细胞工程5植物细胞培养与次生产物生产

1、细胞工程细胞工程CELLENGINEERING细胞工程细胞工程课程初步安排：课程初步安排：3636学时学时第一章第一章 绪论绪论 4 4个学时个学时第二章第二章 实验室配置及基本技术实验室配置及基本技术 2 2个学时个学时第三章第三章 植物细胞工程的理论基础植物细胞工程的理论基础 4 4个学时个学时第四章第四章 植物组织器官培养技术植物组织器官培养技术 6 6个学时个学时第五章第五章 植物细胞培养及次生代谢产物生产植物细胞培养及次生代谢产物生产 3 3个学时个学时第六章第六章 原生质体培养和体细胞杂交原生质体培养和体细胞杂交 3 3个学时个学时第七章第七章 人工种子人工种子 1 1个学时个学时

2、第八章第八章 植物种质资源离体超低温保存植物种质资源离体超低温保存 1 1个学时个学时第九章动物组织培养第九章动物组织培养 3 3个学时个学时第十章动物细胞融合与单克隆抗体第十章动物细胞融合与单克隆抗体 4 4个学时个学时第十一章动物组织与胚胎工程第十一章动物组织与胚胎工程 1 1个学时个学时第十二章试管动物与克隆动物第十二章试管动物与克隆动物 2 2个学时个学时第五章第五章 植物细胞培养与次生代谢产物生产植物细胞培养与次生代谢产物生产 植物细胞培养植物细胞培养(plant cell culture)(plant cell culture)指在离体指在离体条件下对植物单个细胞或小的细胞团进行培

3、养使其条件下对植物单个细胞或小的细胞团进行培养使其增殖的技术。增殖的技术。根据培养规模不同根据培养规模不同- 小规模培养、大批量培养小规模培养、大批量培养根据培养方式不同根据培养方式不同- 悬浮培养、平板培养、看护培养等悬浮培养、平板培养、看护培养等根据培养的目的不同根据培养的目的不同- 用于诱变或用于生产次生产物的细胞培养用于诱变或用于生产次生产物的细胞培养一一 悬浮培养悬浮培养二二 单细胞培养单细胞培养三三 细胞规模化培养细胞规模化培养四四 培养细胞的次生代谢及产物积累培养细胞的次生代谢及产物积累一一 悬浮培养（悬浮培养（suspension culturesuspension cultu

4、re） 细胞悬浮培养是指将单个游离细胞或小细胞团在细胞悬浮培养是指将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术。液体培养基中进行培养增殖的技术。n在液体状态下便于细胞和营养物质的充分接触和交换，细胞在液体状态下便于细胞和营养物质的充分接触和交换，细胞 状态可以保持一致状态可以保持一致n有利于在细胞水平上进行各种遗传操作和生理生化活动研究有利于在细胞水平上进行各种遗传操作和生理生化活动研究n为植物细胞的大规模培养提供前期技术基础为植物细胞的大规模培养提供前期技术基础Cell suspension Artificial seeds PlantsIsolation protoplasts

5、Secondary products Mutation select 愈伤组织诱导愈伤组织诱导 悬浮系的建立与继代培养悬浮系的建立与继代培养细胞生长状态的调控细胞生长状态的调控以愈伤组织为起始细胞的悬浮培养技术其过程以愈伤组织为起始细胞的悬浮培养技术其过程：（一）愈伤组织诱导（一）愈伤组织诱导 要求松散型好、增殖快、再生能力强。外观一般是要求松散型好、增殖快、再生能力强。外观一般是色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒状，疏松色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒状，疏松易碎。易碎。n 选择适宜的植物外植体材料选择适宜的植物外植体材料-研究表明，胚、胚轴、子叶是最常使用的外植体研究表明，胚、胚轴、

6、子叶是最常使用的外植体n 选择适宜的培养基选择适宜的培养基-较高浓度激素如较高浓度激素如2,4-D2,4-D，必要的附加物质如，必要的附加物质如CHCH等等n 愈伤组织培养愈伤组织培养-进行必要的选择和继代进行必要的选择和继代（二）悬浮细胞系的建立与继代培养（二）悬浮细胞系的建立与继代培养 1 1、取一定量的愈伤组织放入盛有、取一定量的愈伤组织放入盛有液体培养基的三角瓶中；液体培养基的三角瓶中；2 2、接种后的三角瓶置于、接种后的三角瓶置于120r/min120r/min的摇床上，在室温下黑暗培养；的摇床上，在室温下黑暗培养；3 3、培养初期，每隔、培养初期，每隔3d3d左右更换左右更换1 1

7、次次新鲜培养基；新鲜培养基；4 4、悬浮细胞系建立，经一段时间、悬浮细胞系建立，经一段时间培养，每隔培养，每隔1 12 2周需继代一次，可周需继代一次，可采用蔗糖梯度离心法先进行筛选；采用蔗糖梯度离心法先进行筛选；5 5、悬浮细胞系稳定后，继代培养、悬浮细胞系稳定后，继代培养中的振荡频率可适当降低。中的振荡频率可适当降低。callus10ml medium/1gcentrifugation isolation120rpm culturetrasfer 1 time/3d 150/250ml flask80rpmsubculture 悬浮细胞系的建立与继代培养悬浮细胞系的建立与继代培养 n 一个

8、成功的细胞悬浮培养体系应当满足一个成功的细胞悬浮培养体系应当满足3 3个基本条件：个基本条件：-悬浮培养物分散性良好悬浮培养物分散性良好, ,细胞团较小，一般细胞团较小，一般30305050个细胞以下个细胞以下-均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同-生长迅速，悬浮细胞的生长量一般生长迅速，悬浮细胞的生长量一般2 23 3天便可增加天便可增加1 1倍倍Lag Cell NumberTime(Day)ExponentialLinearProgressive DecelerationStationary悬浮细胞在一个培养周期中细胞增长动态悬浮细胞在一个培养周期

