微波辅助萃取气相色谱质谱联用

1、微波辅助萃取微波辅助萃取气相色谱气相色谱质谱联用质谱联用 分析石蒜中的加兰他敏分析石蒜中的加兰他敏 指导老师：指导老师： 李攻科教授李攻科教授报告人：报告人： 汪军霞汪军霞1. 前言前言 u前苏联科学家首次分离出了加兰他敏。前苏联科学家首次分离出了加兰他敏。u加兰他敏是一种具有可逆性和选择性的加兰他敏是一种具有可逆性和选择性的乙酰胆碱酯酶抑制剂（乙酰胆碱酯酶抑制剂（AChE），可以），可以作为治疗作为治疗AD的药物。的药物。 1.1 加兰他敏及其氢溴酸盐的化学性质和组成加兰他敏及其氢溴酸盐的化学性质和组成分子式分子式 ：C17H21NO3 分子量分子量 ：287.36化学名称化学名称 ：4a,

2、5,9,10,11,12-Hexahydro-3-methoxy-11-methyl-6H-benzofuro3a,3,2-ef2benzazepin-6-ol 1.2 分析研究现状分析研究现状u药理作用研究概况药理作用研究概况u加兰他敏的传统提取方法加兰他敏的传统提取方法u加兰他敏的分析检测方法加兰他敏的分析检测方法1.2.1 药理作用研究概况药理作用研究概况u重症肌无力重症肌无力u脊髓前角灰质炎（小儿麻痹症）后遗症脊髓前角灰质炎（小儿麻痹症）后遗症u术后肠肌麻痹术后肠肌麻痹u尿潴留尿潴留 u解箭毒解箭毒u阿尔茨海默病阿尔茨海默病1.2.1.1 药理作用特点药理作用特点u具有可逆性和选择性的

3、乙酰胆碱酯酶抑具有可逆性和选择性的乙酰胆碱酯酶抑制剂（制剂（AChE）u作用时间长作用时间长u无毒性或致癌作用无毒性或致癌作用u 耐受性好耐受性好 1.2.2 加兰他敏的传统提取方法概述加兰他敏的传统提取方法概述u传统生产工艺：将石蒜通过乙醇热提，洗传统生产工艺：将石蒜通过乙醇热提，洗涤，萃取，重结晶，得到氢溴酸加兰他敏涤，萃取，重结晶，得到氢溴酸加兰他敏原料药。原料药。u缺点：能耗高、原辅料损耗大、生产周期缺点：能耗高、原辅料损耗大、生产周期 长，而且加兰他敏提取不完全。长，而且加兰他敏提取不完全。 1.2.3 加兰他敏的分析检测方法综述加兰他敏的分析检测方法综述u薄层色谱（薄层色谱（TLC

4、）u高效液相色谱（高效液相色谱（HPLC） u气相色谱法（气相色谱法（GC） u免疫分析法（免疫分析法（IA） u高效毛细管电泳高效毛细管电泳（HPCE）u联用方法联用方法1.3 微波辅助萃取技术微波辅助萃取技术u微波辅助萃取原理微波辅助萃取原理u微波辅助萃取特点微波辅助萃取特点u微波辅助萃取系统微波辅助萃取系统uMAE在植物提取中的应用在植物提取中的应用1.3.1 微波辅助萃取原理微波辅助萃取原理 u微波加热有两种机理：离子传导和偶极微波加热有两种机理：离子传导和偶极子转动。子转动。u物质吸收微波的程度主要取决于其介电物质吸收微波的程度主要取决于其介电常数，被萃取物质进入介电常数小，微常数，

5、被萃取物质进入介电常数小，微波吸收能力相对较差的萃取剂中波吸收能力相对较差的萃取剂中 。 1.3.2 微波辅助萃取特点微波辅助萃取特点u升温速度快升温速度快u加热均匀加热均匀u选择性好选择性好u萃取效率高萃取效率高u伴有生物效应伴有生物效应 1.3.3 微波辅助萃取系统微波辅助萃取系统 高压密闭微波萃取系统高压密闭微波萃取系统 ：u 磁控管磁控管u 波导管波导管u 微波腔微波腔u 波形搅拌器波形搅拌器u 循环装置循环装置u 转台转台 1.3.4 MAE在植物提取中的应用在植物提取中的应用 u最早的报道来自最早的报道来自1986年，匈牙利学者年，匈牙利学者Ganzler K用微波提取了羽扇豆、玉

