第一部分核酸的制备分离、纯化ppt课件

1、第一部分核酸的制备分别、纯化核酸的制备分别、纯化一、总论二、以质粒DNA为例谈DNA的分别纯化三、以真核生物为代表引见总RNA的纯化四、核酸的进一步纯化聚乙二醇、氯化铯梯度离心问题：分别核酸的根本根据、方法？核酸分别主要需求留意的是什么？DNA和RNA分别时的主要差别？不同的生物体中，核酸所处的环境不尽一样：1、核酸与蛋白质结合严密程度不同。2、DNA与RNA含量有差别。3、核酸分子量大小有差别。4、.由于核酸性质根本一样，生物体所组成的成分根本一样，因此，对于不同的生物体核酸的分别方法相差不大。以上是常见核苷酸构造，中性PH下的离子形状的钠盐方式。构造决议性质，性质是分别的根底。核酸的构造特

2、点：分子宏大，有共扼双键、氢键、苷键、和磷酸二酯键，自在氨基、磷酸基。核酸的二级构造：DNA双螺旋构造；RNA大多为单链，链的许多区域或本身发生回折，回折区内的多核苷酸段呈螺旋构造。核酸性质核酸性质与其构造和组分是亲密相关的分子量大小：RNA和DNA的分子量都很大。RNA分子量104-106 或者更大。DNA分子量1.6106-2.2 109 。性状和溶解度：DNA多为白色纤维状固体。RNA为白色粉末。都微溶于水，他们的钠盐在水中溶解度较大，都溶于2-甲氧乙醇，但不溶于普通有机溶剂如：乙醇、乙醚、氯仿、戊醇和三氯醋酸等。吸收光谱：具有共扼双键的嘌呤和嘧啶，故皆具有独特的紫外吸收光谱。核酸在24

3、0-260nm的紫外波段有剧烈的吸收峰。最大吸收值在260nm附近。经过OD260/OD280 的比值可判别样品的纯度。纯DNA的OD260/OD280 =1.8，纯RNA的OD260/OD280 =2.0。核酸中假设含杂蛋白或苯酚那么比值明显降低。对于纯核酸样品只需读出260nm的OD值，即可算出含量，通常：1OD260 =50ug/ml双螺旋DNA、 1OD260 =40ug/ml单螺旋DNA或RNA、 1OD260 =20ug/ml寡核苷酸。变性：加热、强酸碱或射线及一切可破坏核酸分子氢键的处置。变性后的核酸理化性质、生物功能都会有显著变化，最重要表现为粘度下降。降解：酸、碱、核酸酶都可

4、使核酸不同程度的降解。分别核酸共同要思索的防止核酸变性与降解：低温操作。分别过程需参与必要的核酸解聚酶的抑制剂如： 乙二胺四乙酸EDTA、柠檬酸盐、皂土、8-羟基喹啉、SDS、苯酚等脱蛋白：在生物体内核酸常与蛋白质结合以核蛋白方式存在 ，核酸所处的任何生物环境都含有蛋白质，所以在核酸纯化过程中需运用脱蛋白剂。如：氯仿、苯酚、SDS、蛋白酶等使蛋白质降解或变性，到达与核酸分别的目的。DNA和RNA的分别：1、利用DNA和RNA在不同盐浓度下，溶解度不同进展分别DNA在1-2M时溶解度大，RNA溶解度小。相反，RNA在低盐浓度0.14M时溶解度大，DNA小。2、经过运用DNA或RNA酶，到达DNA

5、和RNA分别的目的。3、根据分子量不同，进展梯度离心，进展分别。核酸的搜集： 多用乙醇、异丙醇质粒DNA纯化细菌培育 从LB琼脂扳上挑取一个单菌落。接种到含有适当抗生素的20ml液体LB中。37摇床培育过夜OD 0.6。 将上述培育液转入500ml含抗生素的液体LB培育基中。 37 300rpm 约34hrOD =0.4。 参与2.5ml 氯霉素34mg/ml溶于乙醇 ，使终浓度为170ug/ml。 300rpm 37 继续培育 1216hr。 离心 4 4000rpm 15min。 弃上清。 将细菌沉淀重悬于100ml预冷的STE中。 离心 4 4000rpm 15min。 弃上清，搜集细菌

6、细胞。 LB培育基 Trypone 10g Yeast extract 5g NaCl 10g 加水至1L STE：0.1mol/L NaCl 10mmol/L Tris.CLPH81mmol/L EDTAPH8 1、酚提取法：将收获的细胞重悬在20ml含20蔗糖的TES中。 参与新颖配制的溶菌酶到终浓度为1mg/ml枯草杆菌和大肠杆菌或5mg/ml苏芸金杆菌。37保温3090分钟，原生质游离出来。 向原生质溶液中加8SDS20ml和5M NaCl 10ml。 68保温5min。 将溶液储于4冰箱，8hr以上或过夜。 取出后，立刻在4离心18000rpm, 30min。 取上清。 向 上 清