9、中细胞增长动态1 1、悬浮细胞的生长状态、悬浮细胞的生长状态（三）细胞生长状态的调控（三）细胞生长状态的调控n 根据不同培养时间的细胞数变化或细胞重量变化，即可构成根据不同培养时间的细胞数变化或细胞重量变化，即可构成该培养体系的基本参数该培养体系的基本参数n 生长速率生长速率一般通过不同时间细胞密度一般通过不同时间细胞密度的自然对数与起始密度的自然对数与起始密度 0 0 的自然对数之差与培养时间的自然对数之差与培养时间的比来衡量的比来衡量=（lnx-lnx0）/tn 也可通过单位体积的细胞重量测定细胞生长情况。细胞重量采用鲜重也可通过单位体积的细胞重量测定细胞生长情况。细胞重量采用鲜重和干重衡

10、量。一般鲜重只能反应细胞的生长情况，而干重则一定程度上和干重衡量。一般鲜重只能反应细胞的生长情况，而干重则一定程度上反映了细胞质量。鲜重和干重的测定方法较简单，只需按一定体积取样反映了细胞质量。鲜重和干重的测定方法较简单，只需按一定体积取样经过真空过滤后称重即可得到鲜重，然后在经过真空过滤后称重即可得到鲜重，然后在80条件下烘干细胞至恒重条件下烘干细胞至恒重即获得细胞干重。即获得细胞干重。n 影响悬浮细胞生长的因素：影响悬浮细胞生长的因素：-起始愈伤组织的质量起始愈伤组织的质量-接种细胞密度接种细胞密度-培养条件培养条件2 2、悬浮培养细胞的同步化、悬浮培养细胞的同步化 细胞同步化是指同一悬浮

11、培养体系的所有细胞细胞同步化是指同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。都同时通过细胞周期的某一特定时期。-植物细胞在悬浮培养中的游离性较差，容易团聚并进入不同植物细胞在悬浮培养中的游离性较差，容易团聚并进入不同程度的分化状态，因此，要达到完全同步化对于植物细胞培养程度的分化状态，因此，要达到完全同步化对于植物细胞培养是十分困难的是十分困难的-正是因为同一培养体系的植物细胞通常并不能处于同一细胞正是因为同一培养体系的植物细胞通常并不能处于同一细胞周期，这种差异使悬浮细胞的分裂、代谢以及生理生化状态等周期，这种差异使悬浮细胞的分裂、代谢以及生理生化状态等更趋复杂化更趋复杂化-

12、目前，通过一些物理和化学处理，可以使同一体系中的细胞目前，通过一些物理和化学处理，可以使同一体系中的细胞达到相对同步化达到相对同步化饥饿法：在一个培养体系中，如果细胞生长的基本成分丧失，饥饿法：在一个培养体系中，如果细胞生长的基本成分丧失，则导致细胞因饥饿而分裂受阻，从而停留在某一分裂时期；在则导致细胞因饥饿而分裂受阻，从而停留在某一分裂时期；在培养基中加入所缺乏的成分或者将饥饿细胞转入完整培养基中培养基中加入所缺乏的成分或者将饥饿细胞转入完整培养基中继代培养时细胞分裂又可重新恢复。继代培养时细胞分裂又可重新恢复。n 饥饿导致的细胞分裂受阻常常是使细胞不能合成饥饿导致的细胞分裂受阻常常是使细胞

13、不能合成DNA，即不能进入，即不能进入S期期或细胞分裂不能进行，即不能进入或细胞分裂不能进行，即不能进入M期。因此通过饥饿法可获得处于期。因此通过饥饿法可获得处于G1和和G2期的同步化细胞期的同步化细胞n 研究显示，当细胞处于氮饥饿时，通常获得研究显示，当细胞处于氮饥饿时，通常获得G1期的同步化细胞，而当细胞处于期的同步化细胞，而当细胞处于磷和碳饥饿时，通常获得磷和碳饥饿时，通常获得G1和和G2期的同步化细胞期的同步化细胞抑制剂法：通过一些抑制剂法：通过一些DNADNA合成抑制剂处理细胞，使细胞滞留在合成抑制剂处理细胞，使细胞滞留在DNADNA合成前期，当解除抑制后即可获得处于同一细胞周期合成

14、前期，当解除抑制后即可获得处于同一细胞周期G1G1期的同步化细胞。期的同步化细胞。n 常用抑制剂主要有常用抑制剂主要有5-氟脱氧尿苷（氟脱氧尿苷（FdU）和羟基尿（）和羟基尿（HU）n 通过抑制剂获得的同步化细胞基本处于同一个细胞周期，在除去抑制剂通过抑制剂获得的同步化细胞基本处于同一个细胞周期，在除去抑制剂后可以不进行分选直接培养，是一种简单便利的方法后可以不进行分选直接培养，是一种简单便利的方法分选法：是通过细胞体积大小分级，直接将处于相同细胞周期分选法：是通过细胞体积大小分级，直接将处于相同细胞周期的细胞进行分选，然后将同一状态的细胞继代培养于同一培养的细胞进行分选，然后将同一状态的细胞

15、继代培养于同一培养体系中，则可能保持相同培养体系中的细胞具有较好一致性。体系中，则可能保持相同培养体系中的细胞具有较好一致性。n 该方法操作简单，分选细胞维持了自然生长状态，不会有其它处理方法该方法操作简单，分选细胞维持了自然生长状态，不会有其它处理方法所带来的对细胞活力的影响；但细胞分选的精细程度较差所带来的对细胞活力的影响；但细胞分选的精细程度较差n 常规的细胞分选是采用梯度离心的方法，有时也采用筛网过滤法和梯度常规的细胞分选是采用梯度离心的方法，有时也采用筛网过滤法和梯度离心相结合的方法获得同步化细胞系；离心相结合的方法获得同步化细胞系；n 精细的分选可采用流式细胞仪精细的分选可采用流式

16、细胞仪低温处理：冷处理也可以提高培养体系中细胞同步化的程度。低温处理：冷处理也可以提高培养体系中细胞同步化的程度。OkamuraOkamura等曾采用此途径使胡萝卜悬浮细胞较好的同步化，而等曾采用此途径使胡萝卜悬浮细胞较好的同步化，而梅兴国等采用梅兴国等采用66低温处理红豆杉细胞也获得较明显的同步化低温处理红豆杉细胞也获得较明显的同步化效果。效果。二二 单细胞培养单细胞培养平板培养平板培养看护培养看护培养微室培养微室培养 双层滤纸培养双层滤纸培养（一）平板培养（一）平板培养（plating culture)plating culture) 平板培养是指将一定密度的悬浮细胞接种到一薄层平板培养是

