项目1配制斜面培养基

1、工程1ffl门旳iz、【匚卡十配制斜面培养学习目标1. 明确微生物细胞的化学组成、营养物质和营养类型，掌握斜面培养基的配制原理。2. 通过对根底培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法、步骤和灭菌。微生物同其他生物一样，需要不断从外界吸收营养物质，经过一系列的生物化学作用，获得能量并形成新的细胞物质、代谢产物，同时排出副产物及废物。不同的微生物对营养物质的需求也不一样。培养基 就是人工配制的供微生物或动植物细胞生长、繁殖、代谢和合成所需产物的营养物质和原料，当然，除此 之外，培养基也为微生物等提供适宜的生长环境条件。常用的培养基都必须满足或符合一些根本要求，包 括含有作为合成细胞成分的原料、满足

2、生化反响的条件、一定的pH等。因此，培养基的组成和配比是否恰当对微生物等的生长、繁殖、产物的形成、提取别离工艺的选择、产品质量和产量等都有很大的影响。优良的培养基可以充分发挥微生物细胞的生物合成能力，产生最好的效果。1 根底知识1.1 微生物细胞的化学组成及胞外代谢产物1.1.1 微生物细胞的化学组成微生物营养物质确实定，主要依据细胞的化学组成及所代谢产物的化学组成。因此，分析微生物细胞 的化学组成是了解微生物营养的根底。表1-1列出了几种微生物细胞的化学组成。fti-i 龍生物堀胞的代学组咸术分7583TO8C8590sdX干重72751415犠水化合曲1238276353021544010

3、-20681无机元當230氛I612由表可知，微生物细胞含有 80 %左右的水分和20%左右的干物质，它主要是由碳、氢、氧、氮等元素 组成，约占全部干物质的 90 %97 %，此外，还含有各种无机矿物质。而在微生物细胞的干物质中， 碳约占45 %55 %;氮在细菌和酵母中含量较高，约占7 %13 %,在霉菌中含量较低， 约占5 %。一般来说，碳和氮在微生物细胞化学组成中的比例大约为5: 1。而无机矿物质约占全部干重的50 %，其次是3%10%，其中以磷的含量最高，大多数微生物细胞中磷的含量可达全部灰分的钾、镁、钙、硫、钠等，铁、锌、锰、硼、钼、硅等的含量极微。1.1.2 微生物胞外代谢产物微生

4、物在生长过程中，除利用外源营养物质合成新的细胞外，还会产生一些有机化合物分泌到 微生物的体外，这些胞外代谢产物的种类繁多，且因微生物的种类而异。因此，了解这些代谢产物 的化学组成，极有助于微生物培养时的营养物质的选择和代谢产物的积累。一般来说，微生物的胞 外代谢产物主要包括下面四个局部。代谢副产物这类产物主要是指伴随微生物细胞正常代谢作用所产生的一些小分子化合物，通常是指嫌气培养过程的产物，这类物质包括CO 2、H2、CH 4等气体和乙醇、丙酮、丁醇、丙酸、乳酸等低分子量的醇类、脂肪酸类和酮类，其中许多物质是重要的化工原料。如表1-2微生物的代谢副产物。»1- 2微生购的犹谢副产軸产

5、葡容称用逮主要生产韵甲烷矣氏甲烷杆雷乙荐、异丙薛医药、化工匝料，世料爭异丙醉、丙酬、丁諄防碼剂、火腔溶剂、梢腔绅丁槪梭菌丙SL 丁醇、甘憾3：契的有机谱拥丙B丁醇梭菌甘袖r甘第静幣剂、帼懵剂、牝妆品、硝化甘油炸蔚«««甘第醉、乙醜舎枚轉脂、增旬刑等倉醋、化工原卿产醋餓杆菌印就、澤帙皮革、制造塑料和染料曲蓦歯和青歯乳酸我品乳酸医药卿牝工原料中间代谢产物这类代谢产物是指细胞在代谢途径中产生的用于合成蛋白质、核酸、类脂和多糖等细胞物质的 一些小分子物质，如氨基酸、核苷酸、有机酸和单糖的衍生物。中间代谢产物一般不分泌到微生物 体外，而只有当微生物细胞生物合成受阻或外源碳源

6、浓度较高的情况下，才会有大量的积累和外流。不少中间代谢产物也是重要的食品和化工原料。表3-5列出了一些常见中间代谢产物及用途。次级代谢产物这类代谢产物是指由微生物细胞合成的，分子比拟复杂的一些化合物，它既不参与细胞的组成,又不是酶的活性基团，也不是细胞的储存物质，它们中的大多数分泌于微生物的体外。这类产物的 种类很多，化学性质也各式各样。通常分为抗生素、毒素、激素和色素等几类。胞外水解酶类许多微生物可产生胞外水解酶类，这类水解酶包括淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、果胶酶、纤维素 酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖异构酶等。可用于食品、酿造、纺织、制革、医药和生化试剂等各个领 域。*1-3楡生繭的一些中阖代谢产轴

7、及用途产物容称主要产生鑑含威封脂、染料帑廉、染料代品坎料、化工原料黑曲霊医药棉病豪幕肌昔战产氮瓶杆菌1.2 微生物的营养物质和营养类型1.2.1 微生物的营养物质微生物的生长繁殖不但需要构成细胞物质和代谢产物有关的营养物质，还需要能提供能量来源的营养物质，以用于生化合成反响、维持细胞结构、建立细胞与环境间浓度梯度以及分子的主动运 输等。由微生物细胞的化学组成可知，微生物在其生命活动过程中，必须要有充足的水分，以及能 构成有机含碳化合物骨架的碳素来源构成蛋白质及其他含氮化合物的氮素来源和磷、硫、钙、镁、 钾、铁等多种矿物质元素。某些合成能力差的微生物还要有适当的生长辅助类物质，才能维持其正 常的