7、中 参 与 等 体 积 的 重 蒸 酚PH67，轻摇。置冰箱15min，离心取水相。 反复一次。 再用等体积的氯仿异戊醇24：1抽提12次。离心取水相。 参与等体积的乙醚抽提12次。 向水相加两倍体积95冷乙醇。 20过夜或70半小时。 离心15000rpm, 20min, 沉淀DNA。 75的乙醇洗涤一次，室温或真空枯燥。 沉淀溶于PH8的TE缓冲液中。2、碱裂解法 将细菌沉淀重悬于10ml Slution 1中。 参与1ml新配制的溶菌酶。 参与20ml新配制Slution 2，充分混匀。 放置510min (0)。 参与15ml预冷的Slution 3 混匀 置冰上10min 离心，4，

8、10000rpm/min, 15min 取上清并参与0.6倍体积的异丙醇充分混匀 室温放置10分钟 离心，室温5000rpm, 15min 弃上清，用70乙醇洗涤弃乙醇，枯燥。 用3ml TE(PH8)溶解核酸沉淀可用氯化铯溴化乙锭梯度平衡离心或聚乙二醇沉淀继续纯化 Slution I 50mmol/L 葡萄糖 25mmol/L TrisCl(PH8) 10mmol/L EDTA(PH8) Slution20.2mol/L NaOH(用时用 10mol/L储存液稀释) 1SDS Slution35mol/L乙酸钾60ml冰乙酸 11.5ml水 28.5ml 3、煮沸裂解法： 将细菌沉淀物重悬于

9、预冷的10ml STET中 参与1ml(10mg/ml,溶于10mmol/L Tris,PH8)新配制的溶菌酶 室温下放置10分钟明火加热至沸腾，并不停摇摆 立刻将其浸入沸水中40秒 再将其浸入冰水中5分钟 离心，4 15000rpm,30min 取上清，用乙醇或异丙醇沉淀 可继续用氯化铯溴化乙锭梯度离心纯化 STET 0.1mol/L NaCl10mmol/L Tris.Cl(PH8) 1mmol/L EDTA(PH8) 5TritonX100 4、SDS裂解法： 将细菌沉淀物重悬于10ml，预冷的10蔗糖，50mmol/L Tris.Cl(PH8)溶液中 参与新配制的溶菌酶溶液参与8ml

10、0.25mol/L EDTA(PH8)溶液，摇匀。置冰上10分钟加4ml 10% SDS,马上用玻璃棒迅速混匀内容物。立刻参与6ml 5mol/L NaCl(使终浓度为1M混匀。置冰上 1hr离心 15000rpm, 30min取上清 酚：氯仿和氯仿各抽提一次取水相，并加两倍体积乙醇，混匀。放置室温下12小时 离心，4 5000rpm 20min。弃上清，用70乙醇洗涤离心，4 5000rpm 20min，取沉淀。用3ml TE(PH8) 溶解DNA可用氯化铯溴化乙锭梯度离心继续纯化DNA继续纯化聚乙二醇沉淀法纯化DNA：取3ml 溶于TE中的核酸溶液，参与3ml 预冷5mol/L LiCl溶

11、液，充分混匀。 离心，4 10000rpm 10min 取上清并参与等体积的异丙醇，混匀。离心，室温，10000rpm 10min弃上清，用70乙醇洗涤沉淀保管沉淀并用500ul含胰RNA酶20ug/ml的TEPH8溶解沉淀。室温放置半小时 参与500ul含13W/V聚乙二醇的1.6mol/LNaCl，充分混匀。离心，4 12000rpm 5min去上清，保管沉参与400ul TE(PH8)溶解沉淀 用酚、酚：氯仿、氯仿各抽提一次 取水相并参与100ul 10ml/L乙酸铵 混匀，并参与两倍体积乙醇室温放置10min离心，4 12000rpm 5min回收沉淀参与200ul 4的70乙醇，混匀

12、。弃上清，等乙醇蒸发殆尽500ul TEPH8溶解沉淀储存DNA于20或70DNA继续纯化1、氯化铯溴化乙锭梯度平衡离心法纯化闭环DNA延续梯度离心法准确丈量DNA溶液的体积按1g/ml的用量参与固体CsCl加热至30并温暖混匀。每10ml DNA溶液参与0.8ml溴化乙锭溶液10mg/ml溶于水立刻将其于DNA氯化铯溶液混匀离心，室温8000rpm 5min将下层清亮红色溶液转移到适当的离心管中用轻石蜡油加满，并封口。离心，20 45000rpm 16hr结果DNA继续纯化搜集闭环DNA从DNA中除去溴化乙锭2、不延续梯度离心： 此方法是将不同浓度的CsCl溶液分层加到离心管中， 这样可加速

