成的，因此在大多数真核生物是由多细胞组成的，因此在其其DNA复制的上有所不同。复制的上有所不同。真核生物的每一个染色体皆含有许多个复制子真核生物的每一个染色体皆含有许多个复制子(replicon)。复制叉前进的速度大约只有大肠。复制叉前进的速度大约只有大肠杆菌的十分之一。杆菌的十分之一。可能原因是真核生物的可能原因是真核生物的DNA与组蛋白构成核小与组蛋白构成核小体，对复制叉的前进造成阻碍。体，对复制叉的前进造成阻碍。人类的复制叉每秒约前进人类的复制叉每

42、秒约前进100bp；复制整个基；复制整个基因体需因体需8h。果蝇的复制整个基因体仅需果蝇的复制整个基因体仅需34min。复制原点的特征复制原点的特征酵母菌的复制起点称为酵母菌的复制起点称为ARS(autonomously replicating sequence)，有，有100多个多个bp。ARS由由2个功能域组成：个功能域组成：A功能域为功能域为ARS的中心，的中心，可能是起始蛋白的结合位点。可能是起始蛋白的结合位点。A的序列为的序列为(T/A)AAATA(T/C)AAA(T/A)；真核生物真核生物Yeast约有约有400个自主性复制序列个自主性复制序列（ARS）分布于）分布于17条染色体中

43、。每一个复制条染色体中。每一个复制子长约子长约36kb。真核生物真核生物DNA的各个区域不是全部同时复制的，的各个区域不是全部同时复制的，一般是一般是2080个相邻复制子一次被活化，个相邻复制子一次被活化，S期期中不断有新的复制子被活化，直至整个染色中不断有新的复制子被活化，直至整个染色体完全复制。体完全复制。DNA复制后立即与组蛋白八聚体结合（全保留复制后立即与组蛋白八聚体结合（全保留方式）形成染色质。方式）形成染色质。真核生物的真核生物的DNA聚合酶和蛋白因子聚合酶和蛋白因子真核生物中的真核生物中的DNA聚合酶与大肠杆菌的聚合酶聚合酶与大肠杆菌的聚合酶相似，但都没有外切酶活性。相似，但都没

44、有外切酶活性。其聚合反应机制与原核生物的聚合一样。其聚合反应机制与原核生物的聚合一样。DNA聚合酶聚合酶 (占总量的占总量的80-90%)，MW为为300KD，含有，含有4个或个或5个亚基，主要负责染色个亚基，主要负责染色体体DNA的复制。的复制。DNA聚合酶聚合酶，MW为为45KD，有一条链，主要，有一条链，主要作用是修复作用是修复。聚合酶聚合酶，MW为为140KD，存在于线粒体内，催，存在于线粒体内，催化线粒体化线粒体DNA的复制。的复制。复制因子蛋白复制因子蛋白RFA、RFC：RFA为真核单链为真核单链DNA结合蛋白；结合蛋白；RFC是促进活性复制复合物组装的蛋白。是促进活性复制复合物组

45、装的蛋白。端粒复制端粒复制DNA复制时，线性复制时，线性DNA分子以分子以53为模板的为模板的滞后链的合成，末端的滞后链的合成，末端的RNA引物被切除后是引物被切除后是无法被无法被DNA聚合酶所填充的。聚合酶所填充的。真核生物的染色体的末端序列称端粒真核生物的染色体的末端序列称端粒(telomere)，端粒有两种功能：端粒有两种功能：维持染色体的完整性。若无端粒，两个染色维持染色体的完整性。若无端粒，两个染色体末端很可能融合一起。体末端很可能融合一起。解决末端复制问题。端粒酶能与端粒作用，解决末端复制问题。端粒酶能与端粒作用，延伸其长度。延伸其长度。端粒酶包含一段与端粒序列互补的端粒酶包含一段