6、米等作物中的油脂、用微波提取了羽扇豆、玉米等作物中的油脂、棉籽酚等有效成分棉籽酚等有效成分 。u国内外已有很多将国内外已有很多将MAE应用于中药中有效成应用于中药中有效成分提取的文献报道。分提取的文献报道。u本实验室的研究人员在这方面也做了大量的本实验室的研究人员在这方面也做了大量的工作。工作。 2 实验部分实验部分u仪器及操作条件仪器及操作条件u试剂和样品试剂和样品u样品处理过程样品处理过程u定性和定量定性和定量2.1 仪器及操作条件仪器及操作条件 仪器仪器uMars型微波炉型微波炉（CEM，USA）；）；uR201旋转蒸发仪（上海申科机械研究所）；旋转蒸发仪（上海申科机械研究所）；uHP-

7、6890GC-5973MSD配配G1701B.02.05工作站工作站（Hewlett-Packard，USA）;uDB-5MS熔融毛细管柱（熔融毛细管柱（J&W，CA）。）。操作条件操作条件u色谱条件：升温程序初温色谱条件：升温程序初温150 ，保持，保持3 min，以，以6 / min的速度升至的速度升至300 ，保持保持5 min。进样口温度。进样口温度250 ，不分流，不分流进样。载气为高纯氦气，流速进样。载气为高纯氦气，流速1.0 mL / min。u质谱条件：接口温度质谱条件：接口温度280 ，EI，电子，电子能量能量70 eV，离子源温度，离子源温度230 ，四极杆，四极杆

8、温度温度150 ，质量扫描范围，质量扫描范围50 550 amu。 2.2 试剂和样品试剂和样品u氢溴酸加兰他敏标准品购自氢溴酸加兰他敏标准品购自Sigma公司。公司。u甲醇、乙醇、石油醚（沸程：甲醇、乙醇、石油醚（沸程：90120 ）、乙醚、丙酮、乙酸乙酯、盐酸、）、乙醚、丙酮、乙酸乙酯、盐酸、浓氨水、碳酸钠（分析纯试剂，广州化浓氨水、碳酸钠（分析纯试剂，广州化学试剂厂）。学试剂厂）。u石蒜：鳞茎棕黑色片状物，有特殊香味石蒜：鳞茎棕黑色片状物，有特殊香味。2.3 样品处理过程样品处理过程u前处理：前处理： 粉碎，过筛，储存在干燥器中。粉碎，过筛，储存在干燥器中。u微波辅助萃取：定量称取样品放

9、入微波微波辅助萃取：定量称取样品放入微波罐中，加入一定体积的萃取溶剂，在一罐中，加入一定体积的萃取溶剂，在一定的控制温度下萃取一定的时间。取出定的控制温度下萃取一定的时间。取出萃取液，过滤，滤液旋干后甲醇溶解，萃取液，过滤，滤液旋干后甲醇溶解，定容至定容至5 mL。u乙醇加热回流萃取：准确称取乙醇加热回流萃取：准确称取1 g1 g石蒜石蒜样品，放入圆底烧瓶中，加入一定体积样品，放入圆底烧瓶中，加入一定体积的萃取溶剂，水浴加热回流的萃取溶剂，水浴加热回流2 h2 h后，冷后，冷却过滤，再旋转蒸发至近干，用甲醇定却过滤，再旋转蒸发至近干，用甲醇定容至容至5 mL5 mL，取，取1 L1 L用用GC

10、-MSGC-MS测定。测定。2.4 定性和定量定性和定量 采用未经衍生化采用未经衍生化的的GC-MS方法方法进行定性，以峰面积进行定性，以峰面积定量，不分流进样，进样量定量，不分流进样，进样量1 L。 图一图一 加兰他敏甲醇标准溶液色谱图加兰他敏甲醇标准溶液色谱图4.006.008.0010.0012.0014.0016.0018.0020.0022.0024.0026.0028.0030.0032.00020000040000060000080000010000001200000140000016000001800000200000022000002400000260000028000003

11、0000003200000340000036000003800000Time-AbundanceTIC: 0114S01.D 4.006.008.0010.0012.0014.0016.0018.0020.0022.0024.0026.0028.0030.0032.0002000004000006000008000001000000120000014000001600000180000020000002200000240000026000002800000300000032000003400000360000038000004000000Time-AbundanceTIC: 0115Y3MP.

