放射免疫抗体滴度的确定碘化标记物质量及放化纯度的鉴定

1、抗体滴度的确定与碘化标记物质量及放化纯度的鉴定天津医科大学医学检验学院2012级2班 张于君实验原理实验步骤实验试剂预计结果注意事项抗体滴度的确定抗体滴度的确定将浓缩抗血清进行倍比稀释，得到不同稀释度的抗体溶液。使用定量的标记抗原与各管抗体反应至平衡，分离结合部分，测不同稀释度抗体与标记抗原结合率（B/T）。B/T=30-50%的抗体滴度即为应用抗体的最佳滴度。实验原理抗体滴度的确定浓缩抗体125I-Ag缓冲液免疫分离剂实验试剂抗体滴度的确定 总T 含：125I-Ag1# 1:1 含：浓缩抗体、缓冲液（1:1）2# 1:2 含：浓缩抗体、缓冲液（1:2）3# 1:4 含：浓缩抗体、缓冲液（1:

2、4）4# 1:8 含：浓缩抗体、缓冲液（1:4）5#1.将浓缩抗体做倍比稀释实验步骤各管所含成分抗体滴度的确定125I-Ag：100l1.将浓缩抗体做倍比稀释1#抗体滴度的确定浓缩抗体100l缓冲液100l1:11.将浓缩抗体做倍比稀释2#抗体滴度的确定4#混匀后取100l加入3#2#混匀后取100l加入4#混匀后取100l加入5#3#5#1:11:21:41:81.将浓缩抗体做倍比稀释抗体滴度的确定2.加入标记抗原125I-Ag100l实验步骤4#5#2#3#混匀后，37温浴60min1#可在此时加入125I-Ag100l并参与温浴3.加入免疫分离剂1000l实验步骤抗体滴度的确定充分混匀后

3、，3000rpm离心15min3#4#2#1#弃去上清，在计数器上分别计数各管cpm4.计算各稀释度的结合率B/T实验步骤抗体滴度的确定总T1:11:21:41:81:161:321:641:128cpm3025416718148901159882085838400224361598B/T(%)55.2649.2238.3427.1319.3013.238.055.28所得数据应类似下表所示预计结果抗体滴度的确定5.绘制稀释曲线图实验步骤X：抗体稀释度Y：抗体各稀释度对应的结合率B/T可查出B/T=30%-50%相应抗体稀释度即为所求预计结果抗体滴度的确定注意事项1.加样量准确2.吸头不可相互

4、污染3.准确把握免疫分离剂用量及离心时间4.所有用具应按规范处理，避免放射污染碘化标记物质量及放化纯度的鉴定实验原理实验步骤实验试剂结果判定标记物抗原的质量鉴定测定一定量蛋白类激素的125I-Ag标记物的总放射性再使用三氯乙酸沉淀其蛋白部分，测得沉淀部分放射性二者之差即为游离碘部分游离碘占碘化标记物的15%以下即为合格实验原理碘化标记物质量及放化纯度的鉴定标记物抗原的质量鉴定10%三氯乙酸溶液1%磷酸盐缓冲液125I标记物样品实验试剂碘化标记物质量及放化纯度的鉴定标记物抗原的质量鉴定碘化标记物质量及放化纯度的鉴定1.取样品测量其总放射性。实验步骤2.沉淀其蛋白部分弃去上清测定沉淀物放射性。12

5、5I标记物100l+缓冲液0.5ml加10%三氯乙酸10ml测定总放射性弃去上清测定沉淀放射性计算结果标记物抗原的质量鉴定碘化标记物质量及放化纯度的鉴定游离碘=（1-沉淀物放射性cpm/总放射性cpm）*100%结果判定判定：碘化标记物游离碘15%为合格标记物抗原的质量鉴定碘化标记物质量及放化纯度的鉴定测定125I标记物放化纯度实验原理实验步骤实验试剂结果作图注意事项用纸层析法分离碘化标记物的杂质，从而计算碘化蛋白部分所占比例，即为该标记物的放化纯度。实验原理碘化标记物质量及放化纯度的鉴定测定125I标记物放化纯度碘化标记物质量及放化纯度的鉴定测定125I标记物放化纯度1%IK溶液125I标记

6、物展开剂正丁醇：乙醇：氨水=20:1：1滤纸条实验试剂碘化标记物质量及放化纯度的鉴定测定125I标记物放化纯度将滤纸条浸于将滤纸条浸于1%KI溶液溶液中过夜，次日取出晾干。中过夜，次日取出晾干。 从无孔端用铅笔以从无孔端用铅笔以1cm等距离等距离画画1012条线。条线。 在第一线处在第一线处点样点样510ul125I标记物晾干。标记物晾干。 将此滤纸条放入层析槽中，使末端浸于展开剂中约将此滤纸条放入层析槽中，使末端浸于展开剂中约5mm 2小时后小时后取出纸条晾干，然后取出纸条晾干，然后沿线剪开沿线剪开，分别放入相，分别放入相应试管中编号标记。应试管中编号标记。每管内加入每管内加入0.5mlH2

7、O,分别测定各管分别测定各管cpm数并记录数数并记录数据及作图。据及作图。实验步骤实验步骤碘化标记物质量及放化纯度的鉴定测定125I标记物放化纯度浸于1%KI溶液中过夜并晾干以1cm等距离画1012条线第一线处点510ul125I标记物晾干放入层析槽末端浸入展开液0.5cm2h后取出晾干沿线剪开分别置入试管并标记每管内加入0.5mlH2O分别测定各管cpm数管号管号123456789101112总总ALBcpm3364921324860484890724272361476EPOcpm17462211723951485469305448514473碘化标记物质量及放化纯度的鉴定测定125I标记物放化纯度实验结果将类似下表结果作图碘化标记物质量及放化纯度的鉴定测定125I标记物放化纯度作图结果如下结果作图横轴：各试管号码纵轴：每管计数率cpm计算第一峰占总cpm百分比如图所示：ALB的放化纯度=EPO的放化纯度=cpm1+cpm2+cpm3cpm总100% 90%cpm1+cpm2+cpm3cpm总100% 65%碘化标记物质量及放化纯度的鉴定测定125I标记物放化纯度结果作图分析： ALB放化纯度90%可能原因为：层析时间不足，未充分分离样品过期，有杂值出现。 EPO放化纯度=90%，结果较理想。碘化标记物质量及放化纯度的鉴定测定125I标记物放化纯度点样时要轻快，点样面积要尽