46、与端粒序列互补的RNA，能以，能以此此RNA做为模板朝做为模板朝5至至3的方向延伸端粒。的方向延伸端粒。然后引发酶及然后引发酶及DNA聚合酶再依照合成落后股的聚合酶再依照合成落后股的方式由方式由5至至3的方向延伸另一股。虽然落后的方向延伸另一股。虽然落后股仍然比模板股短，但整个股仍然比模板股短，但整个DNA已被加长。已被加长。这样就可以避免其这样就可以避免其DNA随着复制的不断进行而随着复制的不断进行而逐渐变短。逐渐变短。在人类的在人类的DNA里，端粒长约里，端粒长约10至至15kb，由重复，由重复的的GGGTTA组成。在其他生物，重复的序列组成。在其他生物，重复的序列也大部分是也大部分是T和

47、和G。端粒酶与老化端粒酶与老化1986年，年，HowardCooke首先注意到端粒的长首先注意到端粒的长度在体细胞内比在生殖细胞内短。度在体细胞内比在生殖细胞内短。进一步的研究发现，端粒酶在生殖细胞内经进一步的研究发现，端粒酶在生殖细胞内经常被表现出来，所以端粒的长度一直保持在常被表现出来，所以端粒的长度一直保持在15kb左右。左右。大多数体细胞不制造端粒酶，每次分裂后端粒大多数体细胞不制造端粒酶，每次分裂后端粒就变短（大约就变短（大约100bp）。）。当端粒比正常的长度短数千个碱基对，细胞就当端粒比正常的长度短数千个碱基对，细胞就不再分裂。所以端粒变短是一种老化的象徵。不再分裂。所以端粒变短

48、是一种老化的象徵。有实验证明，将端粒酶加进体细胞，可以增有实验证明，将端粒酶加进体细胞，可以增加体细胞分裂的次数。加体细胞分裂的次数。癌细胞的主要特性是能够无限期的分裂增生，癌细胞的主要特性是能够无限期的分裂增生，这需要不断表现端粒酶。实验的确发现，癌这需要不断表现端粒酶。实验的确发现，癌细胞的端粒酶活性很强。这点可以被用来检细胞的端粒酶活性很强。这点可以被用来检验癌细胞。验癌细胞。端粒酶亦可能被用於肌肉萎缩症端粒酶亦可能被用於肌肉萎缩症(muscular dystrophy)。它是由於。它是由於dystrophin基因突变基因突变所引起，使肌肉细胞很快就退化。虽然肌肉所引起，使肌肉细胞很快就

49、退化。虽然肌肉细胞细胞(stem cells)能分裂增生新的细胞来取代能分裂增生新的细胞来取代受损细胞，但经过多次分裂后，端粒变短，受损细胞，但经过多次分裂后，端粒变短，就无法再增生。就无法再增生。若将端粒酶引入细胞，应可能加强增生的潜力，若将端粒酶引入细胞，应可能加强增生的潜力，延缓肌肉萎缩的速度。同样的道理，端粒酶延缓肌肉萎缩的速度。同样的道理，端粒酶可以被应用到与老化相关的疾病可以被应用到与老化相关的疾病。12.1.2 反转录作用反转录作用(reverse transcription)1970年年Temin等在致癌等在致癌RNA病毒中发现了一种病毒中发现了一种特殊的特殊的DNA聚合酶，该

50、酶以聚合酶，该酶以RNA为模板，根为模板，根据碱基配对原则，按照据碱基配对原则，按照RNA的核苷酸顺序的核苷酸顺序(其中其中U与与A配对配对)合成合成DNA。这一过程与一般。这一过程与一般遗传信息流转录的方向相反，故称为反转录，遗传信息流转录的方向相反，故称为反转录，催化此过程的催化此过程的DNA聚合酶叫做反转录酶聚合酶叫做反转录酶(reverse transcriptase)。反转录酶不仅普遍存在于反转录酶不仅普遍存在于RNA病毒中，哺乳动病毒中，哺乳动物的胚胎细胞和正在分裂的淋巴细胞中也有物的胚胎细胞和正在分裂的淋巴细胞中也有反转录酶。反转录酶。 反转录酶是以反转录酶是以dNTP为底物，以

