形态观察方法

1、第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法进行初步观察进行初步观察形成可验证的假说形成可验证的假说设计对照试验设计对照试验收集资料收集资料解释结果解释结果作出合理结论作出合理结论查阅已查阅已有知识有知识生物学研究模式生物生物学研究模式生物第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法v细胞形态结构的观察方法细胞形态结构的观察方法 光学显微镜技术光学显微镜技术 电子显微镜技术电子显微镜技术 扫描遂道显微镜扫描遂道显微镜v细胞组分的分析方法细胞组分的分析方法v细胞培养、细胞工程与显微操作技术细胞培养、细胞工程与显微操作技术一、光学显微镜技术一、光学显微镜技术light microsco

2、py 普通复式光学显微镜技术普通复式光学显微镜技术 荧光显微镜技术荧光显微镜技术 p53 激光共焦扫描显微镜技术激光共焦扫描显微镜技术 p53 相差显微镜相差显微镜 p51 微分干涉显微镜微分干涉显微镜 p51 录像增差显微镜技术录像增差显微镜技术 倒置显微镜倒置显微镜 暗视野显微镜暗视野显微镜 显微镜发展趋势显微镜发展趋势重要的光学技术参数重要的光学技术参数光镜样本制作光镜样本制作 采用组合方式，集普通光镜加相差、荧光、暗视野DIC、摄影装置于一体。自动化与电子化。电子显微镜电子显微镜的基本知识的基本知识主要电镜制样技术主要电镜制样技术扫描电镜扫描电镜二、二、电子显微镜技术电子显微镜技术 e

3、lectron microscopy电镜与光镜的比较电镜与光镜的比较电镜与光镜光路图比较电镜与光镜光路图比较电子显微镜的基本构造电子显微镜的基本构造 1940年，英国剑桥大学首先试制成功扫描电子显微镜。年，英国剑桥大学首先试制成功扫描电子显微镜。直到直到1965年，才有英国剑桥科学仪器有限公司生产出实用年，才有英国剑桥科学仪器有限公司生产出实用性强的商品扫描电镜。由于扫描电镜具有显著的优点性强的商品扫描电镜。由于扫描电镜具有显著的优点，广泛广泛应用于应用于生物学、医学、古生物学、地质学、化学、物理学、生物学、医学、古生物学、地质学、化学、物理学、电子学以及勘察、冶金，机械与轻工业等领域，电子学

4、以及勘察、冶金，机械与轻工业等领域，成为十分有成为十分有用的研究工具。用的研究工具。三、扫描遂道显微镜三、扫描遂道显微镜 （ scanning tunneling microscope ，STM）原理原理：量子力学中的隧道效应，量子力学中的隧道效应，原子间作用力、磁力、摩擦力等原子间作用力、磁力、摩擦力等装置：装置：扫描的压电陶瓷，逼近装置，电子学反馈控制系统和数据扫描的压电陶瓷，逼近装置，电子学反馈控制系统和数据 采集、处理、显示系统。采集、处理、显示系统。特点：特点：1 1、可对晶体或非晶体成像，无需复杂计算，分辨本领高、可对晶体或非晶体成像，无需复杂计算，分辨本领高 （侧分辨率为（侧分辨

5、率为0.10.10.2nm0.2nm，纵分辨率可达，纵分辨率可达0.001nm0.001nm） 2 2、可在真空、大气、液体等多种条件下进行、可在真空、大气、液体等多种条件下进行非破坏性非破坏性测量测量 3 3、可实时得到样品表面三维图象，可测量厚度信息、可实时得到样品表面三维图象，可测量厚度信息 4 4、可连续成像，进行动态观察、可连续成像，进行动态观察用途：用途：纳米生物学纳米生物学研究领域中的重要工具研究领域中的重要工具 荧光显微镜技术荧光显微镜技术（Fluorescence Microscopy）v原理与应用原理与应用直接荧光标记技术直接荧光标记技术间接免疫荧光标记技术间接免疫荧光标记

6、技术在光镜水平用于观察能激发出荧光的结构。在光镜水平用于观察能激发出荧光的结构。免疫免疫荧光观察、疾病诊断、特异蛋白质荧光观察、疾病诊断、特异蛋白质等生物大分子等生物大分子的定性定位：如绿色荧光蛋白的定性定位：如绿色荧光蛋白(GFP)的应用的应用 激光共焦扫描显微镜技术激光共焦扫描显微镜技术（Laser Confocal Microscopy） 原理原理 应用应用： 用激光作光源，用激光作光源，排除焦平面以外光的干扰，排除焦平面以外光的干扰，逐点、逐点、 逐行、逐面快速扫描，逐行、逐面快速扫描，增强图像反差增强图像反差。 能显示细胞样品的立体结构。能显示细胞样品的立体结构。 分辨力是普通光学显

7、微镜的分辨力是普通光学显微镜的3倍。倍。 用途类似荧光显微镜，能扫描不同层次，形成用途类似荧光显微镜，能扫描不同层次，形成 立体图像。立体图像。微分干涉显微镜微分干涉显微镜 （differential-interference microscope）偏振光经合成后，使样品中厚度上的微小区别转偏振光经合成后，使样品中厚度上的微小区别转化成明暗区别，增加了样品反差且具有立体感。化成明暗区别，增加了样品反差且具有立体感。适于适于研究活细胞中较大的细胞器研究活细胞中较大的细胞器录像增差显微镜技术录像增差显微镜技术 （video-enhance microscopy） 计算机辅助的微分干涉显微镜可在高分

8、辨率下计算机辅助的微分干涉显微镜可在高分辨率下 研究活细胞中的颗粒及细胞器的运动研究活细胞中的颗粒及细胞器的运动p51 电子显微镜与光学显微镜的基本区别电子显微镜与光学显微镜的基本区别光镜与电镜的主要区别光镜与电镜的主要区别（1）光源不同）光源不同 光镜为可见光或紫外线；电镜为电子束光镜为可见光或紫外线；电镜为电子束（2）透镜不同）透镜不同 光镜为玻璃；电镜为电磁透镜光镜为玻璃；电镜为电磁透镜（3）真空）真空 （4）显示记录系统）显示记录系统电镜与光镜光路图比较电镜与光镜光路图比较终像（眼或底片）终像（眼或底片）目镜目镜投影镜投影镜物镜物镜样品样品聚光镜聚光镜荧光屏成像荧光屏成像中间像中间像电