8、生长。那些能够满足机体生长繁殖和完成各种生理活动所需要的物质称为微生物的营养物质。 所以，微生物生长所需要的营养物质应该包括所有组成细胞的各种化学元素，以及参与细胞组成、 构成酶的活性成分与物质运输系统、提供机体进行各种生理活动所需的能量。同时，也只有提供必 须的和充足的养分，才能有效地积累代谢产物。碳源碳源是组成培养基的主要成分之一。其主要功能有两个：一是为微生物菌种的生长繁殖提供能源和合 成菌体所必需的碳成分；二是为合成目的产物提供所需的碳成分。常用的碳源有糖类、油脂、有机酸和低碳醇烃类、CO 2及CO 32盐等。在特殊的情况下如碳源贫乏时，蛋白质水解物或氨基酸等也可被微生物作为碳源使用。

9、微生物利用碳源物质具有选择性，糖类是一般微生物较容易利用的良好碳源和能源物质，但微生物对 不同糖类物质的利用也有差异，例如在以葡萄糖和半乳糖为碳源的培养基中，大肠杆菌Escherichia coli首先利用葡萄糖，然后利用半乳糖，前者称为大肠杆菌的速效碳源，后者称为 迟效碳源。目前在微生物工业发酵中所利用的碳源物质主要是单糖、饴糖、糖蜜制糖工业副产品、淀粉玉米粉、山芋粉、野生植物淀粉、麸皮、米糠等。为了节约粮食，人们已经开展了代粮发酵的科学研究，以自然界 中广泛存在的纤维素作为碳源和能源物质来培养微生物。不同种类微生物利用碳源物质的能力也有差异。有的微生物能广泛利用各种类型的碳源物质，而有些微

10、生物可利用的碳源物质那么比拟少，例如假单胞菌属Pseudomonas 中的某些种可以利用多达 90种以上的碳源物质，而一些甲基营养型微生物只能利用甲醇或甲烷等一碳化合物作为碳源物质。微生物利用的碳 源物质主要有糖类、有机酸、醇、脂类、烃、CO 2及碳酸盐等。 糖类糖类是发酵培养基中最广泛应用的碳源，主要有葡萄糖、糖蜜和淀粉糊精等。葡萄糖是最容易利用的 碳源，几乎所有的微生物都能利用葡萄糖，所以葡萄糖常作为培养基的一种主要成分，并且作为加速微生 物生长的一种有效糖。糖蜜是制糖生产时的结晶母液，它是制糖工业的副产物。糖蜜中含有丰富的糖、氮 类化合物、无机盐和维生素等，它是微生物发酵培养基价廉物美的

11、碳源。淀粉糊精等多糖也是常用的碳源，它们一般都要经过菌体产生的胞外酶水解成单糖后再被吸收利用。淀粉在发酵工业中被普遍使用，因为使 用淀粉除了可克服葡萄糖代谢过快的弊病，价格也比拟低廉。常用的淀粉为玉米淀粉、小麦淀粉和甘薯淀 粉。 脂肪油和脂肪也能被许多微生物作为碳源和能源。这些微生物都具有比拟活泼的脂肪酶。在脂肪酶的作用下，油或脂肪被水解为甘油和脂肪酸，在溶解氧的参与下，进一步氧化成CO 2和H20，并释放出大量的能量。 有机酸一些微生物对许多有机酸 如乳酸、柠檬酸、乙酸等有很强的氧化能力。因此有机酸或它们的盐也能 作为微生物的碳源。有机酸的利用常会使pH上升，尤其是有机酸盐氧化时，常伴随着碱

12、性物质的产生，使pH进一步上升，因此不同的碳源和浓度，不仅对微生物的代谢有影响，而且对整个发酵过程中pH的调节和控制也均有影响。 烃和醇类近年来随着石油工业的开展，微生物工业的碳源也有所扩大。正烷烃一般指从石油裂解中得到的 14 18碳的直链烷烃混合物已用于有机酸、氨基酸、维生素、抗生素和酶制剂的工业发酵中。另外石油工业 的开展促使乙醇产量的增加，国外乙醇代粮发酵的工艺开展也十分迅速。据研究发现自然界中能同化乙醇 的微生物和能同化糖质的微生物一样普遍，种类也相当多，从表4-4可见乙醇作碳源其菌体收得率比葡萄糖作碳源还高。因而乙醇已成功的应用在发酵工业的许多领域中，如乙醇已作为某些生产单细胞蛋白

13、工厂 的主要碳源。氮源氮源物质为微生物提供氮素来源，这类物质主要用来合成细胞中的含氮物质，一般不作为能源，只有 少数自养微生物能利用铵盐、硝酸盐同时作为氮源与能源。在碳源物质缺乏的情况下，某些厌氧微生物在 厌氧条件下可以利用某些氨基酸作为能源物质。能够被微生物利用的氮源物质包括蛋白质及其不同程度的 降解产物胨、肽、氨基酸等、铵盐、硝酸盐、分子氮、嘌呤、嘧啶、脲、胺、酰胺、氰化物等。常用的蛋白质类氮源包括蛋白胨 pept on e、鱼粉、蚕蛹粉、黄豆饼粉、花生饼粉、玉米浆、牛肉浸 膏(beef extract)、酵母浸膏(yeast extract) 等。微生物对这类氮源的利用具有选择性。例如，

14、土霉素产 生菌利用玉米浆比利用黄豆饼粉和花生饼粉的速度快，这是因为玉米浆中的氮源物质主要以较易吸收的蛋 白质降解产物形式存在，而降解产物特别是氨基酸可以通过转氨作用直接被机体利用，而黄豆饼粉和花生 饼粉中的氮主要以大分子蛋白质形式存在，需进一步降解成小分子的肽和氨基酸后才能被微生物吸收利 用，因而对其利用的速度较慢。因此玉米浆为速效氮源，有利于菌体生长；黄豆饼粉和花生饼粉作为迟效 氮源，有利于代谢产物的形成。在发酵生产土霉素的过程中，往往将两者按一定比例制成混合氮源，以控 制菌体生长时期与代谢产物形成时期的协调，到达提高土霉素产量的目的。微生物吸收利用铵盐和硝酸盐的能力较强，NH4 +被细胞吸