17、指将一定密度的悬浮细胞接种到一薄层固体培养基中进行培养的技术。平板培养基上所得到的固体培养基中进行培养的技术。平板培养基上所得到的细胞团是由一个单细胞增殖而来，是优良单细胞株筛选细胞团是由一个单细胞增殖而来，是优良单细胞株筛选的常用方法。的常用方法。 1 1、单细胞的分离：可采用酶分离法，现多采用经培养的旺盛、单细胞的分离：可采用酶分离法，现多采用经培养的旺盛生长的悬浮细胞系，通过过滤去除大的细胞团，游离单细胞生长的悬浮细胞系，通过过滤去除大的细胞团，游离单细胞和小细胞团和小细胞团; ;2 2、单细胞悬浮液的制备：过滤后的细胞经培养基洗涤、单细胞悬浮液的制备：过滤后的细胞经培养基洗涤2 2次后

18、次后再调整密度为再调整密度为5x105x105 5个个/mL/mL左右左右; ;3 3、植板：将、植板：将1 1份已调整好密度的单细胞悬液与份已调整好密度的单细胞悬液与4 4份份3535的固体的固体培养基充分混合均匀，然后均匀的平铺于培养皿中，其厚度培养基充分混合均匀，然后均匀的平铺于培养皿中，其厚度约为约为5mm5mm左右。左右。n 平板培养的效果一般用植板率来衡量，植板率是指能长出平板培养的效果一般用植板率来衡量，植板率是指能长出 细胞团的单细胞在接种单细胞中所占的比例。细胞团的单细胞在接种单细胞中所占的比例。 植板率植板率=每个平板接种的细胞总数每个平板接种的细胞总数每个平板形成的细胞团

19、数每个平板形成的细胞团数X 100%固体培养基上置入一块活跃固体培养基上置入一块活跃生长的愈伤组织；生长的愈伤组织；在愈伤组织上放一小片滤纸在愈伤组织上放一小片滤纸待滤纸湿润后将细胞接种于待滤纸湿润后将细胞接种于滤纸上；滤纸上；当培养细胞长出小细胞团后当培养细胞长出小细胞团后将其直接转至琼脂培养基上将其直接转至琼脂培养基上让其迅速生长。让其迅速生长。（二）看护培养（二）看护培养(nurse culture)(nurse culture) （三）微室培养（三）微室培养微室培养（微室培养（micro-chamber culture），指人工制造一个），指人工制造一个小室并将单细胞培养在小室小室并将

20、单细胞培养在小室少量的培养基中，使其生长少量的培养基中，使其生长增殖的方法。它实际上是一增殖的方法。它实际上是一种微量细胞培养技术，主要种微量细胞培养技术，主要目的是进行单细胞活体连续目的是进行单细胞活体连续观察。观察。（四）双层滤纸植板培养（四）双层滤纸植板培养HorschHorsch等（等（19801980）将平板培养与饲养层培养技术相结合）将平板培养与饲养层培养技术相结合建立了双层滤纸植板培养方法。建立了双层滤纸植板培养方法。三三 细胞规模化培养细胞规模化培养u概述概述u规模化培养体系建立规模化培养体系建立u生物反应器类型及其特点生物反应器类型及其特点u规模化培养的技术问题规模化培养的技

21、术问题（一）概述（一）概述 在植物生物技术中，应用培养细胞系统合成有用在植物生物技术中，应用培养细胞系统合成有用的天然产物很可能发展为广义的化学工业的一个组成的天然产物很可能发展为广义的化学工业的一个组成部分。长期以来，植物一直是许多化学品主要资源，部分。长期以来，植物一直是许多化学品主要资源，特别是在制药和食品加工业中更是不可缺少。据不完特别是在制药和食品加工业中更是不可缺少。据不完全统计，至少有全统计，至少有20%20%左右的药物是由植物衍生而来的，左右的药物是由植物衍生而来的，而且每年都发现许多植物来源的新化合物。而且每年都发现许多植物来源的新化合物。n 植物次生代谢产物在医药、食品、轻

22、化工业等领域植物次生代谢产物在医药、食品、轻化工业等领域 具有重要意义具有重要意义n 李时珍（李时珍（15931593）在）在本草纲目本草纲目中所开列的中所开列的18921892种药物种药物中绝大多数是植物药物，目前仍有约中绝大多数是植物药物，目前仍有约25% 25% 的法定药品来自的法定药品来自植物，其药物有效成分均为次生产物。植物，其药物有效成分均为次生产物。n 许多植物次生代谢产物是优良食品添加剂和名贵化妆品许多植物次生代谢产物是优良食品添加剂和名贵化妆品原料；有些是生物毒素的主要来源，可用于杀虫、杀菌而原料；有些是生物毒素的主要来源，可用于杀虫、杀菌而对环境和人畜无害，是理想的环保产品

23、。对环境和人畜无害，是理想的环保产品。n 规模化细胞培养是生产植物次生产物的理想途径规模化细胞培养是生产植物次生产物的理想途径n 保护生态环境保护生态环境n 提高生产效率提高生产效率n 发展新型生物技术产业发展新型生物技术产业 自然植物和细胞培养的紫草宁含量比较自然植物和细胞培养的紫草宁含量比较 生产方式生产方式 生产周期生产周期紫草宁含量（紫草宁含量（%干重干重） 完整植株完整植株 23年年 1 2 植物细胞培养植物细胞培养 3周周 14n 植物细胞大规模培养的技术要求：植物细胞大规模培养的技术要求：n 从工程的角度讲必须要进一步研究和开发适宜于植物细胞从工程的角度讲必须要进一步研究和开发适

