实验八酵母RNA的提取及成分鉴定(浓盐法)

1、生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验实验八实验八酵母酵母RNARNA的提取及的提取及 成分鉴定（浓盐法）成分鉴定（浓盐法）生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验n 掌握浓盐法提纯掌握浓盐法提纯RNA的基本原理和方法的基本原理和方法n 了解了解RNA成分鉴定的原理及其方法成分鉴定的原理及其方法生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验实验原理实验原理u 核酸的分类与分布核酸的分类与分布 DNA DNA：主要存在于细胞核的染色体中：主要存在于细胞核的染色体中, , 线粒体、叶绿体、质粒有少量线粒体、叶绿体、质粒有少量 RNARNA：存在于细胞质中：存在于细胞质中生物化学

2、与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验u 样本的选择：样本的选择：u 酵母酵母RNARNA（RNARNA占干重的占干重的3%-10%3%-10%）u 制备方法：制备方法：u 稀碱法、浓盐法稀碱法、浓盐法生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验破碎细胞破碎细胞提取提取纯化纯化I.I.材料准备材料准备II.II.破碎细胞或包膜内容物释放破碎细胞或包膜内容物释放III.III.核酸分离、纯化核酸分离、纯化IV.IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质沉淀或吸附核酸，并去除杂质V.V.核酸溶解在适量缓冲液或水中核酸溶解在适量缓冲液或水中u 制备过程：制备过程：u 生物化学与分子生物学实验生物化学与分

3、子生物学实验RNARNA以可溶性以可溶性钠盐的形式钠盐的形式游离析出游离析出离心去除菌体离心去除菌体, ,收集上清液收集上清液, ,调调至至RNARNA的等电点的等电点（pH2pH22.52.5）使使RNARNA沉淀沉淀析出，离心析出，离心收集沉淀收集沉淀乙醚洗涤沉乙醚洗涤沉淀、去除杂淀、去除杂质、提纯质、提纯RNARNA浓盐加热使酵母浓盐加热使酵母细胞壁破裂，蛋细胞壁破裂，蛋白质变性沉淀白质变性沉淀n RNARNA提取方法提取方法( (浓盐法浓盐法) )生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验RNARNA成分鉴定成分鉴定RNARNA在强酸性条件下沸水浴加热可以水解：在强酸性条件下沸水

4、浴加热可以水解：生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验1. 1. 磷酸鉴定磷酸鉴定通过鉴定通过鉴定RNARNA的三种水解产物来鉴定的三种水解产物来鉴定RNA:RNA:生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验2. 2. 碱基碱基( (嘌呤嘌呤) )鉴定鉴定生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验3. 核糖鉴定核糖鉴定5- 5-甲基间苯二酚甲基间苯二酚（蓝绿色）（蓝绿色）糠醛糠醛生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验仪器试剂仪器试剂n 仪器仪器精密精密pH试纸试纸（pH0.55.0）、）、广泛广泛pH试纸试纸（pH114）、冰块、锥形瓶、离心机、天平、电炉）、冰

5、块、锥形瓶、离心机、天平、电炉 干酵母、干酵母、10NaCl、6M HCl、冰块、冰块、5氨水、氨水、(NH4)2MoO4试剂试剂生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验实验操作实验操作 酵母酵母RNARNA提取提取（4 4人一组）人一组） 1. 1. 酵母破壁：酵母破壁：1010NaCl(40mL)NaCl(40mL)100mL100mL锥形瓶锥形瓶煮沸煮沸加入干酵母（一勺）加入干酵母（一勺）沸水浴沸水浴40min40min取出冷却取出冷却玻棒搅匀玻棒搅匀生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验取出锥形瓶取出锥形瓶自来水冷却后转自来水冷却后转入入50mL离心管离心管3500r

6、pm离心离心 5min取上清取上清2.2.离心分离离心分离RNARNA两两两两平衡平衡后后对称对称放入离放入离心机中心机中生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验3.3.沉淀提纯沉淀提纯RNARNA 将上清液转入将上清液转入小烧杯中（小烧杯中（不不可带入沉淀可带入沉淀）冰浴中冷却冰浴中冷却用用6M HCL调调 pH值至值至 2.02.5(RNA等电点等电点)冰浴中静置冰浴中静置5-10min（可（可见烧杯底部见烧杯底部有大量沉淀）有大量沉淀）轻轻摇匀后转轻轻摇匀后转入离心管，两入离心管，两两平衡后对称两平衡后对称放入离心机放入离心机3500rpm离离心心5min，并并收集沉淀收集沉淀精

7、密试纸精密试纸2.0生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验 RNA RNA成分鉴定成分鉴定 溶解溶解RNA2. 水解水解RNA（此处开始（此处开始2人一组）人一组）加加22d 1.5M H2SO4沸水浴沸水浴10min取取5ml RNA至大试管至大试管 溶液澄清溶液澄清加加1d蒸馏水蒸馏水 搅成糊状搅成糊状 加加10ml蒸馏水搅匀蒸馏水搅匀 加加5%氨水至氨水至pH6-7，继续滴加至沉淀完全溶解，继续滴加至沉淀完全溶解广泛试纸广泛试纸生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验核糖鉴定：核糖鉴定：20d水解液水解液+20d Fe3+HCL+2d 5%的的5-5-甲基间苯二酚甲基间

8、苯二酚3. RNA成分鉴定成分鉴定嘌呤鉴定：嘌呤鉴定：20d水解液水解液+20d 0.1mol AgNO3磷酸鉴定：磷酸鉴定：20d水解液水解液+20d钼酸铵钼酸铵 +FeSO4结晶粉结晶粉加浓氨水至加浓氨水至沉淀消失沉淀消失+10d 浓氨水浓氨水沸水浴沸水浴15min15min摇匀摇匀沸水浴沸水浴2min2min沸水浴沸水浴2-3min2-3min（绿豆大小）（绿豆大小）生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验离心机的使用方法离心机的使用方法1.选择合适的离心管选择合适的离心管2.使用天平对所离心样本（使用天平对所离心样本（包括离心套筒包括离心套筒）称量配平）称量配平3.打开离心机电

9、源，设定离心速度和离心时间打开离心机电源，设定离心速度和离心时间4.按按“停止停止”键打开离心机盖子，将样本按中心对称放置键打开离心机盖子，将样本按中心对称放置5.盖紧盖子，按盖紧盖子，按“离心离心”键启动键启动离心离心6.离心结束后，待仪器完全停止离心结束后，待仪器完全停止转动后方可打开盖子取出离心管转动后方可打开盖子取出离心管生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验实验结果实验结果1 1号：磷酸鉴定（蓝色）号：磷酸鉴定（蓝色）2 2号：碱基鉴定（红棕色）号：碱基鉴定（红棕色）3 3号：核糖鉴定（蓝绿色号：核糖鉴定（蓝绿色生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验思考题思考题u 在酵母破壁时为什么只能水煮沸了以后再在酵母