9、子显微镜的基本构造电子显微镜的基本构造主要电镜制样技术主要电镜制样技术超薄切片技术超薄切片技术 用于电镜观察的样本制备用于电镜观察的样本制备示意图示意图 负染色技术负染色技术（Negative staining）重金属盐对铺展在载网上重金属盐对铺展在载网上样品染色，干燥后衬托出样品的精细结构样品染色，干燥后衬托出样品的精细结构金属投影金属投影冰冻蚀刻技术冰冻蚀刻技术（Freeze etching） （技术示意图技术示意图） 冰冻断裂与蚀刻复型：主要用来观察冰冻断裂与蚀刻复型：主要用来观察膜断裂面的蛋白质膜断裂面的蛋白质颗粒和膜表面结构。颗粒和膜表面结构。 快速冷冻快速冷冻深度蚀刻技术深度蚀刻技

10、术（quick freeze deep etchingquick freeze deep etching）电镜三维重构技术电镜三维重构技术整装细胞电镜技术整装细胞电镜技术 是观察细胞骨架的处理技术。是观察细胞骨架的处理技术。扫描电镜扫描电镜（Scanning electron microscope，SEM）原理与应用原理与应用：电子电子“探针探针”扫描扫描，激发样品表面放出二次电子，探测，激发样品表面放出二次电子，探测器收集二次电子成象。器收集二次电子成象。特点特点：引起样品变形的表面张力问题引起样品变形的表面张力问题- CO 2临界点干燥法临界点干燥法 核酸大分子制样技术核酸大分子制样技术

11、电镜显微放射自显影电镜显微放射自显影 电镜整装细胞制片技术电镜整装细胞制片技术p63石石蜡蜡切切片片技技术术步骤：步骤： 基本构造：光学放大系统、照明系统、机械和支架系统基本构造：光学放大系统、照明系统、机械和支架系统 光学显微镜成像原理光学显微镜成像原理激发样本荧光激发样本荧光保护眼睛保护眼睛特点：特点：1 1、光源为紫外线，波长、光源为紫外线，波长 较短，分辨力高于普较短，分辨力高于普 通显微镜；通显微镜； 2 2、有两个特殊的滤光片；、有两个特殊的滤光片； 照明方式常为落射式。照明方式常为落射式。天然物质经天然物质经紫外线照射后紫外线照射后发荧光的物质发荧光的物质，如叶绿素能发如叶绿素能

12、发出血红色荧光。出血红色荧光。 激光作扫描光源激光作扫描光源 扫描焦平面上样品，得样品切面像扫描焦平面上样品，得样品切面像 载物台上微量步进马达使载物台载物台上微量步进马达使载物台 上下移动上下移动, ,改变焦平面改变焦平面 得不同层次的切面图像得不同层次的切面图像计算机图像三维重组获样品立体图像计算机图像三维重组获样品立体图像 显微显微CT 细胞内的各结构可因密度不同而产生细胞内的各结构可因密度不同而产生相位差相位差(即光程差即光程差)，不过人眼无法鉴别，不过人眼无法鉴别这种微小的变化。相差显微镜能够这种微小的变化。相差显微镜能够把透过标本的把透过标本的可见光的光程差或可见光的光程差或相位差

13、，变成振幅差，相位差，变成振幅差，提高了各种结构间的对比度，使各提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。种结构变得清晰可见。可用于可用于观察活细胞观察活细胞 。相差显微镜相差显微镜 （phase-contrast microscope）1.1. 环形光阑环形光阑(annular (annular diaphragm) diaphragm)：位于：位于 光源与聚光器之间。光源与聚光器之间。2. 2. 相位板相位板(annular (annular phaseplate) phaseplate)： 物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的直射光

14、或衍射光的相位推迟相位推迟1/41/4，将直射光与折射光分开。，将直射光与折射光分开。在构造上，特殊在构造上，特殊: :1953年诺贝尔物理奖年诺贝尔物理奖通过致密部分通过致密部分( (如细胞核如细胞核), ),速度慢速度慢通过疏松部位通过疏松部位( (如细胞质如细胞质), ),速度快速度快相位差相位差( (光程差光程差) )振幅差振幅差( (明暗差明暗差) )相差显微镜相差显微镜刀锋刀锋样品样品液态氟利昂液态氟利昂液氮液氮低温刀低温刀样品样品断裂示意图断裂示意图升华升华蚀刻蚀刻碳碳铂铂用金属和碳喷镀，消化样品用金属和碳喷镀，消化样品收集复型膜于载网收集复型膜于载网上，置电镜下观察上，置电镜下

15、观察快速冷冻快速冷冻低温断裂低温断裂蚀刻蚀刻复型复型 20世纪世纪60年代问世，用来观察标本表面结构。年代问世，用来观察标本表面结构。 分辨力为分辨力为610nm，由于人眼的分辨力（区别荧光屏上距离最，由于人眼的分辨力（区别荧光屏上距离最近两个光点的能力）为近两个光点的能力）为0.2mm，扫描电镜的有效放大倍率为扫描电镜的有效放大倍率为0.2mm/10nm=20000X。扫描电镜工作原理：扫描电镜工作原理： 电子枪电子枪电子束（电子束（20203030 m）第一、二聚光镜第一、二聚光镜物镜（汇聚作物镜（汇聚作用）用）电子探针（电子探针（几十埃）几十埃）在样品表面扫描，激发出多种电子信在样品表面

16、扫描，激发出多种电子信号（次级电子，电压信号）号（次级电子，电压信号）检测器（捕获信号，经放大、转换）检测器（捕获信号，经放大、转换）电压信号电压信号调制显象管亮度调制显象管亮度显示图像显示图像照相记录。照相记录。 为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷要喷涂上一层重金属膜，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。涂上一层重金属膜，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。原理：原理：扫描探针与样品扫描探针与样品接触或达到很近距离接触或达到很近距离时，即产生彼此间时，即产生彼此间相相互作用力互作用力，电流强度，电流强度与针尖和样品