24、宜于植物细胞生长和生产的生物反应器，建立最佳的控制和调节系统。生长和生产的生物反应器，建立最佳的控制和调节系统。n 从培养技术方面讲必须满足以下三个条件：从培养技术方面讲必须满足以下三个条件：1 1、培养的细胞在遗传上是稳定的，以得到产量恒定的产物；、培养的细胞在遗传上是稳定的，以得到产量恒定的产物；2 2、细胞生长及产物合成的速度快，在较短时间内能得到较高、细胞生长及产物合成的速度快，在较短时间内能得到较高产量的终产物；产量的终产物；3 3、代谢产物要在细胞中积累而不被迅速分解，最好能够释放、代谢产物要在细胞中积累而不被迅速分解，最好能够释放到培养基中。到培养基中。（二）植物细胞规模化培养体

25、系的建立（二）植物细胞规模化培养体系的建立种子细胞的选择种子细胞的选择种子细胞的增殖与放大培养种子细胞的增殖与放大培养大规模培养体系的建立大规模培养体系的建立1 1、种子细胞的选择、种子细胞的选择外植体选择外植体选择高产细胞选择高产细胞选择v外植体选择外植体选择植物类型：在确定生产某一种化合物以后首先必须植物类型：在确定生产某一种化合物以后首先必须准确选择那些能够产生目的化合物的植物种类及其准确选择那些能够产生目的化合物的植物种类及其品种或单株。品种或单株。组织器官：起始细胞培养时应尽量选择自然状态下组织器官：起始细胞培养时应尽量选择自然状态下产生天然产物的器官、组织为外植体。产生天然产物的器

26、官、组织为外植体。v高产细胞系的选择高产细胞系的选择 悬浮细胞系悬浮细胞系 单细胞克隆单细胞克隆根据成分含量分析根据成分含量分析 种子细胞增殖种子细胞增殖采用单细胞培养方法采用单细胞培养方法n为了提高筛选效率，还可根据后续的培养条件适当为了提高筛选效率，还可根据后续的培养条件适当 增加选择压力，也可采用突变的方法进行高产突变增加选择压力，也可采用突变的方法进行高产突变 细胞系筛选。细胞系筛选。n李志勇等（李志勇等（20022002）直接利用起始培养细胞，挑选不同细胞团）直接利用起始培养细胞，挑选不同细胞团建立了建立了1010个大蒜细胞悬浮系，比较研究显示不同悬浮细胞系间个大蒜细胞悬浮系，比较研

27、究显示不同悬浮细胞系间SODSOD合成能力具显著差异，合成能力最高的细胞系可达合成能力具显著差异，合成能力最高的细胞系可达10.81x1010.81x106 6U/LU/L，最低只有，最低只有2.37x102.37x106 6U/LU/Ln梅兴国等（梅兴国等（20012001）通过在培养基中添加）通过在培养基中添加1.6mM/L1.6mM/L的的L-PheL-Phe，筛，筛选出了抗苯丙氨酸红豆杉细胞系，抗苯丙氨酸细胞系的紫杉醇选出了抗苯丙氨酸红豆杉细胞系，抗苯丙氨酸细胞系的紫杉醇含量高于原型细胞系的含量高于原型细胞系的3 35 5倍。倍。2 2、种子细胞的增殖与放大培养、种子细胞的增殖与放大培

28、养-可获得大量的活跃生长的细胞群体，为细胞大批量可获得大量的活跃生长的细胞群体，为细胞大批量 生产准备基础材料生产准备基础材料-为大体积反应器培养提供技术参数为大体积反应器培养提供技术参数n种子细胞增殖初期一般采用液体振荡培养，也称种子细胞增殖初期一般采用液体振荡培养，也称摇瓶培养。其摇瓶体积一般从几百毫升到几升逐级摇瓶培养。其摇瓶体积一般从几百毫升到几升逐级放大。此过程中应不断检测细胞放大培养中因培养放大。此过程中应不断检测细胞放大培养中因培养体积的增加所引起的细胞生长特性和目的产物含量体积的增加所引起的细胞生长特性和目的产物含量的变化情况；的变化情况；n细胞数量增加到一定数量后，应转移至体

29、积较小细胞数量增加到一定数量后，应转移至体积较小的生物反应器培养，模拟大规模培养控制条件。的生物反应器培养，模拟大规模培养控制条件。3 3、大规模培养体系的建立、大规模培养体系的建立 植物细胞大规模培养，根据一个培养周期中是否植物细胞大规模培养，根据一个培养周期中是否添加培养基可分为成批培养、连续培养和半连续培养添加培养基可分为成批培养、连续培养和半连续培养n 基本培养方式的选择应根据次生产物积累特点而定，通常基本培养方式的选择应根据次生产物积累特点而定，通常根据不同要求进行相应改进。比如当细胞生长和产物合成需根据不同要求进行相应改进。比如当细胞生长和产物合成需不同培养基时就要采用两步法建立培

30、养体系，先在细胞生长不同培养基时就要采用两步法建立培养体系，先在细胞生长培养基中培养大批量细胞，当细胞生长至合成产物的阶段后培养基中培养大批量细胞，当细胞生长至合成产物的阶段后再将其转入到产物合成培养基中培养，在产物合成阶段又可再将其转入到产物合成培养基中培养，在产物合成阶段又可采用连续培养方式以延长细胞生产时间。采用连续培养方式以延长细胞生产时间。成批培养成批培养 (batch culture)(batch culture)是指在一个培养体积中是指在一个培养体积中接种细胞和添加培养基后，中途不进行添加或更换接种细胞和添加培养基后，中途不进行添加或更换培养基的方式。培养基的方式。n 成批培养的

31、优点是培养装置和操作简单，但在培养过程中成批培养的优点是培养装置和操作简单，但在培养过程中细胞生长产物积累及培养基的物理状态常随时间变化而变化细胞生长产物积累及培养基的物理状态常随时间变化而变化培养检测十分困难。同时，成批培养的周期较短，一个培养培养检测十分困难。同时，成批培养的周期较短，一个培养周期后细胞和培养液可同时取出用于目的产物提取，下一个周期后细胞和培养液可同时取出用于目的产物提取，下一个培养周期必须重新接种种子细胞因此也增加了培养成本。培养周期必须重新接种种子细胞因此也增加了培养成本。连续培养连续培养(continuous culture)(continuous culture)是