15、收后可直接被利用，因而(NH4)2SO4等铵盐一般被称为速效氮源，而NO3-被吸收后需进一步复原成NH4+后再被微生物利用。许多腐生型细菌、肠道菌、动植物致病菌等可利用铵盐或硝酸盐作为氮源，例如大肠杆菌、产气肠杆菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假 单胞菌等均可利用硫酸铵和硝酸铵作为氮源，放线菌可以利用硝酸钾作为氮源，霉菌可以利用硝酸钠作为 氮源。以(NH4)2SO4等铵盐为氮源培养微生物时，由于NH4+被吸收，会导致培养基 pH下降，因而将其称为生理酸性盐；以硝酸盐(如KNO 3)为氮源培养微生物时，由于 NO3-被吸收，会导致培养基 pH升高，因 而将其称为生理碱性盐。为防止培养基pH变化对微生物生长

16、造成不利影响，需要在培养基中参加缓冲物 质。常用的氮源可分为两大类：有机氮源和无机氮源。有机氮源除含有丰富的蛋白质、多肽和游离氨基酸 外，往往还含有少量的糖类、脂肪、无机盐、维生素及某些生长因子。由于有机氮源营养丰富，因而微生 物在含有机氮源的培养基中常表现出生长旺盛、菌丝浓度增长迅速的特点。有些微生物对氨基酸有特殊的 需要。大多数发酵工业借助于有机氮源，来获得所需的氨基酸。在赖氨酸生产中，甲硫氨酸和苏氨酸的存 在可提高赖氨酸的产量，但生产中常用黄豆水解液来代替。玉米浆 是一种很容易被微生物利用的良好氮源，因为它含有丰富的氨基酸(丙氨酸、赖氨酸、谷氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸等)、复原糖、磷、微量元

17、素和生长素。 玉米浆中含有的磷酸肌醇对促进红霉素、链霉素、青霉素和土霉素等的生产有积极作用。玉米浆是玉米淀粉生产中的副产物，其中固体物含量在50 %左右，还含有较多的有机酸，如乳酸，所以玉米浆的pH在4左右。由于玉米的来源不同，加工条件也不同，因此玉米浆的成分常有较大波动，在使用时应注意适当调配。尿素 也是常用的有机氮源，但它成分单一，不具有上述有机氮源的特点。但在青霉素和谷氨酸等生 产中也常被采用。尤其是在谷氨酸生产中，尿素可使a-酮戊二酸复原并氨基化，从而提高谷氮酸的生产。常用的无机氮源有铵盐、硝酸盐和氨水等。微生物对它们的吸收利用一般比有机氮源快，所以也称之 为迅速利用的氮源。但无机氮源

18、的迅速利用常会引起pH的变化，如：(NH4)2SO4 2NH3 十 H2SO4NaNO 3+4H2 NH3+2H2O+NaOH反响中所产生的NH3,被菌体作为氮源利用后，培养液中就留下了酸性或碱性物质。这种经微生物生理作用代谢后能形成酸性物质的无机氮源叫生理酸性物质，如硫酸铵；假设菌体代谢 后能产生碱性物质的那么此种无机氮源称为生理碱性物质，如硝酸钠。正确使用生理酸碱性物质，对稳定和 调节发酵过程的pH有积极作用。例如在制液体曲时，用NaNO 3作氮源，菌丝长得粗壮，培养时间短，且糖化力较高。这是因为NaNO 3的代谢而得到的NaOH可中和曲霉生长中所释放出的酸，使pH稳定在工艺要求的范围内。

19、又如在另一株黑曲霉发酵过程中用硫酸铵作氮源，培养液中留下的SO42使pH下降，而这对提高糖化型淀粉酶的活力有利，且较低的pH还能抑制杂菌的生长，防止污染。氨水 在发酵中除可以调节 pH夕卜，它也是一种容易被利用的氮源，在许多抗生素的生产中得到普遍使用。以链霉素为例，从其生物合成的代谢途径中可知：合成1 mol链霉素需要消耗7mol的NH3。红霉素生产中也有用通氨的，它可以提高红霉素的产率和有效组分的比例。氨水因碱性较强，因此使用时要防 止局部过碱，加强搅拌，并少量屡次地参加。另外在氨水中还含有多种嗜碱性微生物，因此在使用前应用 石棉等过滤介质进行除菌过滤。这样可防止因通氨而引起的污染。无机盐及

20、微量元素 无机盐及其生理功能无机盐是微生物生长必不可少的一类营养物质，它们在机体中的生理功能主要是作为酶活性中心的组成局部、维持生物大分子和细胞结构的稳定性、调节并维持细胞的渗透压平衡、 控制细胞的氧化复原电位和作为某些微生物生长的能源物质等表4-4。微生物生长所需的无机盐一般有磷酸盐、硫酸盐、氯化物以及含有钠、钾、钙、镁、铁等金属元素的化合物。 微量元素在微生物的生长过程中还需要一些微量元素，微量元素是指那些在微生物生长过程中起重要作用，而机体对这些元素的需要量极其微小的元素，通常需要量在10-610-8mol/L培养基中含量。微量元素一般参与酶的组成或使酶活化。微生物在生长繁殖和生产过程中