17、间的距与针尖和样品间的距离有函数关系，离有函数关系，将扫将扫描过程中电流的变化描过程中电流的变化转换为图像转换为图像，从而反，从而反映出样品表面形貌信映出样品表面形貌信息、电特性或磁特性息、电特性或磁特性等。等。如量子力学中的隧道效应（隧道电流）、原子间作用如量子力学中的隧道效应（隧道电流）、原子间作用力、磁力、摩擦力等，力、磁力、摩擦力等， 电子显微术、电子衍射与计算机图象处理相结合而形成的具有重电子显微术、电子衍射与计算机图象处理相结合而形成的具有重要应用前景的一门新技术。要应用前景的一门新技术。电镜三维重构技术与电镜三维重构技术与X-X-射线晶体衍射技术及射线晶体衍射技术及核磁共振分析技

18、术相结合，是当前核磁共振分析技术相结合，是当前结构生物学结构生物学。 是研究生物大分子空间结构及其相互关系是研究生物大分子空间结构及其相互关系的主要实验手段。的主要实验手段。Drosophila melanogasterArabidopsis thaliana植株小植株小 -15 cm种子多种子多- up to 10,000 seeds in a plant周期短周期短- 4 weeks for a cycle基因组小基因组小 -5 chromosomes 140，000 kb（基因组测序完成）（基因组测序完成） 紫外线紫外线为光源，为光源，照射照射被检物体发出荧光，被检物体发出荧光，在在显微

19、镜下观察形状及所显微镜下观察形状及所在位置。在位置。 首先汞灯发出紫外线，首先汞灯发出紫外线，经第一次滤光片除去较经第一次滤光片除去较长的波，使紫外线照到长的波，使紫外线照到样品上。目镜下方滤光样品上。目镜下方滤光片除去紫外线，使可见片除去紫外线，使可见光通过，以保护眼睛光通过，以保护眼睛。电子显微镜电子显微镜原理原理以电子束作光源，电磁场作透镜。电子束的波长短，并以电子束作光源，电磁场作透镜。电子束的波长短，并且波长与加速电压且波长与加速电压( (通常通常50-120KV)50-120KV)的平方根成反比。的平方根成反比。 由由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录电子照明系统、电磁

20、透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统系统、电源系统等等5 5部分构成。部分构成。 分辨力分辨力0.2nm0.2nm，放大倍数可达百万倍。，放大倍数可达百万倍。 用于观察超微结构（用于观察超微结构（ultrastructureultrastructure），即小于），即小于0.20.2m m、光学显微镜下无法看清的结构，光学显微镜下无法看清的结构， 又称又称亚显微结构亚显微结构（submicroscopic structuressubmicroscopic structures）。）。1. 1. 普通光学显微镜普通光学显微镜玻玻璃璃透透镜镜的的工工作作原原理理原理：经物镜形成倒立实像，经目

21、镜进一步放大成像。原理：经物镜形成倒立实像，经目镜进一步放大成像。1 数值孔径数值孔径（镜口率）（镜口率）NA：指光镜的汇聚能力，：指光镜的汇聚能力， N.A = n sin/2 注：注： -镜口角，镜口角， n-介质折射率。介质折射率。 空气-1、水-133、香柏油-1515、溴萘-16 镜口角镜口角是指从物镜光轴上的物点发出的光线，与物镜前是指从物镜光轴上的物点发出的光线，与物镜前透镜有效直径的边缘所张的角度。透镜有效直径的边缘所张的角度。 角小于角小于180，/2小于小于90，sin/2最大值不超过最大值不超过1，因，因此此NA不会超过不会超过1。目前最好的显微镜。目前最好的显微镜=14

22、0 一般的显微镜上标明一般的显微镜上标明10 /0.65、0.75、0.8等，就是指数值孔等，就是指数值孔径，其大小代表了光镜汇聚光线的能力，径，其大小代表了光镜汇聚光线的能力，大，张角大，光通大，张角大，光通过的多、亮，透性好清晰过的多、亮，透性好清晰光学显微镜物镜的特性光学显微镜物镜的特性 人眼的分辨能力在人眼的分辨能力在0.2 mm左右，因此光学显微镜的左右，因此光学显微镜的最大有效放大倍数（使用油镜）是最大有效放大倍数（使用油镜）是1,000到到1,400。2 分辨力分辨力/率率（resdving power）：）：R， 指指25cm明视距离处，明视距离处，能分辨清楚尽可能靠近的两个质

23、点的能力。能分辨清楚尽可能靠近的两个质点的能力。辨认两点之间辨认两点之间的距离越小，则分辨本领愈高。人裸眼的分辨力约为的距离越小，则分辨本领愈高。人裸眼的分辨力约为100m，（，（实际上实际上200m才是理想的才是理想的）。而显微镜分辨力）。而显微镜分辨力则以下公式计算：则以下公式计算： R =061/N.A -光源的波长光源的波长 可见光波长可见光波长=0.45m， /2=70， sin/2=0.94 空气折射率空气折射率n=1，香柏油，香柏油n=1.5 空气空气 R = 0.61 /N.A =0.61*0.45m / （1 *0.94）=0.3m 香柏油香柏油R = 0.61*0.45m

24、/ （1.5 *0.94）= 0.2m 光镜分辨率的最小数值为光镜分辨率的最小数值为0.2m。波长是定值（波长是定值（400nm700nm），后者情况如何呢？），后者情况如何呢？如何提高显微镜的分辨率？如何提高显微镜的分辨率？R =061/N.A高的分辨力（高的分辨力（R值小）值小）-波长，波长， 镜口率。镜口率。 NA 也不能随意增大，一般在也不能随意增大，一般在005095，用香柏油（油，用香柏油（油镜）可达镜）可达15，用溴萘可近，用溴萘可近16。这样，光镜的最大分辨力。这样，光镜的最大分辨力R=（061550）/16=209（nm）（约为可见光最短波长的一）（约为可见光最短波长的一半）