32、在培养过程中不是在培养过程中不断向反应器中流加新鲜培养基，同时以相同的流量断向反应器中流加新鲜培养基，同时以相同的流量从系统中取出从系统中取出培养液培养液，从而维持培养系统内在细胞，从而维持培养系统内在细胞密度、产物浓度以及物理状态相对平衡，这种方式密度、产物浓度以及物理状态相对平衡，这种方式即称为连续培养。即称为连续培养。n 连续培养的最大优点是可以延长细胞培养周期，从而延长连续培养的最大优点是可以延长细胞培养周期，从而延长目的产物积累时间，增加目的产物产量。同时，由于系统进目的产物积累时间，增加目的产物产量。同时，由于系统进入稳定状态后细胞密度、基质、产物浓度等处于恒定，便于入稳定状态后细

33、胞密度、基质、产物浓度等处于恒定，便于对系统的检测。但连续培养装置相对较复杂，对反应器的设对系统的检测。但连续培养装置相对较复杂，对反应器的设计要求更高。计要求更高。半连续培养半连续培养(semi-continuous culture)(semi-continuous culture)是一种介于是一种介于成批培养和连续培养之间的培养方式。其基本方法成批培养和连续培养之间的培养方式。其基本方法是在完成上述成批培养的一个周期后，只从反应器是在完成上述成批培养的一个周期后，只从反应器中取出大部分细胞悬液，保留一小部分细胞悬液作中取出大部分细胞悬液，保留一小部分细胞悬液作为下一培养周期的种子细胞，然后

34、加入新鲜培养基为下一培养周期的种子细胞，然后加入新鲜培养基再进行培养。再进行培养。n 这种培养方式可以节省种子细胞培养的成本，同时保留的这种培养方式可以节省种子细胞培养的成本，同时保留的培养液也有利于细胞分裂启动。但大多数情况下，由于保留培养液也有利于细胞分裂启动。但大多数情况下，由于保留细胞悬液中细胞状态有较大差异，特别是有些衰老细胞不能细胞悬液中细胞状态有较大差异，特别是有些衰老细胞不能及时淘汰，从而会影响下一培养周期的细胞生长一致性。及时淘汰，从而会影响下一培养周期的细胞生长一致性。（三）（三） 生物反应器类型及特点生物反应器类型及特点n 所谓生物反应器是指高等生物细胞批量化培养所谓生物

35、反应器是指高等生物细胞批量化培养的装置及其相应控制系统。的装置及其相应控制系统。n 植物细胞培养反应器的设计，既要考虑有利于植物细胞培养反应器的设计，既要考虑有利于细胞生长，还要考虑有利于产物积累和分离。总细胞生长，还要考虑有利于产物积累和分离。总体上讲，适合植物细胞培养的反应器应具有体上讲，适合植物细胞培养的反应器应具有适宜适宜的氧传递的氧传递、良好的流动性良好的流动性和和较低的剪切力较低的剪切力。1搅拌式搅拌式反应器反应器固定化固定化 反应器反应器气动式气动式 反应器反应器n 机械搅拌式生物反应器是根据植物细胞特性在微生物发酵罐机械搅拌式生物反应器是根据植物细胞特性在微生物发酵罐的基础上改

36、进而成，适用范围广，混合程度高，但剪切力相对的基础上改进而成，适用范围广，混合程度高，但剪切力相对较大，中轴与罐体间易于泄露而污染；较大，中轴与罐体间易于泄露而污染；n 对搅拌浆的厚度、形状及搅拌速度等方面进行了改进，可以对搅拌浆的厚度、形状及搅拌速度等方面进行了改进，可以降低剪切力。一般改叶轮式为螺旋式；降低剪切力。一般改叶轮式为螺旋式；n 植物细胞生长周期长，需要随时补充水分和营养，必须设计植物细胞生长周期长，需要随时补充水分和营养，必须设计加液装置。由于植物细胞的生理活动需要新鲜空气，而且细胞加液装置。由于植物细胞的生理活动需要新鲜空气，而且细胞代谢也可能产生有害气体，所以必须设计通气装

37、置；代谢也可能产生有害气体，所以必须设计通气装置；n 为便于取样观察，一般还设计有取样口。为便于取样观察，一般还设计有取样口。 搅拌式生物反应器搅拌式生物反应器 叶轮搅拌式叶轮搅拌式气动式生物反应器气动式生物反应器n 考虑到机械搅拌式反应器的剪切力作用难以避免，考虑到机械搅拌式反应器的剪切力作用难以避免，同时搅拌器转动的中轴往往是容易使培养物污染的部同时搅拌器转动的中轴往往是容易使培养物污染的部位，因此发展出空气提升式生物反应器，但其缺点是位，因此发展出空气提升式生物反应器，但其缺点是搅拌不均匀。搅拌不均匀。1 1、 鼓泡式生物反应器：通过反应器底部的喷嘴以及鼓泡式生物反应器：通过反应器底部的

38、喷嘴以及多孔板实现气体分散促进培养容器的液体流动。剪切多孔板实现气体分散促进培养容器的液体流动。剪切力小，没有运动部件因而操作不易污染、放大容易，力小，没有运动部件因而操作不易污染、放大容易，但氧的利用率较低，混合不够均匀，液体流动与传质但氧的利用率较低，混合不够均匀，液体流动与传质性能检测困难。性能检测困难。2 2、 气升式生物反应器：通过空气循环搅拌培养液，气升式生物反应器：通过空气循环搅拌培养液，可保证良好的液体流动性及较高的氧传递效果，反应可保证良好的液体流动性及较高的氧传递效果，反应器结构和操作相对较简单，近年来在植物细胞规模化器结构和操作相对较简单，近年来在植物细胞规模化培养中广泛