51、为底物，以RNA为模板，为模板，tRNA(主要是色氨酸主要是色氨酸tRNA)为引物，在为引物，在tRNA3末端上，按末端上，按53方向合成一条与方向合成一条与RNA模板互补的模板互补的DNA单链，称为互补单链，称为互补DNA(complementary DNA, cDNA)，它与，它与RNA模板形成模板形成RNA-DNA杂交体。随后又在杂交体。随后又在反转录酶的作用下，水解掉反转录酶的作用下，水解掉RNA链，再以链，再以cDNA为模板合成第二条为模板合成第二条DNA链。链。携带反转录酶的病毒又称为反转录病毒，它侵携带反转录酶的病毒又称为反转录病毒，它侵入宿主细胞后先以病毒入宿主细胞后先以病毒R

52、NA为模板靠反转录为模板靠反转录酶催化合成酶催化合成DNA，随后这种，随后这种DNA环化并整合环化并整合到宿主细胞的染色体到宿主细胞的染色体DNA中去，以原病毒中去，以原病毒(provirus)的形式在宿主细胞中一代代传递下的形式在宿主细胞中一代代传递下去。去。许多反转录病毒基因组中都含有癌基因，如果许多反转录病毒基因组中都含有癌基因，如果由于某种因素激活了癌基因就可使宿主细胞由于某种因素激活了癌基因就可使宿主细胞转化为癌细胞。转化为癌细胞。 大多数反转录酶都具有多种酶活性：大多数反转录酶都具有多种酶活性：DNA聚合酶活性；以聚合酶活性；以RNA为模板，催化为模板，催化dNTP聚合成聚合成DN

53、A的过程。此酶需要的过程。此酶需要RNA为为引物，多为色氨酸的引物，多为色氨酸的tRNA，在引物，在引物tRNA3-末端以末端以53方向合成方向合成DNA。反转录酶中不。反转录酶中不具有具有35外切酶活性，因此没有校正功能，外切酶活性，因此没有校正功能，所以由反转录酶催化合成的所以由反转录酶催化合成的DNA出错率比较出错率比较高。高。RNase H活性；由反转录酶催化合成的活性；由反转录酶催化合成的cDNA与模板与模板RNA形成的杂交分子，将由形成的杂交分子，将由RNase H从从RNA5端水解掉端水解掉RNA分子。分子。 DNA指导的指导的DNA聚合酶活性；以反转录合聚合酶活性；以反转录合成

54、的第一条成的第一条DNA单链为模板，以单链为模板，以dNTP为底为底物，再合成第二条物，再合成第二条DNA分子。分子。有些反转录酶还有有些反转录酶还有DNA内切酶活性，这可能内切酶活性，这可能与病毒基因整合到宿主细胞染色体与病毒基因整合到宿主细胞染色体DNA中中有关。有关。反转录酶的发现对于遗传工程技术起了很大的反转录酶的发现对于遗传工程技术起了很大的推动作用，它已成为一种重要的工具酶。用推动作用，它已成为一种重要的工具酶。用组织细胞提取组织细胞提取mRNA并以它为模板，在反转并以它为模板，在反转录酶的作用下，合成出互补的录酶的作用下，合成出互补的DNA(cDNA)，由此可构建出由此可构建出c

55、DNA文库文库(cDNA library)，从，从中筛选特异的目的基因，是基因工程技术中中筛选特异的目的基因，是基因工程技术中最常用的获得目的基因的方法。最常用的获得目的基因的方法。 12.1.3 DNA的损伤、修复与突变的损伤、修复与突变DNA存储着生物体赖以生存和繁衍的遗传信息，存储着生物体赖以生存和繁衍的遗传信息，因此维护因此维护DNA分子的完整性对细胞至关重要。分子的完整性对细胞至关重要。外界环境和生物体内部的因素都经常会导致外界环境和生物体内部的因素都经常会导致DNA分子的损伤或改变，而且与分子的损伤或改变，而且与RNA及蛋白及蛋白质可以在胞内大量合成不同，在一个原核细质可以在胞内大