25、。半）。 所以，所以，R=02m是光镜的极限是光镜的极限，显微镜无论制作的如何，显微镜无论制作的如何精密，都无法突破这一极限。精密，都无法突破这一极限。 0.61 0.61 R R n n sin sin n: n: 聚光镜和物镜之间聚光镜和物镜之间 介质的折射率介质的折射率. . 空气为空气为1, 1,油为油为1.51.5 : : 标本对物镜镜口标本对物镜镜口 张角的半角张角的半角. . sinsin的最大值为的最大值为1 1 :照明光源的波长照明光源的波长. . 白光为白光为0.5 m0.5 m3 放大倍数放大倍数/率率（magnification）：）：M 是最终成像的大小是最终成像的大

26、小 与原物体大小的比值（指长度）与原物体大小的比值（指长度）目镜放大倍数目镜放大倍数MF目目= 250mm （明视距离）（明视距离）/F目目（目镜焦距）（目镜焦距）物镜放大倍数物镜放大倍数MF物物= 160mm ( 标准光学筒长标准光学筒长) /F物物(物镜焦距物镜焦距)总放大倍数总放大倍数MF总总= 标准光学筒长标准光学筒长/F物物 250/F目目 = 物镜放大率物镜放大率目镜放大率目镜放大率 M 是否越大越好？怎样提高是否越大越好？怎样提高M ？最大放大倍数最大放大倍数 人眼的分辨率人眼的分辨率( ( 200 200 m )m )光镜的分辨率光镜的分辨率( ( 0.2 0.2 m )m )

27、 = =10001000倍倍F目不能太短，因人眼瞳孔要与出射光孔重合，在10 mm以上，放大率不高，约在（250/10）25，光学筒长（A）不能无限长，所以只有靠减小F物来提高总放大倍数。光镜有效放大倍数受到分辨力限制，只要将R=0.2m，放大到人眼分辨力（0.2 mm）大小，便能观察该物体。0.2 mm 103/0.2m=103（倍），超过此界限继续放大，人眼就看不清其细节，是模糊的空放大，无意义。 一般一般 光学显微镜的最大放大率只能是光学显微镜的最大放大率只能是透镜的数值孔径的透镜的数值孔径的1000倍。倍。透镜的数值孔径的范围是透镜的数值孔径的范围是1.01.4，所以光学显微镜，所以光

28、学显微镜在用空气作介质时最大放大倍数为在用空气作介质时最大放大倍数为1000倍，用油镜则为倍，用油镜则为1400倍。倍。 有效放大：有效放大： 上限：物镜镜口率上限：物镜镜口率1000 ； 下限：物镜镜口率下限：物镜镜口率250； 可变光阑（光圈）可调节开孔大小使聚光镜的可变光阑（光圈）可调节开孔大小使聚光镜的N.A适应于物镜的适应于物镜的N.A，如果聚光镜的如果聚光镜的N.A小于物镜小于物镜N.A，则造成物镜，则造成物镜NA不能充分发挥。不能充分发挥。正确匹配目、物镜，以保证物象清晰度。正确匹配目、物镜，以保证物象清晰度。显微镜适合的放大倍数显微镜适合的放大倍数 决定于物镜的数值孔径，一般应

29、为决定于物镜的数值孔径，一般应为NA的的 500-1000倍，倍，M=NA（500-1000）。）。 在选择放大倍数时，一定注意镜头的匹配，在物镜与目镜的组合中，在选择放大倍数时，一定注意镜头的匹配，在物镜与目镜的组合中， 目镜有效放大倍数为：目镜有效放大倍数为： M=目镜倍数（目镜倍数（O）物镜倍数（物镜倍数（B） OB=NA（500-1000） O=NA（500-1000）/B。4 焦点深度焦点深度 在视野中垂直范围内能观察到的界限。也就是调焦看清在视野中垂直范围内能观察到的界限。也就是调焦看清楚某一物点时，不仅这一点清楚，此点的上下两侧也能看清楚，能看清楚某一物点时，不仅这一点清楚，此点

30、的上下两侧也能看清楚，能看清楚的厚度称为焦点深度。以下式表示：楚的厚度称为焦点深度。以下式表示： d=Kn/MNA K常数，约常数，约0.24mm； M为总放大倍数；为总放大倍数； n为介质折射率为介质折射率 从上式看出，放大倍数愈高，数值孔径愈大，则焦点深度愈浅从上式看出，放大倍数愈高，数值孔径愈大，则焦点深度愈浅5 工作距离工作距离 指从物镜镜面表面到盖玻片上表面之间的距离指从物镜镜面表面到盖玻片上表面之间的距离。在物镜孔。在物镜孔径一定的条件下，工作距离越小，孔径角就愈大，数值孔径也越大，所径一定的条件下，工作距离越小，孔径角就愈大，数值孔径也越大，所以高倍镜工作距离很小。以高倍镜工作距

31、离很小。6 镜像亮度和视场亮度镜像亮度和视场亮度 镜像亮度镜像亮度：指镜下图像的亮度。：指镜下图像的亮度。 视场亮度视场亮度：镜下整个视场的明暗程度。除与目、物镜有关外，还与：镜下整个视场的明暗程度。除与目、物镜有关外，还与 聚光镜、光阑、反光镜和光源有关。聚光镜、光阑、反光镜和光源有关。7 反差（反差（contrast） 指观察物与背景的对比程度。在光镜和电指观察物与背景的对比程度。在光镜和电镜有所不同。镜有所不同。在光镜（光学像）：在光镜（光学像）： 由于被检物各部分结构不同，因而吸收由于被检物各部分结构不同，因而吸收或反射光线强弱程度差异而引起或反射光线强弱程度差异而引起“亮度差亮度差”

32、或或“色度差色度差”。 在电镜（电子像）：在电镜（电子像）： 由于被检物各不同部位对入射电子具有由于被检物各不同部位对入射电子具有不同散射度而引起不同散射度而引起“浓淡差浓淡差”。（电子束基本上是单色光，。（电子束基本上是单色光，它与被检物之间不产生色的反应，在像中显示出来的仅是浓它与被检物之间不产生色的反应，在像中显示出来的仅是浓淡差别）。淡差别）。从整个生命科学的发展趋势看细胞从整个生命科学的发展趋势看细胞 生物学方法生物学方法 分子水平 细胞水平 结构功能 细胞生命活动 分析 综合 功能基因组学研究是细胞生物学研究的基础与归宿（生命科学研究的核心问题）取材与取材与固定固定：保持材料新鲜保