39、使用。培养中广泛使用。固定化细胞生物反应器固定化细胞生物反应器n细胞固定化培养优势细胞固定化培养优势1 1、 可以较容易地控制培养系统的理化环境，从而可以较容易地控制培养系统的理化环境，从而可以研究特定的代谢途径并便于调节；可以研究特定的代谢途径并便于调节；2 2、 细胞位置的固定使其所处的环境类似于在植物细胞位置的固定使其所处的环境类似于在植物体中所处的状态，有利于次生产物的合成；体中所处的状态，有利于次生产物的合成；3 3、 可以从培养基中提取产物，免除了培养基中因可以从培养基中提取产物，免除了培养基中因含有过多初生产物而对细胞代谢的反馈抑制，延长含有过多初生产物而对细胞代谢的反馈抑制，延

40、长细胞生产周期同时可进行连续生产。细胞生产周期同时可进行连续生产。 n 细胞固定化培养技术按照其支持物不同可以分为细胞固定化培养技术按照其支持物不同可以分为 两大类：两大类：1 1、包埋式固定化培养系统、包埋式固定化培养系统: : 系统支持物多采用琼脂系统支持物多采用琼脂琼脂糖、海藻酸盐、聚丙烯酰胺等琼脂糖、海藻酸盐、聚丙烯酰胺等2 2、附着式固定化培养系统、附着式固定化培养系统: : 支持物多采用尼龙网、支持物多采用尼龙网、聚氨酯泡沫、中空纤维等材料聚氨酯泡沫、中空纤维等材料n 植物细胞固定化生物反应器植物细胞固定化生物反应器1 1 填充床反应器：细胞固定于支持物表面或内部，支持物填充床反应

41、器：细胞固定于支持物表面或内部，支持物颗粒堆叠成床，培养基在床层间流动。由于颗粒间的挤压颗粒堆叠成床，培养基在床层间流动。由于颗粒间的挤压容易造成颗粒破碎使填充床阻塞，同时存在混合不均匀、容易造成颗粒破碎使填充床阻塞，同时存在混合不均匀、床内氧传递速率低的缺点。床内氧传递速率低的缺点。2 2 流化床反应器：反应器中利用流质的能量使支持物颗粒流化床反应器：反应器中利用流质的能量使支持物颗粒处于悬浮状态，混合效果较好。但流体的切变力和颗粒的处于悬浮状态，混合效果较好。但流体的切变力和颗粒的碰撞场造成破损使细胞外流，同时流体力学的复杂性也使碰撞场造成破损使细胞外流，同时流体力学的复杂性也使其放大困难

42、。其放大困难。3 3 膜反应器：采用具有一定孔径和选择性透性的膜来固定膜反应器：采用具有一定孔径和选择性透性的膜来固定植物细胞相比说具有容易控制、易于放大、产物易分离等植物细胞相比说具有容易控制、易于放大、产物易分离等优点，但由于膜材料的限制，成本较高。优点，但由于膜材料的限制，成本较高。（四）（四） 植物细胞规模化培养中的有关工程技术问题植物细胞规模化培养中的有关工程技术问题1 1、悬浮培养系统必须适应植物细胞特性、悬浮培养系统必须适应植物细胞特性3 3、植物细胞培养过程中、植物细胞培养过程中o o2 2与与coco2 2调节调节4 4、泡沫和表面黏附性、泡沫和表面黏附性5 5、剪切力对植物

43、细胞的影响、剪切力对植物细胞的影响2 2、植物细胞培养液的流变特性、植物细胞培养液的流变特性黏度变化黏度变化n 植物细胞体积大，其平均直径比细菌大几十倍。同时，植物细胞体积大，其平均直径比细菌大几十倍。同时，植物细胞很少以单细胞形式悬浮生长，通常是以植物细胞很少以单细胞形式悬浮生长，通常是以2 2200200个个细胞、直径细胞、直径2mm2mm大小的非均相小细胞团方式存在；大小的非均相小细胞团方式存在；n 植物细胞纤维素细胞壁使其抗剪切能力相当弱；植物细胞纤维素细胞壁使其抗剪切能力相当弱；n 植物细胞生长速度慢，操作周期长，培养基复杂的营养植物细胞生长速度慢，操作周期长，培养基复杂的营养成分有

44、利于微生物生长，植物细胞培养中维持无菌环境的成分有利于微生物生长，植物细胞培养中维持无菌环境的难度较大但又十分重要。难度较大但又十分重要。n 培养液的黏度变化是由细胞密度和细胞状态变化引起的；培养液的黏度变化是由细胞密度和细胞状态变化引起的；n烟草培养液的表观黏度主要是由培养细胞密度引起的。当细胞密度烟草培养液的表观黏度主要是由培养细胞密度引起的。当细胞密度低于低于7g/L7g/L时，培养液的黏度基本保持不变，当细胞密度高于此值时，时，培养液的黏度基本保持不变，当细胞密度高于此值时，培养液的黏度就增加；培养液的黏度就增加；n长春花细胞培养，当细胞密度在长春花细胞培养，当细胞密度在10g/L10

45、g/L时，培养液属于假塑性流体，时，培养液属于假塑性流体，此时，培养液的黏度依赖于细胞年龄、形态和细胞团的大小。此时，培养液的黏度依赖于细胞年龄、形态和细胞团的大小。n 在相同物质浓度下，大细胞团的营养液表观黏度明显大于在相同物质浓度下，大细胞团的营养液表观黏度明显大于小细胞团培养液的表观黏度。小细胞团培养液的表观黏度。n 体积氧传递系数体积氧传递系数(K(KLaLa，单位时间单位体积氧量，单位时间单位体积氧量) )：如，在：如，在4L4L的气升式的气升式反应器中进行长春花细胞培养时，反应器中进行长春花细胞培养时，K KLaLa在在20h20h-1-1左右时，细胞生长与次生左右时，细胞生长与次

46、生产物合成均维持在良好状态；如，在产物合成均维持在良好状态；如，在15L15L的通风式反应器中培养的烟草的通风式反应器中培养的烟草细胞，细胞，K KLaLa值在值在5 510h10h-1-1的范围内随着的范围内随着K KLaLa的增加，生物量和代谢产物也的增加，生物量和代谢产物也呈线性增加；呈线性增加；n 溶氧浓度：在不同氧浓度下对毛地黄细胞进行培养，结果显示，当溶氧浓度：在不同氧浓度下对毛地黄细胞进行培养，结果显示，当培养基氧浓度从培养基氧浓度从10%10%饱和度上升至饱和度上升至30%30%时，细胞生长速率从时，细胞生长速率从0.15 d0.15 d-1-1上升上升至至0.20 d0.20