21、，需要某些无机盐和微量元素如磷、镁、硫、钾、钠、铁、氯、锰、锌、钴等，以作为其生理活性物质的组成或生理活性作用的调节物，这些物质一般在低浓度时对微生物生 长和产物合成有促进作用，在高浓度时常表现出明显的抑制作用。而各种不同的微生物及同种微生物在不 同的生长阶段对这些物质的最适浓度要求均不相同。因此，在生产中要通过试验预先了解菌种对无机盐和 微量元素的最适宜的需求量，以稳定或提高产量。 主要元素磷是核酸和蛋白质的必要成分，也是重要的能量传递者一一三磷酸腺苷的成分。在代谢途径的调节方面，磷起着很重要的作用，磷有利于糖代谢的进行，因此它能促进微生物的生长。但磷假设过量时，许多 产物的合成常受抑制。镁

22、 除了组成某些细胞叶绿素的成分外，并不参与任何细胞物质的组成。但它处于离子状态时，那么是 许多重要酶如己糖磷酸化酶、柠檬酸脱氢酶、羧化酶等的激活剂，镁离子不但影响基质的氧化，还影响蛋白质的合成。A、硫锌酸和谷硫 存在于细胞的蛋白质中，是含硫氨基酸的组成成分和某些辅酶的活性基，如辅酶胱甘肽等。在某些产物如青霉素、头孢菌素等分子中硫是其组成局部。所以在这些产物的生产培养基中， 需要参加如硫酸钠或硫代硫酸钠等含硫化合物作硫源。铁 是细胞色素、细胞色素氧化酶和过氧化氢酶的成分，因此铁是菌体有氧氧化必不可少的元素。工 业生产上一般用铁制发酵罐，这种发酵罐内的溶液即使不加任何含铁化合物，其铁离子浓度已可达

23、30卩g/mL。另外一些天然培养基的原料中也含有铁，所以在一般发酵培养基中不再参加含铁化合物。氯 离子在一般微生物中不具有营养作用，但对一些嗜盐菌来讲是需要的。在一些产生含氯代谢物如金霉素和灰黄霉素等的发酵中，除了从其他天然原料和水中带人的氯离子外，还需参加约0.1 %氯化钾以补充氯离子。啤酒在糖化时，氯离子含量在2060mg几范围内能赋予啤酒口味柔和， 并对酶和酵母的活 性有一定的促进作用，但氯离子含量过高会引起酵母早衰，使啤酒带有咸味。钠离子虽不参与细胞的组成，但仍是微生物发酵培养基的必要成分。钠离子与维持细胞渗透压有关，故在培养基中常参加少量钠盐，但用量不能过高，否那么会影响微生物生长。

24、钾离子也与细胞渗透压和透性有关，并且还是许多酶的激活剂，它能促进糖代谢。在谷氨酸发酵中，菌体生长时需要钾离子约 0.01 %，生产谷氨酸时需要量约为 0.02 %0.1 % 以K2SO4计。钙 离子能控制细胞透性，它不能逆转高浓度无机磷对某些产品如链霉素等的抑制作用。常用的碳酸 钙本身不溶于水，几乎是中性，但它能与代谢过程中产生的酸起反响，形成中性化合物和二氧化碳，后者 从培养基中逸出，因此碳酸钙对培养液的 pH有一定的调节作用。锌、钴、锰、铜等微量元素大局部作为酶的辅基和激活剂，一般来讲只有在合成培养基中才需参加这些元素。 添加方法 在培养基中，镁、磷、钾、硫、钙和氯等常以盐的形式如硫酸镁、

25、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、碳酸钙、氯化钾等参加，而钴、铜、铁、锰、锌、钼等缺少了对微生物生长固然不利，但因其需要 量很小，除了合成培养基外，一般在复合培养基中不再另外单独参加。因为复合培养基中的许多动、植物 原料如花生饼粉、黄豆饼粉、蛋白胨等都含有微量元素，但有些发酵工业中也有单独参加微量元素的，例 如生产维生素Bi2，尽管用的也是天然复合材料，但因钴是维生素B12的组成成分，因此其需要量是随产物量的增加而增加，所以在培养基中就需要参加氯化钴以补充钴。水对于发酵工厂来说，恒定的水源是至关重要的，因为在不同水源中存在的各种因素对微生物发酵代谢 影响甚大。特别是水中的矿物质组成对酿酒工业和淀粉糖化影

26、响更大。因此，在啤酒酿造业开展的早期， 工厂的选址是由水源来决定的。当然，尽管目前已能通过物理或化学方法处理得到去离子或脱盐的工业用 水，但在建造发酵工厂，决定工厂的地理位置时，还应考虑附近水源的质和量。水源质量的主要考虑参数包括pH值、溶解氧、可溶性固体、污染程度以及矿物质组成和含量。在抗4-7对深井水和地生素发酵工业中，一个高单位的生产菌种在异地不能发挥其生产能力的因素纵然很多，但由于水质不同而 导致这种结果也时有发生。又如在酿酒工业中，水质是获得优质酒的关键因素之一，表表水的水质进行了比拟。生长因子、前体、产物促进剂和抑制剂发酵培养基中某些成分的参加有助于调节产物的形成，这些添加的物质包

27、括生长因子、前体、产物抑制剂和促进剂。 生长因子从广义上讲，但凡微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生 长因子。生长因子不是对于所有微生物都必须的，它只是对于某些自己不能合成这些成分的微生物才是必 不可少的营养物。如以糖质原料为碳源的谷氨酸生产菌均为生物素缺陷型，以生物素为生长因子。又如目 前所使用的赖氨酸产生菌几乎都是谷氨酸产生菌的各种突变株，均为生物素缺陷型，需要生物素作为生长 因子，同时也是某些氨基酸的营养缺陷型，如高丝氨酸等，这些物质也是生长因子。根据生长因子的化学结构和它们在机体中的生理功能的不同，可将生长因子分为维生素vitamin、氨基酸与嘌呤及