33、持材料新鲜，使活细胞组成成分、物质固定，使活细胞组成成分、物质固定，代代谢停止，谢停止，常用的有鲍威氏法、福尔马林固定常用的有鲍威氏法、福尔马林固定脱水与透明脱水与透明：先用蒸馏水洗涤冲洗后，再脱水，用先用蒸馏水洗涤冲洗后，再脱水，用30%30%的酒精冲的酒精冲洗，把胞内水分逐渐替换出来，并防止萎缩；洗，把胞内水分逐渐替换出来，并防止萎缩；透明剂透明剂的作用是的作用是下一步顺利进蜡，二甲苯能把材料组织细胞中酒精替换出来下一步顺利进蜡，二甲苯能把材料组织细胞中酒精替换出来进蜡与进蜡与包埋包埋：用石蜡溶液进入细胞代替二甲苯，一般在温箱石蜡用石蜡溶液进入细胞代替二甲苯，一般在温箱石蜡溶液中；溶液中；

34、包埋包埋就是放在冷水环境中很快使石蜡凝固，就是放在冷水环境中很快使石蜡凝固，使组织变使组织变得坚硬，便于切片得坚硬，便于切片 切片切片： 切片机上进行切片机上进行脱蜡脱蜡: : 10-1510-15分钟；分钟；1/21/2二甲苯和二甲苯和1/21/2酒精酒精纯酒精纯酒精95%95%酒精酒精- - 85% - 70%85% - 70%各各2323分钟分钟染色染色：番红、醋酸洋红，染色番红、醋酸洋红，染色424424小时小时封固封固：中性塑胶，盖片风干中性塑胶，盖片风干Fluorescence image of epithelial cell, DNA in blue and Microtubul

35、es in green 用于观察能激发出荧光的结构。用途：免疫荧光用于观察能激发出荧光的结构。用途：免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。观察、基因定位、疾病诊断。用途：观察未经染色的玻片标本用途：观察未经染色的玻片标本倒置显微镜倒置显微镜 物镜物镜与与照明系统照明系统颠倒，颠倒，前者在载物台之下，后者前者在载物台之下，后者在载物台之上，用于观察在载物台之上，用于观察培养的活细胞培养的活细胞，通常具有，通常具有相差物镜，有的还具有荧相差物镜，有的还具有荧光装置。光装置。暗视野显微镜暗视野显微镜 dark field microscope 聚光镜中央有挡光片，照明聚光镜中央有挡光片，照明光线不直接进

36、入物镜，只允光线不直接进入物镜，只允许被标本反射和衍射的光线许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而进入物镜，因而视野的背景视野的背景是黑的是黑的，物体的边缘是亮的物体的边缘是亮的 可观察可观察 4200nm的微粒子，的微粒子，分辨率比普通显微镜高分辨率比普通显微镜高50倍倍 观察物体轮廓观察物体轮廓透射式电子显微镜的基本结构透射式电子显微镜的基本结构 1 电子束照明系统电子束照明系统 包括电子枪和聚光镜。有高频电流加热钨丝发包括电子枪和聚光镜。有高频电流加热钨丝发出电子，经高电压使电子加速，经聚光镜汇聚成电子束出电子，经高电压使电子加速，经聚光镜汇聚成电子束2 成像系统成像系统 包括物镜、中间

37、镜及投影镜组成。物镜直接将样品放包括物镜、中间镜及投影镜组成。物镜直接将样品放大，中间镜和投影镜进一步把物镜的像放大。大，中间镜和投影镜进一步把物镜的像放大。 物镜、中间镜、投影镜均为电子透镜（磁透镜），它是沿一光物镜、中间镜、投影镜均为电子透镜（磁透镜），它是沿一光轴呈旋转对称的电磁场，可使从轴上一点发出的电子，重新会聚在轴呈旋转对称的电磁场，可使从轴上一点发出的电子，重新会聚在中心轴的另一点上。中心轴的另一点上。 磁透镜是由一只大的电磁圈组成，好像一个螺旋管，当电流通磁透镜是由一只大的电磁圈组成，好像一个螺旋管，当电流通过时便可产生磁场，磁场对电子来说是折射介质。过时便可产生磁场，磁场对电

38、子来说是折射介质。4 观察记录系统：观察记录系统： 投影镜下面的观察室中装有荧光屏，显现出标本的电子显微投影镜下面的观察室中装有荧光屏，显现出标本的电子显微像，便于观察。同时装有自动拍摄系统，以便把显示图像拍摄像，便于观察。同时装有自动拍摄系统，以便把显示图像拍摄下来供观察分析。下来供观察分析。3 真空系统真空系统 镜筒中的高速电子和气体分子间的相互作用，与气体分子间镜筒中的高速电子和气体分子间的相互作用，与气体分子间的相互作用一样，会使高速电子散射而偏离直线；此外，电子的相互作用一样，会使高速电子散射而偏离直线；此外，电子枪中存在气体会产生电离和放电，引起电子束的不稳定或闪烁，枪中存在气体会

39、产生电离和放电，引起电子束的不稳定或闪烁，还会腐蚀灯丝；再者，真空可保护透镜和防止标本污染。所以，还会腐蚀灯丝；再者，真空可保护透镜和防止标本污染。所以，电子显微镜的真空度越高越好，一般采用电子显微镜的真空度越高越好，一般采用104乇（乇（torr）相当于）相当于107大气压。大气压。 基本要求基本要求 1 1 细胞精细结构保存良好，不产生明显的物质凝聚、丢失细胞精细结构保存良好，不产生明显的物质凝聚、丢失或添加人工效应等；或添加人工效应等； 2 2 切片厚度在切片厚度在500500埃左右，最大不超过埃左右，最大不超过10001000埃埃（1mm1mm厚的样品厚的样品切成切成200002000