47、 d-1-1，如果溶氧浓度继续上升至，如果溶氧浓度继续上升至40%40%饱和度时，细胞生长速率反饱和度时，细胞生长速率反而下降至而下降至0.17 d0.17 d-1-1。n 植物细胞能非光合地利用植物细胞能非光合地利用COCO2 2，如在通气调节过程中，如在通气调节过程中，混入混入2%2%4%4%的的COCO2 2即能消除高通气速率对长春花细胞生长即能消除高通气速率对长春花细胞生长和产生代谢产物的不利影响。和产生代谢产物的不利影响。n 植物细胞大规模培养中易产生大量的泡沫，且覆盖有蛋白质植物细胞大规模培养中易产生大量的泡沫，且覆盖有蛋白质和粘多糖，细胞极易被包埋在其中从循环的培养液中带出来，和

48、粘多糖，细胞极易被包埋在其中从循环的培养液中带出来，形成非均相培养，从而影响培养系统的稳定性和生产率。形成非均相培养，从而影响培养系统的稳定性和生产率。n 化学消泡剂：化学消泡剂：-具有一定的表面张力和一定的亲水性，以使消泡剂对气具有一定的表面张力和一定的亲水性，以使消泡剂对气/ /液界面的液界面的分散系数足够大，消泡作用迅速有效；分散系数足够大，消泡作用迅速有效；-化学性质稳定，在水中的溶解度小，不与次生产物起任何化学反应化学性质稳定，在水中的溶解度小，不与次生产物起任何化学反应对植物细胞无毒害；对植物细胞无毒害；-不影响气体在营养液中的传递和溶解；不影响气体在营养液中的传递和溶解；-来源方

49、便，价格便宜来源方便，价格便宜；-常用的化学消泡剂包括天然油脂质、高级醇类、聚醚类和硅酮类，常用的化学消泡剂包括天然油脂质、高级醇类、聚醚类和硅酮类，实际应用中必须根据所培养的植物种类、次生产物特性等具体选择。实际应用中必须根据所培养的植物种类、次生产物特性等具体选择。n 机械消泡是靠机械装置实现的。优点是勿需在培养液中机械消泡是靠机械装置实现的。优点是勿需在培养液中加入其它物质，从而减少了由于消泡剂所引起的污染和加入其它物质，从而减少了由于消泡剂所引起的污染和对后续分离工艺的影响。但效果不如化学消泡迅速彻底对后续分离工艺的影响。但效果不如化学消泡迅速彻底同时也会增加培养装置的复杂性。同时也会

50、增加培养装置的复杂性。四四 培养细胞的次生代谢及产物积累培养细胞的次生代谢及产物积累植物次生代谢及其产物类型植物次生代谢及其产物类型提高细胞次生产物产量的途径提高细胞次生产物产量的途径 培养下的植物细胞次生产物积累特性培养下的植物细胞次生产物积累特性 合成生命活动必需物质的代谢过程称为合成生命活动必需物质的代谢过程称为初生代谢初生代谢 (primary (primary metabolism)metabolism) ，这是一类普遍存在于生物中的代谢类型，与生物，这是一类普遍存在于生物中的代谢类型，与生物生存有关的、涉及到能量产生和消耗的代谢类型。所生成的物质生存有关的、涉及到能量产生和消耗的代

51、谢类型。所生成的物质有糖类、脂类、核酸和蛋白质等，这些产物称为有糖类、脂类、核酸和蛋白质等，这些产物称为初生代谢产物初生代谢产物(primary metabolites(primary metabolites) )。（一）植物次生代谢及其产物类型（一）植物次生代谢及其产物类型 利用某些初生代谢产物产生的一类与植物生命活动无直接利用某些初生代谢产物产生的一类与植物生命活动无直接关系的小分子化合物如甙类、生物碱类、萜类、内酯类、酚类关系的小分子化合物如甙类、生物碱类、萜类、内酯类、酚类化合物等，它们称为化合物等，它们称为次生代谢产物次生代谢产物(secondary metabolites(seco

52、ndary metabolites) )把这个代谢过程称把这个代谢过程称次生代谢次生代谢(secondary metabolism)(secondary metabolism)。1 1、酚类化合物、酚类化合物包括黄酮类、醌类和简单酚类包括黄酮类、醌类和简单酚类n 许多许多黄酮类化合物是治疗心血管疾病和高血压的药物成分，黄酮类化合物是治疗心血管疾病和高血压的药物成分，异黄异黄酮类往往是植物抗毒素；酮类往往是植物抗毒素；n 醌类化合物按环系统不同可以分为苯醌、萘醌及蒽醌。醌是醌类化合物按环系统不同可以分为苯醌、萘醌及蒽醌。醌是植物呈现颜色的主要物质基础，有些醌类化合物具有抗菌、抗植物呈现颜色的主要

53、物质基础，有些醌类化合物具有抗菌、抗癌作用；癌作用；n 简单酚类广泛分布于植物的叶片及其他组织中，对植物发育简单酚类广泛分布于植物的叶片及其他组织中，对植物发育有一定的调节作用，有些酚类化合物是植物抗毒素的重要成分有一定的调节作用，有些酚类化合物是植物抗毒素的重要成分2 2、萜类化合物、萜类化合物n 萜类化合物是由异戊二烯单元组成的化合物，在植物体内萜类化合物是由异戊二烯单元组成的化合物，在植物体内通过异戊二烯途径合成，广泛分布于各类植物中，已知萜类通过异戊二烯途径合成，广泛分布于各类植物中，已知萜类化合物已超过化合物已超过2 2万种；万种；n 根据异戊二烯单元数目及其结构的不同可分为单萜、倍