28、嘧啶三大类。最早发现的生长因子在化学本质上是维生素，目前发现的许多维生素都能起到生长因子的作用。虽然一些微生物能合成维生素，但许多微生物仍然需要外界提供维生素才能生长。维生 素在机体中所起的作用主要是作为酶的辅基或辅酶参与新陈代谢；有些微生物自身缺乏合成某些氨基酸的能力，因此必须在培养基中补充这些氨基酸或含有这些氨基酸的小肽类物质，微生物才能正常生长。肠膜 明串珠菌生长需要 17种氨基酸才能生长，有些细菌需要D-丙氨酸用于合成细胞壁；嘌呤和嘧啶 作为生长因子在微生物机体内的作用主要是作为酶的辅酶或辅基，以及用来合成核苷、核苷酸和核酸。有机氮源是这些生长因子的重要来源，多数有机氮源含有较多的 B

29、簇维生素和微量元素及一些微生物生长不可缺少的生长因子。最有代表性的是玉米浆，玉米浆中含有丰富的氨基酸、复原糖、磷、微量元素 和生长素，是多数发酵产品良好的有机氮源，对许多发酵产品的生产有促进作用。从某种意义上来说，玉 米浆被用于配制发酵培养基是发酵工业中的一个重大发现。 前体前体指某些化合物参加到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程中结合到产物分子中去，而 其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因参加前体而有较大的提高。前体最早是从青霉素的生 产中发现的。在青霉素生产中，人们发现参加玉米浆后，青霉素单位可从20U/mL增加到100 U/mL，进一步研究后发现单位增长的主要原因是玉米

30、浆中含有苯乙胺，它能被优先合成到青霉素分子中去，从而提 高了青霉素G的产量。在实际生产中前体的参加不但提高了产物的产量，还显著提高了产物中目的成分的比重，如在青霉素生产中参加苯乙酸可生产青霉素G ,而用苯氧乙酸作为前体那么可生产青霉素V。大多数前体如苯乙酸对微生物的生长有毒性，以及菌体具有将前体氧化分解的能力，因此在生产中为 了减少毒性和增加前体的利用率常采用少量屡次的流加工艺。 产物促进剂产物促进剂是指那些非细胞生长所必需的营养物，又非前体，但参加后却能提高产量的添加剂。促进剂提高产量的机制还不完全清楚，其原因是多方面的。如在酶制剂生产中，有些促进剂本身是酶的诱导物；有些促进剂是外表活性剂，

31、可改善细胞的透性， 改善细胞与氧的接触从而促进酶的分泌与生产，也有人认为外表活性剂对酶的外表失活有保护作用；有些促进剂的作用是沉淀或螯合有害的重金属离子。各种促进剂的效果除受菌种、种龄的影响外，还与所用的培养基组成有关，即使是同一种产物促进剂，用同一菌株，生产同一产物，在使用不同的培养基时效果也会不一样。1.2.2 微生物的营养类型根据微生物对碳源和能源需求的不同，可将微生物分成光能自养、光能异养、化能自养和化能异养等四种类型。目前的大多数细菌、真菌、原生动物都是化能有机异养型微生物。值得注意的是， 的所有致病微生物都属于此种类型。必须明确，无论那种分类方式，不同营养类型之间的界限并非绝对的，

32、异养型微生物并非绝对不能利用CO 2,只是不能以CO 2为唯一或主要碳源进行生长，而且在有机物存在的情况下也可将CO 2同化为细胞物质。同样，自养型微生物也并非不能利用有机物进行生长。另外，有些微生物在不同生长条件下生长时，其营养类型也会发生改变，例如紫色非硫细菌(purple non sulphur bacteria)在没有有机物时可以同化CO 2,为自养型微生物，而当有机物存在时， 它又可以利用有机物进行生长， 此时它为异养型微生物。再如，紫色非硫细菌在光照和厌氧条件下可利用光能生长，为光能营养型微生物， 而在黑暗与好氧条件下，依靠有机物氧化产生的化学能生长，那么为化能营养型微生物。微生物

33、营养类型的可变性无疑有利于提高微生物对环境条件变化的适应能力。氢细菌既能在完全无机环境中利用氢的氧化所释放的能量将CO 2还原成有机物，又能在有机物存在的环境下异养生活。光能自养微生物细胞内含有能进行光合作用的光合色素；可以光作为能源、以某些无机物作氢受体复原CO 2来合成有机化合物的一类微生物属于光能自养型微生物，如藻类、蓝细菌、绿色细菌和紫色硫细菌等微生物就属此类。光能异氧微生物以光作为能源，利用有机物作为氢受体以复原CO 2合成有机物的一类微生物称为光能异养微生物，这类微生物生长时大多需要外源的生长辅助因素才能维持正常的生长发育。如红螺细菌利用异丙醇作为氢受体进行光合作用，并积累丙酮。化

34、能自养微生物以无机物氧化所产生的化学能作为能源，以CO 2作为唯一或主要碳源合成有机物的一类微生物称为化能异养微生物，它们能生长在完全的无机物环境中，分别氧化各自适宜的复原态无机物质，获取复原CO 2所需的能量。如硝化细菌、亚硝化细菌、硫化细菌、铁细菌和氢细菌等都屑于这类微生物。化能异养微生物以有机物作为碳源、以利用有机物氧化过程中的氧化磷酸化产生的ATP作为能源的微生物称为化能异养微生物。大多数细菌、全部放线菌、真菌和原生动物都属于这类微生物。目前在发酵生产 中应用的微生物大多属于这一营养类型。根据利用的有机物性质的不同，化能异养微生物又可分为腐生性和寄生性两类。一般将但凡能利 用不具有生命

