上海交通大学遗传学课件10目的基因的克隆

1、实验十、目的基因的克隆与鉴定实验十、目的基因的克隆与鉴定一、实验目的一、实验目的 掌握目的基因片段连接、质粒转化、菌落培养掌握目的基因片段连接、质粒转化、菌落培养鉴定方法。鉴定方法。 为基因测序和其它研究和应用准备高质量的基为基因测序和其它研究和应用准备高质量的基因片段因片段。连接连接:回收目的基因片段同克隆载体连接回收目的基因片段同克隆载体连接转化转化:将重组载体导入细菌将重组载体导入细菌筛选筛选:通过抗性基因和显色反应选择重组载体通过抗性基因和显色反应选择重组载体回收回收:在细菌中大量繁殖重组载体并回收在细菌中大量繁殖重组载体并回收鉴定鉴定:菌落和重组载体是否含目的基因片段菌落和重组载体是

2、否含目的基因片段实验流程实验流程二、实验原理二、实验原理1 1、连接、连接 Taq酶能够在酶能够在PCR产物的产物的3 末端加上一个非模板依赖的末端加上一个非模板依赖的A； T载体是一种带有载体是一种带有3 T突出端的载体；突出端的载体； 在连接酶作用下，可以快速地、一步到位地把在连接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR产物直接插入产物直接插入到质粒载体的多克隆位点（到质粒载体的多克隆位点（MCS）中。）中。高效克隆高效克隆PCR产物（产物（TA Cloning）的专用载体）的专用载体2 2、转化、转化细胞经过一些特殊方法如电击法细胞经过一些特殊方法如电击法, 化学试剂法（化学试剂法（Ca

3、Cl2)等的处理后等的处理后,细胞膜细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA 分子进入的分子进入的感受态细胞感受态细胞。3 3、鉴定、鉴定- -互补互补质粒载体质粒载体带有一个大肠杆菌的带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有的短区段，其中有-半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（lacZ）的）的调控序列和前调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到-半乳糖苷酶的

4、氨基端半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能。而不影响功能。宿主细胞宿主细胞存在可编码存在可编码-半乳糖苷酶半乳糖苷酶C端部分的序列。端部分的序列。它们同时存在时，能恢复它们同时存在时，能恢复lacZ酶的活性，称为酶的活性，称为-互补。互补。在诱导剂在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生存在时产生蓝色菌落蓝色菌落，因而易于识别。，因而易于识别。当外源当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无-互补能力的氨基互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落白色菌落

5、。三、实验材料三、实验材料1 连接连接： 基因：菠菜基因：菠菜 actin基因的部分序列（纯化的基因的部分序列（纯化的PCR产物）产物） 载体：载体：pMD18-T载体。（载体。（Takara试剂盒）试剂盒）2 转化转化 重组质粒（上步结果）重组质粒（上步结果） 感受态细胞感受态细胞DH5（天根生物）（天根生物） 液体液体SOC培养基（或培养基（或LB培养基）培养基）3 鉴定鉴定 LB固体培养基（固体培养基（IPTG, X-Gal,氨苄）氨苄） 四、实验步骤四、实验步骤1 连接连接： pMD18-T载体（载体（Takara试剂盒）试剂盒）pMD18-T Vector 1ulDNA 4ulSol

6、ution I 5ul 10ul u 加样加样u 16 30min30min2 转化转化: u 全量全量(10ul) 加入加入50ul感受态细胞中，冰上放置感受态细胞中，冰上放置30minu 42 9090秒，冰上放置秒，冰上放置2 2minu 加入加入400ulLB培养基，培养基，37 震荡培养震荡培养6060min3 培养鉴定培养鉴定: u 4000转，离心转，离心1min，取，取200ul上清丢弃，其余混匀。上清丢弃，其余混匀。u取取50ul涂板（涂板（ IPTG, X-Gal,氨苄），氨苄）， 37 10-1510-15小时小时u 观察，白色菌斑为重组型。观察，白色菌斑为重组型。注意事项注意事项感受态细