现代分子生物学技术

1、第七章 现代分子生物学技术（1） 第一节 聚合酶链式反应聚合酶链式反应 第二节第二节 物理图谱的构建物理图谱的构建第三节 基因组测序技术第四节 分子标记技术分子标记技术 第五节 基因表达研究技术第六节 DNA-蛋白质相互作用 研究技术第一节 聚合酶链式反应（ PolymerasePolymerase Chain Reaction Chain Reaction ，PCRPCR）PCRPCR最初的原始雏形概念类似于基因修复的复制，它是最初的原始雏形概念类似于基因修复的复制，它是于于19711971年由年由 Dr. Dr. Kjell Kleppe Kjell Kleppe 提出。他发表了第提出。他

2、发表了第一个单纯且短暂性基因复制（类似一个单纯且短暂性基因复制（类似PCRPCR前两个周期反前两个周期反应）的实验。而现今所发展出来的应）的实验。而现今所发展出来的PCRPCR则于则于19831983由由 Dr. Dr. KaryKary B. Mullis B. Mullis发展出的，发展出的，Dr. MullisDr. Mullis当年服当年服务于务于PEPE公司，因此公司，因此PEPE公司在公司在PCRPCR界有着特殊的地位。界有着特殊的地位。Dr. Mullis Dr. Mullis 并于并于19851985年与年与 Saiki Saiki 等人正式表了第等人正式表了第一篇相关的论文。

3、此后，一篇相关的论文。此后，PCRPCR的运用一日千里，相关的运用一日千里，相关的论文发表质量可以说是令众多其它研究方法难望的论文发表质量可以说是令众多其它研究方法难望其项背。随后其项背。随后PCRPCR技术在生物科研和临床应用中得以技术在生物科研和临床应用中得以广泛应用，成为分子生物学研究的最重要技术。广泛应用，成为分子生物学研究的最重要技术。MullisMullis也因此获得了也因此获得了19931993年诺贝尔化学奖。年诺贝尔化学奖。 一、PCR原理DNADNA的半保留复制是生物进化和传代的重要的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链途径。双链DNADNA在多种酶的作用下可以变在多种

4、酶的作用下可以变性解链，在性解链，在DNADNA聚合酶与引发子的参与下，聚合酶与引发子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现，分子挎贝。在实验中发现，DNADNA在高温时在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制化控制DNADNA的变性和复性，并设计引物做的变性和复性，并设计引物做引发子，加入引发子，加入DNADNA聚合酶、聚合酶、dNTPdNTP就可以完就可以完成特定基因的体外复制。成特定基因的体外复制。二、二、PCRPCR

5、步骤步骤标准的标准的PCRPCR过程分为三步：过程分为三步：1.1.DNADNA变性（变性（90-9690-96）：双链）：双链DNADNA模板在热模板在热作用下，作用下， 氢键断裂，形成单链氢键断裂，形成单链DNADNA2.2.退火（退火（25-6525-65）：系统温度降低，引物）：系统温度降低，引物与与DNADNA模板结合，形成局部双链。模板结合，形成局部双链。3.3.延伸（延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶酶（在（在7272左右左右最佳的活性）的作用下，以最佳的活性）的作用下，以dNTPdNTP为原料，从引物为原料，从引物的的55端端33端延伸，合成与模板互补的端延伸

6、，合成与模板互补的DNADNA链。链。每一循环经过变性、退火和延伸，每一循环经过变性、退火和延伸，DNADNA含量既含量既增加一倍。增加一倍。http:/ DNA 聚合酶DNA聚合酶（聚合酶（DNA polymerase I）最早于最早于1955年发现年发现 ，而较具有实验价值及实用性的而较具有实验价值及实用性的Klenow fragment of E. coli 则是于则是于70年代的初期由年代的初期由Dr. H. Klenow 所发现，但是，所发现，但是，DNA聚合酶和聚合酶和Klenow 酶在高温时会失活，因此，每次酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的循环都得加入新的DNA聚合酶

7、，不仅操作烦琐，而且聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。技术的应用和发展。 现今所使用的酶现今所使用的酶(简称简称 Taq polymerase), 则是于则是于1976年从年从 温泉中的细菌（温泉中的细菌（Thermus aquaticus）分离出来的。分离出来的。发现耐热发现耐热DNA聚合酶聚合酶-Taq酶对于酶对于PCR的应用有里程碑的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受的意义，该酶可以耐受90以上的高温而不失活，不需以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本