35、活性的有机物作为营养物质而进行生长发育的微生物称为腐生性微生物。将必须在活 的机体内或离体的组织细胞内才能生存的微生物称为寄生性微生物。将一些既能生长在活体内又能 生长在死的有机体上的微生物称为兼性寄生微生物。1.3 培养基的类型及应用培养基(culture medium)是人工配制的，适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的营养基质。无论是以微生物为材料的研究，还是利用微生物生产生物制品，都必须进行培养基的配制，它是微生物学研究和微 生物发酵生产的根底。培养基成分和比例适宜与否，对微生物的生长发育、物质代谢、发酵产物的积 累以及生产工艺等都有很大的影响。培养基种类繁多，根据其成分、物理状态和用途可

36、将培养基分成多种类型。1按成分不同划分天然培养基这类培养基含有化学成分还不清楚或化学成分不恒定的天然有机物。牛肉膏蛋白胨培养基和麦芽汁培 养基就属于此类。基因克隆技术中常用的LB(Luria-Berta ni)培养基也是一种天然培养基。常用的天然有机营养物质包括牛肉浸膏、蛋白胨、酵母浸膏、豆芽汁、玉米粉、土壤浸液、麸皮、牛 奶、血清、稻草浸汁、羽毛浸汁、胡萝卜汁、椰子汁等。天然培养根本钱较低，除在实验室经常使用外， 也适于用来进行工业上大规模的微生物发酵生产。合成培养基合成培养基是由化学成分完全了解的物质配制而成的培养基，高氏I号培养基和查氏培养基就属于此 种类型。配制合成培养基时重复性强，但

37、与天然培养基相比其本钱较高，微生物在其中生长速度较慢，一 般适于在实验室用来进行有关微生物营养需求、代谢、分类鉴定、生物量测定、菌种选育及遗传分析等方 面的研究工作。半合成培养基那么是指以一局部天然物质作为碳源、氮源及生长辅助物质的来源，再适当补充少量的盐，经人工配制而成的一类培养基。这类培养基能适合很多微生物的正常生长，来源广泛， 价格也比拟廉价，已被广泛应用于微生物的大规模培养过程中。2.根据物理状态划分根据培养基中凝固剂的有无及含量的多少，可将培养基划分为固体培养基、半固体培养基和液体培养 基三种类型。固体培养基(solid medium)对绝大多数微生物而言，琼脂是最理想的凝固剂，琼脂

38、是由藻类(海产石花菜)中提取的一种高度分支的复杂多糖；明胶是由胶原蛋白制备得到的产物，是最早用来作为凝固剂的物质，但由于其凝固点太低， 而且某些细菌和许多真菌产生的非特异性胞外蛋白酶以及梭菌产生的特异性胶原酶都能液化明胶，目前已 较少作为凝固剂；硅胶是由无机的硅酸钠(NazSiOs)及硅酸钾(K2SQ3)被盐酸及硫酸中和时凝聚而成的胶体，它不含有机物，适合配制别离与培养自养型微生物的培养基。除在液体培养基中参加凝固剂制备的固体培养基外，一些由天然固体基质制成的培养基也属于固体培 养基。例如，由马铃薯块、胡萝卜条、小米、麸皮及米糠等制成固体状态的培养基就属于此类。又如生产 酒的酒曲，生产食用菌的

39、棉子壳培养基。在实验室中，固体培养基一般是参加平皿或试管中，制成培养微生物的平板或斜面。固体培养基为微 生物提供一个营养外表，单个微生物细胞在这个营养外表进行生长繁殖，可以形成单个菌落固体培养基常 用来进行微生物的别离、鉴定、活菌计数及菌种保藏等。半固体培养基(semisolid medium)半固体培养基中凝固剂的含量比固体培养基少，培养基中琼脂含量一般为0.2 %0.7 %。半固体培养基常用来观察微生物的运动特征、分类鉴定及噬菌体效价滴定等。液体培养基(liquid medium)液体培养基中未加任何凝固剂。在用液体培养基培养微生物时，通过振荡或搅拌可以增加培养基的通 气量，同时使营养物质

40、分布均匀。液体培养基常用于大规模工业生产以及在实验室进行微生物的根底理论 和应用方面的研究。3按用途划分根底培养基 (minimum medium)尽管不同微生物的营养需求各不相同，但大多数微生物所需的根本营养物质是相同的。根底培养基是含有一般微生物生长繁殖所需的根本营养物质的培养基。牛肉膏蛋白胨培养基是最常用的根底培养基。基 础培养基也可以作为一些特殊培养基的根底成分，再根据某种微生物的特殊营养需求，在根底培养基中加 入所需营养物质。加富培养基 (enrichment medium)加富培养基也称营养培养基，即在根底培养基中参加某些特殊营养物质制成的一类营养丰富的培养 基，这些特殊营养物质包

41、括血液、血清、酵母浸膏、动植物组织液等。加富培养基一般用来培养营养要求 比拟苛刻的异养型微生物，如培养百日咳博德氏菌(Bordetella pertussis)需要含有血液的加富培养基。加富培养基还可以用来富集和别离某种微生物，这是因为加富培养基含有某种微生物所需的特殊营养物质， 该种微生物在这种培养基中较其他微生物生长速度快，并逐渐富集而占优势，逐步淘汰其他微生物，从而 容易到达别离该种微生物的目的。从某种意义上讲，加富培养基类似选择培养基，两者区别在于，加富培 养基是用来增加所要别离的微生物的数量，使其形成生长优势，从而别离到该种微生物；选择培养基那么一 般是抑制不需要的微生物的生长，使所

42、需要的微生物增殖，从而到达别离所需微生物的目的。鉴别培养基(differential medium)鉴别培养基是用于鉴别不同类型微生物的培养基。在培养基中参加某种特殊化学物质，某种微生物在培养基中生长后能产生某种代谢产物，而这种代谢产物可以与培养基中的特殊化学物质发生特定的化学反 应，产生明显的特征性变化，根据这种特征性变化，可将该种微生物与其他微生物区分开来。鉴别培养基 主要用于微生物的快速分类鉴定，以及别离和筛选产生某种代谢产物的微生物菌种。常用的一些鉴别培养 基参见表4-13。选择培养基(selective medium)选择培养基是用来将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中别离出来的培