40、0片；一个一般大小的细胞要切成片；一个一般大小的细胞要切成300300片）片） 颜色颜色 厚度（埃）厚度（埃） 暗灰色暗灰色 400 灰色灰色 400500 银色银色 500700 金黄色金黄色 700900 紫色紫色 900以上以上 3 切片应耐受电子束的轰击，包埋介质不发生变形；切片应耐受电子束的轰击，包埋介质不发生变形； 4 切片应具有良好的反差；切片应具有良好的反差； 5 切片需均匀，没有皱褶、刀痕及染色剂沉淀等缺陷切片需均匀，没有皱褶、刀痕及染色剂沉淀等缺陷一、超薄切片技术一、超薄切片技术 1 缓冲液缓冲液 1）磷酸缓冲液）磷酸缓冲液 2）二甲砷酸钠缓冲液）二甲砷酸钠缓冲液 2 固定

41、液固定液 1）戊二醛固定液）戊二醛固定液 2）2%锇酸贮存液锇酸贮存液 3）高锰酸钾液）高锰酸钾液 4）多聚甲醛液）多聚甲醛液 3 支持膜（液）支持膜（液） 4 染色液染色液 1 缓冲液缓冲液 维持细胞与固定液之间的平衡，消除细胞内释出的氢、氧离子，保持维持细胞与固定液之间的平衡，消除细胞内释出的氢、氧离子，保持固定液的固定液的PH值在正常生理值范围内。常用磷酸盐、柠檬酸盐、砷酸钠液值在正常生理值范围内。常用磷酸盐、柠檬酸盐、砷酸钠液 1）磷酸缓冲液）磷酸缓冲液 配制固定液用，该缓冲液对组织无毒害，不易产生配制固定液用，该缓冲液对组织无毒害，不易产生假象，对细胞膜、核保存好，使细胞基质致密均一

42、。假象，对细胞膜、核保存好，使细胞基质致密均一。（一）各种试剂制备（一）各种试剂制备配配 法法 甲液：甲液：0.2M磷酸二氢钠溶液磷酸二氢钠溶液 NaH2PO42H2O 31.2g 蒸馏水加至蒸馏水加至 100ml 乙液：乙液：0.2M磷酸氢二钠溶液磷酸氢二钠溶液 Na2HPO42H2O 53.61g 或或 ( Na2HPO47H2O 53.65g Na2HPO412H2O 71.64g ) 蒸馏水加至蒸馏水加至 1000 ml 将甲、乙两液按下表混合，则成不同将甲、乙两液按下表混合，则成不同pH的的0.2M磷酸缓磷酸缓冲液。冲液。 pH 6.4 6.6 6.8 7.0 7.2 7.4 甲液甲

43、液 13.3 18.8 24.5 30.5 36 40.5 乙液乙液 30.7 31.2 26.5 19.5 14 9.5有些实验有些实验要避免磷的干扰，则选用二甲砷酸钠缓冲液要避免磷的干扰，则选用二甲砷酸钠缓冲液，即：，即：配制配制0.2M的二甲砷酸钠缓冲液。的二甲砷酸钠缓冲液。 甲液：甲液： 二甲砷酸钠二甲砷酸钠 21.4 g 蒸馏水加至蒸馏水加至 250 ml。 乙液：乙液： 0.2N HCL 按下表混合，并加蒸馏水至按下表混合，并加蒸馏水至100ml，便得不同，便得不同PH 的的0.2M缓缓冲液，冲液， pH 6.6 6.8 7.0 7.2 7.4 甲液甲液 50 50 50 50 5

44、0 乙液乙液 13.3 9.3 6.3 4.2 2.7 本液稳定，可长期存放使用本液稳定，可长期存放使用2）二甲砷酸钠缓冲液）二甲砷酸钠缓冲液2 固定液固定液 1）戊二醛固定液）戊二醛固定液 常用浓度常用浓度2.5% 2）2%锇酸贮存液锇酸贮存液 锇酸，即四氧化锇（锇酸，即四氧化锇（OsO4）是一种）是一种 淡黄色结晶，具有强烈的刺激味，其水溶液是中性的。淡黄色结晶，具有强烈的刺激味，其水溶液是中性的。 配方：配方： OsO4 2g 加双蒸水溶解成加双蒸水溶解成100ml 配法：配法：一定在通风橱内操作。锇酸有强烈毒性，对粘膜和角膜有固定作一定在通风橱内操作。锇酸有强烈毒性，对粘膜和角膜有固定

45、作用。使用前几天，先将成品锇酸安瓶上标签洗去，用洗液浸泡用。使用前几天，先将成品锇酸安瓶上标签洗去，用洗液浸泡1 12hr2hr，再，再将安瓶固定在玻棒一端，（以避免用手接触安瓶）放入烧杯中自来水冲洗将安瓶固定在玻棒一端，（以避免用手接触安瓶）放入烧杯中自来水冲洗干净，后用蒸馏水彻底冲洗，卫生纸吸干水分，放入通风橱，戴上橡胶手干净，后用蒸馏水彻底冲洗，卫生纸吸干水分，放入通风橱，戴上橡胶手套，用沙砖在安瓶颈部划一痕，插入棕色磨口瓶中折断，连同安瓶一并放套，用沙砖在安瓶颈部划一痕，插入棕色磨口瓶中折断，连同安瓶一并放入，瓶内预先放好所需蒸馏水，仔细摇匀后用指套套住存放备用。用时与入，瓶内预先放好

46、所需蒸馏水，仔细摇匀后用指套套住存放备用。用时与等量等量0.1mol/L0.1mol/L的磷酸冲液（的磷酸冲液（pH7.4pH7.4）混合即可。）混合即可。3）高锰酸钾液）高锰酸钾液 4）多聚甲醛液）多聚甲醛液3 支持膜（液）支持膜（液） 1 1）火棉胶膜；）火棉胶膜； 2 2）碳膜；）碳膜； 3 3）0.25%Formvar0.25%Formvar聚乙烯醇缩甲醛聚乙烯醇缩甲醛氯仿液氯仿液 将市售氯伤将市售氯伤( (分析纯分析纯) )在在6060电热套上重蒸馏电热套上重蒸馏( (通风橱中进行通风橱中进行) ) Formvar 250mg 经蒸馏的氯仿经蒸馏的氯仿 100ml 密闭后保存干燥器备