56、量合成不同，在一个原核细胞中只有一份胞中只有一份DNA，在真核二倍体细胞中相，在真核二倍体细胞中相同的同的DNA也只有一对，如果也只有一对，如果DNA的损伤或遗的损伤或遗传信息的改变不能更正，对体细胞就可能影传信息的改变不能更正，对体细胞就可能影响其功能或生存，对生殖细胞则可能影响到响其功能或生存，对生殖细胞则可能影响到后代。后代。在进化过程中生物细胞所获得的修复在进化过程中生物细胞所获得的修复DNA损伤损伤的能力就显得十分重要，也是生物能保持遗的能力就显得十分重要，也是生物能保持遗传稳定性之所在。传稳定性之所在。在细胞中能进行修复的生物大分子也就只有在细胞中能进行修复的生物大分子也就只有DN

57、A，反映了，反映了DNA对生命的重要性。另一方对生命的重要性。另一方面，在生物进化中突变又是与遗传相对立统面，在生物进化中突变又是与遗传相对立统一而普遍存在的现象，一而普遍存在的现象，DNA分子的变化并不分子的变化并不是全部都能被修复成原样的，正因为如此生是全部都能被修复成原样的，正因为如此生物才会有变异、有进化。物才会有变异、有进化。 12.1.3.1 DNA的损伤的损伤DNA分子的自发性损伤分子的自发性损伤DNA复制中的错误复制中的错误以以DNA为模板按碱基配对进行为模板按碱基配对进行DNA复制是严复制是严格而精确的，但也不是完全不发生错误的。格而精确的，但也不是完全不发生错误的。碱基配对

58、的错误频率约为碱基配对的错误频率约为10-110-2，在，在DNA复复制酶的作用下碱基错误配对频率降到约制酶的作用下碱基错误配对频率降到约10-510-6，复制过程中如有错误的核苷酸参入，复制过程中如有错误的核苷酸参入，DNA聚合酶还会暂停催化作用，以聚合酶还会暂停催化作用，以35外外切核酸酶的活性切除错误接上的核苷酸，然切核酸酶的活性切除错误接上的核苷酸，然后再继续复制，是对后再继续复制，是对DNA复制错误的修复形复制错误的修复形式，保证复制的准确性。但校正后的错配率式，保证复制的准确性。但校正后的错配率仍有仍有10-10左右。左右。 DNA的自发性化学变化的自发性化学变化生物体内生物体内D

59、NA分子可以由于各种原因发生变：分子可以由于各种原因发生变：a.碱基的异构互变碱基的异构互变4种碱基各自的异构体间都可自发地互变（烯种碱基各自的异构体间都可自发地互变（烯醇式与酮式间的互变），这会使碱基间发生醇式与酮式间的互变），这会使碱基间发生错配，可使错配，可使A-C、T-G等。如果这些配对发等。如果这些配对发生在生在DNA复制时，就会造成子代复制时，就会造成子代DNA序列与序列与亲代亲代DNA不同的错误性损伤。不同的错误性损伤。b.碱基的脱氨基作用碱基的脱氨基作用碱基的环外碱基的环外-NH2有时会自发脱落，从而有时会自发脱落，从而C会变会变成成U、A会变成次黄嘌呤（会变成次黄嘌呤（H）、

60、鸟嘌呤会变）、鸟嘌呤会变成黄嘌呤（成黄嘌呤（X）等，）等，DNA复制时，复制时，U-A、H-X、H-C配对，导致子代配对，导致子代DNA序列错误。序列错误。遇到复制时，遇到复制时，U与与A配对、配对、H和和X都与都与C配对就配对就会导致子代会导致子代DNA序列的错误变化。胞嘧啶自序列的错误变化。胞嘧啶自发脱氨基的频率约为每个细胞每天发脱氨基的频率约为每个细胞每天190个。个。c.脱嘌呤与脱嘧啶脱嘌呤与脱嘧啶热和酸等都可使嘌呤和嘧啶从热和酸等都可使嘌呤和嘧啶从DNA链的核糖磷链的核糖磷酸骨架上脱落，形成酸骨架上脱落，形成AP位点。位点。d.碱基修饰与链断裂碱基修饰与链断裂细胞呼吸的副产物细胞呼吸