43、养基。根据不同种类微生物的特殊营养需求或对某种化学物质的敏感性不同，在培养基中参加相应的特殊营养物质或化学物质，抑 制不需要的微生物的生长，有利于所需微生物的生长。一种类型选择培养基是依据某些微生物的特殊营养需求设计的，例如，利用以纤维素或石蜡油作为唯一碳源的选择培养基，可以从混杂的微生物群体中别离出能分解纤维素或石蜡油的微生物；利用以蛋白质 作为唯一氮源的选择培养基，可以别离产胞外蛋白酶的微生物；缺乏氮源的选择培养基可用来别离固氮微 生物。另一类选择培养基是在培养基中参加某种化学物质，这种化学物质没有营养作用，对所需别离的微生物无害，但可以抑制或杀死其他微生物，例如，在培养基中加人数滴10%

44、酚可以抑制细菌和霉菌的生长，从而由混杂的微生物群体中别离出放线菌；在培养基中参加亚硫酸铋，可以抑制革兰氏阳性细菌和绝大多 数革兰氏阴性细菌的生长，而革兰氏阴性的伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphi)可以在这种培养基上生长；在培养基中加人染料亮绿 (brilliantgreen) 或结晶紫(crystal violet)，可以抑制革兰氏阳性细菌的生长，从 而到达别离革兰氏阴性细菌的目的；在培养基中参加青霉素、四环素或链霉素，可以抑制细菌和放线菌生 长，而将酵母菌和霉菌别离出来。2仪器设备、材料和工具的准备2.1 溶液或试剂葡萄糖，蛋白胨，酵母膏，NaCl，琼脂，1mol/NaOH , 1

45、mol/LHCI ，蒸馏水。2.2 器材试管，三角瓶，烧杯，量筒，玻棒，培养基分装器，天平，牛角匙，高压蒸气灭菌锅，pH试纸(pH 5.5 9.0)，棉花，牛皮纸，记号笔，麻绳，纱布等。3操作实例3.1 操作工程3.1.1 称量按培养基配方比例依次准确地称取葡萄糖0.5g、酵母膏0.5g、蛋白胨1.0g、NaCI0.25g 放入烧杯中。酵母膏常用玻捧挑取，放在小烧杯或外表皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯。也可放在称 量纸上，称量后直接放人水中，这时如稍微加热，酵母膏便会与称量纸别离，然后立即取出纸片。3.1.2 溶化在上述烧杯中先参加少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解，或

46、在磁力搅拌器上加热溶解。将药品完全溶解后，补充水到所需的总体积，如果配制固体培养基时，将称好的琼脂放入已溶的药品中，再加热溶化，最后补足所损失的水分。在制备用三角瓶盛固体培养基时，一般也可先将一定量的液体培养基分装于三角瓶中，然后按1.5 %2.0 %的量将琼脂直接分别参加各三角瓶中，不必加热溶化，而是灭菌和加热溶化同步进行，节省时间。3.1.3 调 pH在未调pH前，先用精密 pH试纸测量培养基的原始pH，如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/LnaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其 pH，直至pH达7.07.2。反之，用1mol/LHCI进行调节。对于有些要求pH较精确的微生物，

47、其pH的调节可用酸度计进行使用方法、可参考有关说明书。3.1.4 分装按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角烧瓶内。1液体分装分装高度以试管高度的1 / 4左右为宜。分装三角瓶的量那么根据需要而定，于般以不超过三角瓶容积的一半为宜，如果是用于振荡培养用，那么根据通气量的要求酌情减少；有的液体培养基在灭菌后，需要补加一定量的其他无菌成分，如抗生素等，那么装量一定要准确。2固体分装分装试管，其装量不超过管高的1 / 5，灭菌后制成斜面。分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。3半固体分装试管一般以试管高度的1 / 3为宜，灭菌后垂直待凝。3.1.5 加塞培养基分装完毕后，在试管口或

48、三角烧瓶口上塞上棉塞或泡沫塑料塞及试管帽等，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能棉塞制作方法附本实验后面。3.1.6 包扎加塞后，将全部试管用麻绳捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期。三角烧瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结形式扎好，使用时容易解开，同样用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期。有条件的实验室，可用市售的铝箔代替牛皮纸，省去用绳扎，而且效果好。3.1.7 灭菌将上述培养基以0.103MPa,121 C, 20min 高压蒸气灭菌。3.1.8 搁置斜面将灭菌的试管培养基冷至5

49、0 C左右以防斜面上冷凝水太多，将试管口端搁在玻棒或其他适宜高度的器具上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。3.1.9 无菌检查将灭菌培养基放入37 C的温室中培养 2448h，以检查灭菌是否彻底。摆斜面A：正确 B、C：不正罐工程2配制种子和发酵培养基学习目标1掌握培养基的配制原理和配置原那么。2.熟悉种子和发酵培养基的特点，学会选择配制种子和发酵培养基的原料。认识各种不同类型微生物的营养特性和共性，研究并配制适合各种微生物生长和代谢的工业培养基， 将大大有助于微生物菌体的培养及提高发酵产物的质量和产量。因此，设计和改良培养基，使之与其他培 养条件相适应，是保证微生物生长和产物生成的

50、关键步骤，而掌握微生物细胞的化学组成、营养物质的功 能、菌种的营养要求、发酵产物的化学分子结构、原料的质量、培养基的制备等均是获得优良培养基的必 要前提。1 根底知识1.1 培养基的选择不同的微生物对培养基的需求是不同的，因此，不同的微生物培养过程对原料的要求也是不一样的。应根据具体情况，从微生物对营养要求的特点和生产工艺的要求出发，选择适宜的培养基， 使之既能满足微生物生长的要求，又能获得高产的产品，同时也要符合增产节约、因地制宜的原那么。1. 微生物的特点来选择培养基用于大规模培养的微生物主要有细菌、酵母菌、霉菌和放线菌等四大类。它们对营养物质的要求不尽相同，有共性，也有各自的特性。在实际