47、用密闭后保存干燥器备用4 染色液染色液 醋酸双氧铀染液醋酸双氧铀染液 50%（或（或70%）乙醇（或丙酮）乙醇（或丙酮） 100ml 醋酸双氧铀醋酸双氧铀 2g 在棕色磨口瓶中混匀溶解，低温暗处在棕色磨口瓶中混匀溶解，低温暗处23天后取用上清液天后取用上清液5 包埋剂包埋剂目的：包埋使组织变得坚硬目的：包埋使组织变得坚硬, ,便于切片。便于切片。机理：可进入细胞内，起支持作用。机理：可进入细胞内，起支持作用。 1）国产环氧树脂配方）国产环氧树脂配方 618#环氧树脂环氧树脂 5ml 顺丁烯二酸酐顺丁烯二酸酐 2g 邻苯二甲酸二丁脂（邻苯二甲酸二丁脂（DBP） 1.52ml 二乙基苯胺二乙基苯胺

48、 0.4ml 依次加入溶解均匀，备用依次加入溶解均匀，备用 2）进口环氧树脂）进口环氧树脂EPON812配方配方 甲液（较软）：甲液（较软）：EPON812 10ml DDSA（十二烷基滤酸酐）（十二烷基滤酸酐） 16ml 乙液（较硬）：乙液（较硬）：EPON812 10ml MNA（六甲酸酐）（六甲酸酐） 9.8ml 存于冰箱，用时混匀。冬季：甲乙存于冰箱，用时混匀。冬季：甲乙=46 夏季：甲乙夏季：甲乙=37 用注射器将甲、乙两液混合，再以总体积的用注射器将甲、乙两液混合，再以总体积的1.52%之比加入之比加入DMP30（二甲氨基甲苯酚）充分搅拌均匀，封好备用。（二甲氨基甲苯酚）充分搅拌均

49、匀，封好备用。5 5 包埋剂包埋剂1 取材取材 2 初固定初固定3 漂洗漂洗 4 再固定再固定（二）制片过程（二）制片过程要求：要求： a .a .动作迅速；动作迅速；b. b. 材料体积小于材料体积小于1mm1mm3 3；c.c. 机机械损伤要小（刀锋利动作轻巧）；械损伤要小（刀锋利动作轻巧）；d.d. 取材部位准确；取材部位准确；e e . .操作最好在低温（操作最好在低温（0404）处进行。）处进行。迅速解剖动、植物组织，将其放在滴有戊二醛（冷）迅速解剖动、植物组织，将其放在滴有戊二醛（冷）的卡片纸上，用锋利刀片切成的卡片纸上，用锋利刀片切成0.51mm0.51mm3 3小块，放入盛小块

50、，放入盛有冷戊二醛的小称量瓶中固定有冷戊二醛的小称量瓶中固定3 3小时以上（低温小时以上（低温44）用用PH7.0PH7.0（植物）、（植物）、7.27.2（动物）（动物）磷酸缓冲液冲洗磷酸缓冲液冲洗3 3次次以上以上(1(12hr)2hr)，以除去游离的与组织结合不牢的固定，以除去游离的与组织结合不牢的固定液液( (游离醛游离醛) )；戊二醛易与锇酸形成一种细小颗粒而污；戊二醛易与锇酸形成一种细小颗粒而污染整个切片。染整个切片。 在通风橱内弃去漂洗液，加入适量配好的锇酸，塞在通风橱内弃去漂洗液，加入适量配好的锇酸，塞上瓶塞，固定上瓶塞，固定2hr2hr，使材料变黑。，使材料变黑。目的：使大分

51、子交联而保持固定，不至在后面过程中移位或丢失。机理：可与蛋白质的游离氨基形成共价键，将邻近蛋白分子交联。双重固定法：单用锇酸不能很好的保护糖元及其它碳水化合物；戊二醛与锇酸相互取长补短，固定效果更好。较好地保存胞内主要化学成分5 再漂洗再漂洗 弃锇酸于废液瓶中，加适量缓冲液漂洗弃锇酸于废液瓶中，加适量缓冲液漂洗3次，每次次，每次15，以后移，以后移出通风橱。出通风橱。漂洗的目的是洗净多余的锇酸漂洗的目的是洗净多余的锇酸，以免与下步脱水时所用乙醇作，以免与下步脱水时所用乙醇作用发生沉淀。用发生沉淀。6 脱水脱水 组织块分别经过组织块分别经过50%、70%、80%、90%、95%上行上行梯度酒精梯

52、度酒精各各20，再经过三次，再经过三次100%酒精各酒精各10，当天完不成脱水过程时，可停在，当天完不成脱水过程时，可停在70%酒酒精中存放。精中存放。脱水？脱水？ 常用包埋剂是非水溶性的，只有将细胞中的游离水分彻底常用包埋剂是非水溶性的，只有将细胞中的游离水分彻底清除之后，非水溶性的包埋剂才能渗入清除之后，非水溶性的包埋剂才能渗入7 浸透浸透 用包埋剂逐渐取代组织中的脱水剂，使细胞内外所有的空隙都被用包埋剂逐渐取代组织中的脱水剂，使细胞内外所有的空隙都被包埋剂充填。包埋剂充填。 1/2脱水剂（脱水剂（100%Alo）+1/2稀释剂（环氧丙烷）稀释剂（环氧丙烷）2040 稀释剂稀释剂环氧丙烷环

53、氧丙烷 20 1/2稀释剂（环氧丙烷）稀释剂（环氧丙烷）+1/2包埋剂包埋剂 1hr 包埋剂包埋剂过夜或过夜或12天，温度天，温度20。梯度酒精脱水？梯度酒精脱水？ 急剧的脱水会引起细胞收缩急剧的脱水会引起细胞收缩8 包埋包埋9 固化固化 包埋好的胶囊，在包埋好的胶囊，在60温箱中加温固化温箱中加温固化2436hr，使完全聚合，使完全聚合硬化，制成包埋块。硬化，制成包埋块。10 切片切片 在超薄切片机上进行。在着手进行超薄切片前，尚需完成制在超薄切片机上进行。在着手进行超薄切片前，尚需完成制备支持膜、修整包埋块及制作玻璃刀等工作。备支持膜、修整包埋块及制作玻璃刀等工作。 热胀式超薄切片机：热胀