13、CsCl梯度的构成，使离心时间减少到6hr。 从经过纯化的质粒DNA中去除溴化乙锭方法1：有机溶剂抽提 将DNA溶液放入试管中加等体积的饱和1丁醇或异戊醇振荡混匀两相离心，室温 1500rpm 3min取水相反复抽提46次直到粉红色从水相中和有机相中消逝。从经过纯化的质粒DNA中去除溴化乙锭方法2： 离子交换层析 如下图，用吸管装一支Dowex AG50树脂的柱子装柱前需将树脂进展平衡。平衡方法如下：1、适量Dowex AG50树脂溶于100ml 1mol/L NaOH中，搅拌5分钟，待树脂沉淀后，吸出上清弃去。2、加100ml 1mol/L HCl，继续搅拌5分钟，树脂沉淀后，吸出上清弃去。

14、3、用水反复步骤两次每次100ml，然后用TEN缓冲液100ml反复步骤2一次。TEN缓冲液： 0.1mol/L Tris.Cl(pH8.0)，0.01mol/L EDTA(pH8.0)，1 mol/L NaCl4、于4将树脂储存于含0.2%叠氮钠的TEN缓冲液中。 吸去树脂上的缓冲液，用2倍体积的TEPh8.0洗柱，将含有溴化乙锭和氯化铯的DNA直接加到树脂上。搜集流出物，当一切DNA溶液进入柱子后，用1.2倍柱体积洗脱，同时继续搜集流出物。 柱子流干后，将搜集的流出物用2倍体积的水稀释。 用6倍体积的乙醇，于4下，沉淀DNA 15分钟。 4，1200转/分 离心15分钟，搜集DNA沉淀。

15、用4的70%乙醇洗沉淀，按上步重新离心，取沉淀。 用适量TEpH8.0溶解DNA。RNA纯化中很重要的一个义务是：严厉控制RNA酶的活性！由于，一切的组织、人的手指、试剂、容器等中均存在或被污染RNA酶，所以，在对RNA纯化前，需做大量的预备任务。常运用的RNA酶的抑制剂：1 焦碳酸二乙酯DEPC：它是RNA酶的化学修饰试剂。它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反响而抑制酶活。2 异硫氰酸胍GITC：目前以为是制备RNA最有效的抑制剂。它除了对RNA酶有剧烈的变性作用外，还具有使细胞构造破坏，核酸从核蛋白中解离的作用。3 钒氧核苷酸复合物：是氧化钒离子和任何核苷构成的复合物。可与RNA酶结合，

16、而 抑制酶活。4 RNA酶抑制蛋白：是一种对RNA酶有抑制造用的蛋白质。其它如肝素、DTT、SDS等都是RNA酶的抑制剂，在RNA提纯中经常运用动物组织总RNA的制备 一、 试剂：变性液储存于棕色瓶中：配制体积：52.8ml 终浓度 储存液 异硫氰酸胍 4M 25g 柠檬酸钠 25mM 0.75M(pH7.0) 1.76ml 十二烷基氨酸钠 0.5% 10%(warm to 65) 2.64ml DEPC-ddH2O 29.3ml 以上混合液可放置室温下3个月。用前参与0.36ml 巯基乙醇。参与巯基乙醇后，室温下可运用1个月。 其于常规试剂配制不列举。 方法 ：杀死小鼠，放血。 迅速取出所需

17、组织按所需而定 用DEPC-ddH2O清洗一下，立刻仍到液氮中。 取4-5ml变性液入一洗净的研钵中备用从液氮中取出冻好的组织放入一不锈钢研钵中，倒入一些液氮，将其碾碎。在此过程中，需保证组织不解冻也可在有变性液存在下用组织匀浆机进展破碎。将已碾成粉末的组织转移至放有变性液的研钵中，迅速研磨并不断参与液氮，反复如此，直至组织完全碾碎。取数个已灭菌的新EP管中，各参与0.5ml 变性液和组织匀浆每EP管中参与50ul 3.0M NaAc(pH4.7)混匀轻弹。每EP管中参与500ul 水饱和酚，加氯仿-异戊醇49：1，100ul。旋涡混合器振动1分钟。冰浴 15分钟。12000转/分，4 20分

18、钟。转移上层水相至另一EP管中。 加等体积预冷的异丙醇 0/N-20。离心，12000转/分，20分钟。弃上清，沉淀溶于200ul 变性液中。参与10.8ul 3M NaAc(pH4.5) 加等体积水饱和酚及1/5体积的氯仿-异戊醇混合物旋涡混合1分钟，冰浴20分钟。离心 12000转/分，4 20分钟。转移水相至另一EP管中，加等体积异丙醇。-20 1小时。离心12000转/分，4 20分钟弃上清，沉淀加120ul变性液Vortex 溶解加等体积冷异丙醇，-20 1小时。离心12000转/分，4 20分钟弃上清，沉淀用75%乙醇悬浮离心12000转/分，4 10分钟弃上清，室温或真空枯燥。用DEPC-ddH2O溶解RNA检查RNA制备质量，测OD260/OD280用1-2ul样品电泳察看。在含有甲醛的凝胶中，进展RNA电泳是目前常用的方法。 甲醛凝胶电泳缓冲液： 20*硼酸缓冲液pH8.3 5*MOPS缓冲液(避光保管)0.4M 硼酸 0.1mol/L MOPS(pH7)10mM EDTA 40mmo