51、应用时，可依据微生物的不同特性，来考虑 培养基的组成，对典型的培养基配方作必要的调整。2. 液体和固体培养基的选择液体和固体培养基各有用途，也各有优缺点。在液体培养基中，营养物质是以溶质状态溶解于水中，这样微生物就能更充分接触和利用营养物质，更有利于微生物的生长和更好地积累代谢产物。工业上，利用液体培养基进行的深层发酵具有发酵效率高、操作方便，便于机械化、自动化，降低 劳动强度、占地面积小、产量高等优点，所以发酵工业中大多数采用液体培养基培养种子和进行发 酵，并根据微生物对氧气的需求，分别作静止或通风培养。而固体培养基那么常用于微生物菌种的保 藏、别离、菌落特性鉴定、活细胞数测定等方面，此外，

52、工业上也常用一些固体原料，如小米、大 米、麸皮、马铃薯等直接制作成斜面或茄子瓶来培养霉菌、放线菌。3从生产实践和科学试验的不同要求选择生产过程中，从菌种的保藏、种子的扩大培养到发酵生产等各个阶段的目的和要求是不同的，因此，所选择的培养基成分配比也应该有区别。一般来说，种子培养基主要是供微生物菌体的生长 和大量增殖。为了在较短的时间内获得数量较多的强壮的种子细胞，种子培养基要求营养丰富、完 全，氮源、维生素的比例应较高，所用的原料也应是易于微生物菌体的吸收和利用，常用葡萄糖、 硫酸铵、尿素、玉米浆、蛋白胨、酵母膏、麦芽汁、米曲酶等作为原料配制培养基。而发酵培养基 除需要维持微生物菌体的正常生长外

53、，主要是要求合成预定的发酵产物，所以，发酵培养基中碳源 物质的含量往往要高于种子培养基，当然，如果产物是含氮物质，相应地应增加氮源物质的供给量， 除此之外，发酵培养基还应考虑便于发酵操作以及不影响产物的提取别离和产品的质量。4从经济效益选择生产原料从科学研究的角度出发，培养基的经济性通常是不被那么重视，而对于生产过程来讲，由于配制发酵培养基的原料大多是粮食、油脂、蛋白质等，且工业发酵消耗原料量大，因此，在工业发酵 中选择培养基原料时，除了必须考虑容易被微生物利用并满足生产工艺的要求外，还应考虑到经济 效益，必须以价廉物美、来源丰富、运输方便、就地取材以及没有毒性等为原那么选择配制培养基。1.2

54、 培养基的配制原那么1 选择适宜的营养物质总体而言，所有微生物生长繁殖均需要培养基含有碳源、氮源、无机盐、生长因子、水及能源，但由于微生物营养类型复杂，不同微生物对营养物质的需求是不一样的，因此首先要根据不同微生物的营养需 求配制针对性强的培养基。自养型微生物能从简单的无机物合成自身需要的糖类、脂类、蛋白质、核酸、 维生素等复杂的有机物，因此培养自养型微生物的培养基完全可以或应该由简单的无机物组成。培养其他化能自养型微生物与上述培养基成分根本类似，只是能源物质有所改变。对光能自养型微生物而言，除需要各类营养物质外，还需光照提供能源。培养异养型微生物需要在培养基中添加有机物，而 且不同类型异养型

55、微生物的营养要求差异很大，因此其培养基组成也相差很远。例如，培养大肠杆菌的培 养基组成比拟简单，而有些异养型微生物的培养基的成分非常复杂，如肠膜明串珠菌需要生长因子，假设配 制培养它的合成培养基时，需要在培养基中添加的生长因子多达33种，因此通常采用天然有机物来为它提供生长所需的生长因子。就微生物主要类型而言，有细菌、放线菌、酵母菌、霉菌、原生动物、藻类及 病毒之分，培养它们所需的培养基各不相同。在实验室中常用牛肉膏蛋白胨培养基或简称普通肉汤培养基培养细菌；用高氏I号合成培养基培养放线菌；培养酵母菌一般用麦芽汁培养基，它是将麦芽粉与4倍水混匀，在5865 C条件下保温34h至完全糖化，调整糖液

56、浓度为10 °巴林，煮沸后用纱布过滤，调pH 为6.0配制而成。麦芽粉组成复杂，能为酵母菌提供足够的营养物质；培养霉菌那么一般用查氏合成培养基。2营养物质浓度及配比适宜培养基中营养物质浓度适宜时微生物才能生长良好，营养物质浓度过低时不能满足微生物正常生长所需，浓度过高时那么可能对微生物生长起抑制作用，例如高浓度糖类物质、无机盐、重金属离子等不仅不能 维持和促进微生物的生长，反而起到抑菌或杀菌作用。另外，培养基中各营养物质之间的浓度配比也直接 影响微生物的生长繁殖和 或代谢产物的形成和积累，其中碳氮比C/N的影响较大。严格地讲，碳氮比指培养基中碳元素与氮元素的物质的量比值，有时也指培养基中复原糖与粗蛋白之比。例如，在利用微生 物发酵生产谷氨酸的过程中，培养基碳氮比为4/1时，菌体大量繁殖，谷氨酸积累少；当培养基碳氮比为3/1时，菌体繁殖受到抑制，谷氨酸产量那么大量增加。再如，在抗生素发酵生产过程中，可以通过控制培 养基中速效氮或碳源与迟效氮或碳源之间的比例来控制菌体生长与抗生素的合成协调