54、式超薄切片机： LKB型型(瑞典瑞典)常用常用; Reichert OmV2型型(奥地利奥地利) 机械式超薄切片机：机械式超薄切片机： Perter-Blum型；型； Sotvall MT/5000型型(美国美国)； Huxley型（英国剑桥）；型（英国剑桥）； UM-3型（日本）。型（日本）。 1）支持膜的制备）支持膜的制备 最常使用最常使用200目（目（3 mm）的铜网。用前需经丙酮清洗几遍，然后）的铜网。用前需经丙酮清洗几遍，然后再用无水酒精洗几次，以彻底去除油污。挑选清洗好的铜网，尚需在再用无水酒精洗几次，以彻底去除油污。挑选清洗好的铜网，尚需在其上覆盖一层薄膜（小于其上覆盖一层薄膜（

55、小于200埃），即支持膜。埃），即支持膜。常用碳膜、火棉胶膜或常用碳膜、火棉胶膜或Formvar膜（孚尔膜），即聚乙烯醇缩甲醛。膜（孚尔膜），即聚乙烯醇缩甲醛。 支持膜的制备支持膜的制备 修块修块 制作玻璃刀制作玻璃刀 制作水槽制作水槽 捞片捞片11 染色染色 目的目的：增强样品中各种结构图象之间的反差或选择性地增强样品中各种结构图象之间的反差或选择性地显示某些结构或成分。显示某些结构或成分。 方法方法：采用醋酸双氧铀（细胞核、结缔组织）采用醋酸双氧铀（细胞核、结缔组织）柠檬柠檬酸铅（细胞质）双染法。酸铅（细胞质）双染法。A.A.选择性染色选择性染色苏木精细胞内核酸的分布苏木精细胞内核酸的分布

56、 伊伊 红细胞质染色红细胞质染色B.B.特异性染色特异性染色 酶酶 + + 底物底物 抗原抗原 + + 抗体抗体基本原理基本原理 又称冷冻蚀刻，冷冻复型（又称冷冻蚀刻，冷冻复型（freeze-replica）、冷）、冷冻断裂（冻断裂（freeze-fracture）是一种由冷冻断裂与复型相结合）是一种由冷冻断裂与复型相结合的样品制备技术。最早由的样品制备技术。最早由Hall，G. E.（1950）首先提出，直）首先提出，直到到1957年才由年才由Steere用于生物样品的制备。现已成为电子显用于生物样品的制备。现已成为电子显微镜技术中一个独具特色的分支，并得到广泛的应用。微镜技术中一个独具特色

57、的分支，并得到广泛的应用。 该技术是该技术是采用冷冻的方法使样品迅速固定硬化，然后在采用冷冻的方法使样品迅速固定硬化，然后在真空中切断，升温使冰升华，暴露出断面结构（蚀刻）。再真空中切断，升温使冰升华，暴露出断面结构（蚀刻）。再在切面上喷镀一层铂在切面上喷镀一层铂碳投影膜，碳投影膜，然后将组织溶掉，把碳和然后将组织溶掉，把碳和铂的膜剥下来，此膜即为复膜（铂的膜剥下来，此膜即为复膜（replicareplica），），捞至钢网上在捞至钢网上在电镜下观察。电镜下观察。冰冻蚀刻技术（冰冻蚀刻技术（freeze etching）4 基本步骤基本步骤 样品固定样品固定冷冻冷冻断裂断裂蚀刻蚀刻复型复型剥离

58、剥离捞膜捞膜观察。观察。下面以动物材料为例，说明操作过程。下面以动物材料为例，说明操作过程。 1）样品预处理样品预处理 切成小条（长切成小条（长3mm，宽，宽1-1.5 mm）；）； 2）削制碳棒及烧制铂珠削制碳棒及烧制铂珠; 3）样品冷冻样品冷冻 a、断裂装置组装好，入液氮冷冻。、断裂装置组装好，入液氮冷冻。b、将样品修整好装入、将样品修整好装入样品杯的孔中，用自制小铝提勺入液氮中冷冻。冷冻结束后（停止沸腾）迅样品杯的孔中，用自制小铝提勺入液氮中冷冻。冷冻结束后（停止沸腾）迅速将样品杯放入样品座的凹槽内，再一块入液氮。速将样品杯放入样品座的凹槽内，再一块入液氮。 4）断裂）断裂 冷冻结束，迅

59、速将提蓝移到真空喷镀仪中开机抽真空，使冷冻结束，迅速将提蓝移到真空喷镀仪中开机抽真空，使真空度达到真空度达到310-5托，此时温度约在托，此时温度约在-100110。速板动拉杆使支撑。速板动拉杆使支撑块滑脱，刀座即下滑将样品切断。块滑脱，刀座即下滑将样品切断。5）蚀刻）蚀刻 加温使其保持在加温使其保持在-96100，真空度在，真空度在110-5310-6托，托，断面上的冰即开始升华，持续约断面上的冰即开始升华，持续约60秒左右。秒左右。 6）制作复型）制作复型 首先以断面首先以断面45度度角喷铂角喷铂碳，有必要的反差，约需碳，有必要的反差，约需23秒。然后再以秒。然后再以90度度角喷碳，以加固

60、复型。每次角喷碳，以加固复型。每次1秒，间隔秒，间隔34秒，秒，共喷共喷45次。次。 7）剥离）剥离 将样品小心取出放在次氯酸钠溶液中腐蚀。将样品小心取出放在次氯酸钠溶液中腐蚀。 8）捞取观察）捞取观察将复型膜小心捞至铜网上，染色后在将复型膜小心捞至铜网上，染色后在TEM观察分析。观察分析。5 复型电镜图象的辨认复型电镜图象的辨认（Branton命名法）E半膜半膜（extra-cellular half）：指与细胞外间隙或细胞内间隙（相）：指与细胞外间隙或细胞内间隙（相邻的半膜。邻的半膜。P半膜半膜（protplasmic half）：指与细胞质、核质及线粒体基质相）：指与细胞质、核质及线粒体