8、，大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于技术得以大量应用，并逐步应用于临床。临床。标准的标准的PCRPCR反应体系反应体系 10扩增缓冲液扩增缓冲液 10ul 4种种dNTP混合物混合物 各各200umol/L 引物引物 10100pmol 模板模板DNA 0.12ug Taq DNA聚合酶聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸水至加双或三蒸水至 100ulPCRPCR反应五要素反应五要素引物（引物（primer） 酶酶 （Taq DNA polymerase） dNTP （dATP, dGTP, dCTP, dTTP） 模板模板 （template） Mg2+

9、 （magnesium）PCR反应动力学 PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用 Y(1X)n 计算。 Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平均每次的扩增效率，n代表循环次数。 平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。PCR技术的发展q 定量定量PCRPCRq 荧光荧光PCRPCRq Touch-down PCRTouch-down PCRq RT-PCRRT-PCRq 兼并引物兼并引物PCRPCRq 巢氏巢氏PCRPCRq 反向反向PCRPCRq 不对称不对称PCRPCRq 原位原位PCRPCRq 连接酶链反应连接酶

10、链反应q RACE-PCRRACE-PCRq AFLPAFLPq 免疫免疫- -PCR(PCR(immunoimmuno-PCR)-PCR)q MSPMSP甲基化特异甲基化特异PCRPCR第二节第二节 物理图谱的构建物理图谱的构建一、定义及目的一、定义及目的1. 定义：定义： 物理图谱(physical map)是在DNA分子水平上描述染色体中界标间顺序和距离的 图 谱。 物理图谱是 DNA片段上限制性内切酶酶切位点的图谱，表示各种限制性内切酶识别位点在DNA序列上的线性排列（因此也称为限制性图谱）。2. 目的和意义：目的和意义： 构建物理图谱的目的是分离和鉴定单个基因或某些感兴趣的基因片段，

11、为基因组测序打下基础。 构建物理图谱是各种生物基因组计划的重要组成部分。 到目前为止末能发明直接对基因组DN A整体水平进行分析检测的技术，所以，只有将基因组DNA切割成小片段后插入不同的生物载 体再转染到一些生物体中使其稳定复制，分析其基因片段拷贝，对克隆群插入DNA片段按其 在原始基因组上线性顺序进行排序，构建物理图谱。 物理图谱的终极图谱是DNA序列图谱。二、 DNA物理图谱的构建方法测定物理图谱的方法主要包括： 部分酶解法； 交叉酶解法； 末端标记法； 片段杂交法等部分酶解法和交叉酶解法操作费时，现在已很少使用。1. 部分消化法部分消化法原理 用某一个限制酶对DNA进行完全消化和部分消

12、化，电泳分离酶解后DNA片段，然后通过进行比较片段的长度，构建物理图谱。例：细菌的一线性DNA片断长18.1kb,用EcoRI完全消化后, 走电泳，得到8个片端,而部分消化产生14个片断，求其物理图谱。完全消化的片断是： A (4.6) , B (4.0), C (3.3), D (2.5), E (2.0), F (1.0), G (0.5), H (0.2)部分消化的片断是； 6.6 6.5 5.3 4.6 4.2 4.0 3.8 3.5 3.3 2.5 1.0 0.7 0.5 0.2完全完全消化消化部分部分消化消化ABCDEFGH因部分消化的大片断是完全消化的小片断之和，从片段大小可得到

13、： 6.6=2+4.6(E + A), 6.5=2.5+4.0(D + B), 5.3=2+3.3(E + C)， 3.8=0.5+3.3(G + C), 0.7=0.2+0.5(G+H)4.2 有两种可能的组合： 4.20.2+4 (B+H) 或 4.2 =0.2+0.5+1.0+2.5 (H + F + G + D)3.5有三种可能的组合：3.51.02.5 (F + D) 3.5=0.5+1.0+2.0(G + F + E)3.5=0.2+3.3(H + C)A E C G H F D B4.6 2.0 3.3 2.5 4.00.5 0.2 1.0EcoR I 在此在此DNA片段片段上的酶切图谱上的酶切图谱2. 末端标记法末端标记法 待测DNA片