54、半根据异戊二烯单元数目及其结构的不同可分为单萜、倍半萜、二萜、二倍半萜、三萜以及甾类化合物；萜、二萜、二倍半萜、三萜以及甾类化合物；n 单萜和倍半萜是植物挥发油和香料的主要成分。有的具有单萜和倍半萜是植物挥发油和香料的主要成分。有的具有重要药用价值如目前抗疟疾最佳药物青蒿素是一种倍半萜，重要药用价值如目前抗疟疾最佳药物青蒿素是一种倍半萜，抗癌药物紫杉醇则是二萜生物碱。植物体内三萜皂甙元和甾抗癌药物紫杉醇则是二萜生物碱。植物体内三萜皂甙元和甾体皂甙元分别与糖类结合可形成三萜体皂甙元分别与糖类结合可形成三萜皂甙皂甙和甾体皂甙，如人和甾体皂甙，如人参皂甙和薯蓣皂甙等。参皂甙和薯蓣皂甙等。3 3、含氮

55、化合物、含氮化合物n 含氮化合物主要包括生物碱、胺类、非蛋白质氨基酸和含氮化合物主要包括生物碱、胺类、非蛋白质氨基酸和生氰苷。其中生物碱是一类含氮的碱性天然产物，已知的生氰苷。其中生物碱是一类含氮的碱性天然产物，已知的生物碱已达生物碱已达5500种以上，多分布于双子叶植物中。种以上，多分布于双子叶植物中。n许多生物碱是药用有效成分，有些是植物抗毒素。目前许多生物碱是药用有效成分，有些是植物抗毒素。目前对生物合成途径研究比较清楚的有烟草的烟碱、毒藜碱和对生物合成途径研究比较清楚的有烟草的烟碱、毒藜碱和吡咯啶生物碱，毛莨科植物的小檗碱，以及曼陀罗植物的吡咯啶生物碱，毛莨科植物的小檗碱，以及曼陀罗植

56、物的莨菪碱和东莨菪碱。莨菪碱和东莨菪碱。（二）培养条件下的植物细胞次生产物积累的特性（二）培养条件下的植物细胞次生产物积累的特性n 生长偶联型生长偶联型 产物合成与细胞生长成正比。如长春花属产物合成与细胞生长成正比。如长春花属植物中长春花碱的合成、烟草细胞的烟碱合成，及薯蓣属植物中长春花碱的合成、烟草细胞的烟碱合成，及薯蓣属植物中的薯蓣皂甙的合成等；植物中的薯蓣皂甙的合成等；n中间型中间型 产物仅在细胞生长下降时合成，细胞处于指数产物仅在细胞生长下降时合成，细胞处于指数生长期或停止生长产物都不合成。蒽醌类物质合成的植物生长期或停止生长产物都不合成。蒽醌类物质合成的植物细胞，托品类生物碱类合成的

57、植物细胞等属于此类型；细胞，托品类生物碱类合成的植物细胞等属于此类型；n 非生长偶联型非生长偶联型 产物合成在细胞生长停止以后。紫草宁产物合成在细胞生长停止以后。紫草宁的合成属此类。的合成属此类。（三）提高细胞次生产物产量的途径（三）提高细胞次生产物产量的途径 1 1、选择适宜的起始材料、选择适宜的起始材料 包括适宜的植物种类和取材部位包括适宜的植物种类和取材部位n 东北红豆杉幼嫩茎、叶片及芽三种外植体形成的愈伤组织中，紫杉醇东北红豆杉幼嫩茎、叶片及芽三种外植体形成的愈伤组织中，紫杉醇含量比较显示，以叶片为外植体的愈伤组织，其紫杉醇含量是其它两种含量比较显示，以叶片为外植体的愈伤组织，其紫杉醇

58、含量是其它两种外植体形成的愈伤组织的外植体形成的愈伤组织的3 3倍。倍。n在茜草愈伤组织培养中，来源于叶柄和茎的愈伤组织其蒽醌的积累量在茜草愈伤组织培养中，来源于叶柄和茎的愈伤组织其蒽醌的积累量比来源于茎尖和叶的愈伤组织高。比来源于茎尖和叶的愈伤组织高。 2 2、选择适宜的培养基、选择适宜的培养基n 一般说来，增加培养基的一般说来，增加培养基的NN、P P和和K K浓度能促进细胞生长，而适当增加浓度能促进细胞生长，而适当增加糖浓度有利于次生产物的合成。如葡萄细胞培养中显示，低氮、高蔗糖糖浓度有利于次生产物的合成。如葡萄细胞培养中显示，低氮、高蔗糖浓度有利于酚类化合物积累。浓度有利于酚类化合物积

59、累。n 培养基硝态氮和氨态氮的比例对茶愈伤组织和儿茶素积累有明显影响，培养基硝态氮和氨态氮的比例对茶愈伤组织和儿茶素积累有明显影响，当当NO3NO3- -/NH4/NH4+ +的比值在的比值在7 7：3 3时，有利于愈伤组织生长，但对于儿茶素的时，有利于愈伤组织生长，但对于儿茶素的积累，则以全硝态氮为宜。积累，则以全硝态氮为宜。n 生长调节剂对次生代谢产物的影响随次生产物种类不同而有很大变化。生长调节剂对次生代谢产物的影响随次生产物种类不同而有很大变化。东北红豆杉细胞培养中，培养基添加一定浓度东北红豆杉细胞培养中，培养基添加一定浓度2 2，4-D4-D可显著提高细胞生长可显著提高细胞生长速率，

60、添加适当浓度速率，添加适当浓度BABA和和KAKA则可提高紫杉醇的积累。则可提高紫杉醇的积累。3 3、前体、前体(precursor)(precursor)的应用的应用n培养基中加入外源前体物质，可使目的产物产量提高；培养基中加入外源前体物质，可使目的产物产量提高；n选择适当前体物质。添加前体物质必须在充分了解目的产物代谢途径选择适当前体物质。添加前体物质必须在充分了解目的产物代谢途径的前提下，针对其合成的关键生化过程进行前体物质添加；的前提下，针对其合成的关键生化过程进行前体物质添加；n多数前体物质对细胞生长本身并不十分有利，因此，前体物质的添加多数前体物质对细胞生长本身并不十分有利，因此，