12、D21 图二图二 石蒜样品的甲醇溶液色谱图（标记为石蒜样品的甲醇溶液色谱图（标记为1的是加兰他敏的是加兰他敏的峰）的峰）3 结果与讨论结果与讨论u微波萃取溶剂的选择微波萃取溶剂的选择u微波条件的优化微波条件的优化u微波辅助萃取方法的线性范围、检出限、微波辅助萃取方法的线性范围、检出限、回收率和精密度回收率和精密度u和传统方法的对比和传统方法的对比3.1 微波萃取溶剂的选择微波萃取溶剂的选择u正确选择萃取溶剂是实现高效率萃取的关键正确选择萃取溶剂是实现高效率萃取的关键 步骤。步骤。uMAE中，所选的溶剂应满足以下条件：中，所选的溶剂应满足以下条件： 1 具有吸收微波及将微波转化为热能的具有吸收微

13、波及将微波转化为热能的 能力；能力； 2 能够选择性的从样品基体中将待测物分离萃能够选择性的从样品基体中将待测物分离萃 取出来；取出来； 3 方便于后续处理过程方便于后续处理过程。 表表1 不同溶剂萃取效率的比较不同溶剂萃取效率的比较 溶剂溶剂 甲醇甲醇 乙醇乙醇丙酮丙酮 乙酸乙酯乙酸乙酯加兰他敏加兰他敏的含量的含量0.02320.0064 3.2微波条件的优化微波条件的优化 实验号实验号颗 粒 度颗 粒 度/mesh溶剂体积溶剂体积/ml辐射温度辐射温度/ C 辐射时间辐射时间 /min 峰面积峰面积相对峰面积相对峰面积 1 2040 10 65 511906302 36.8 2 2040

14、20 75 1521394576 66.1 3 2040 30 85 2527012145 83.5 4 4060 10 75 2522631878 69.9 5 4060 20 85 532366940 100 6 4060 30 65 1531475106 97.2 7 60 10 85 1518904841 58.4 8 60 20 65 2521981459 67.9 9 60 30 75 525350629 78.3表表2 微波萃取条件的正交实验设计及峰面积结果（微波萃取条件的正交实验设计及峰面积结果（OAD9(43)） 表表3 各因素不同水平对应的峰面积之和及平均值（各因素不同水平

15、对应的峰面积之和及平均值（% ）注：注：Ki峰面积之和；峰面积之和；ki峰面积平均值。峰面积平均值。 颗粒度颗粒度 mesh 溶剂体积溶剂体积 mL 辐射温度辐射温度 辐射时间辐射时间minK1 60313023 53443021 65362867 69623871K2 86473924 75742975 69377083 71774523K3 66236929 83837880 78283926 71625482k1 20104341 17814340 21787622 23207957k2 28824641 25247658 23125694 23924841k3 22078976 279

16、45960 26094642 23875161 图三图三 颗粒度、溶剂体积、控制温度、辐射时间于萃取效率的影响颗粒度、溶剂体积、控制温度、辐射时间于萃取效率的影响 0.00E+001.00E+072.00E+073.00E+074.00E+075.00E+076.00E+077.00E+078.00E+079.00E+07回收率颗粒度溶剂体积辐射温度辐射时间影响因素水平1水平2水平3 表表4 优化的微波萃取条件优化的微波萃取条件 颗粒度颗粒度mesh溶剂体积溶剂体积 mL辐射温度辐射温度 辐射时间辐射时间 min 4060 20 8553.3 微波辅助萃取方法的线性范围、微波辅助萃取方法的线性

17、范围、检出限、回收率和精密度检出限、回收率和精密度 表表5 线性范围、检出限、回收率和精密度线性范围、检出限、回收率和精密度线性方程线性方程Y=3.3048E5X1.2784E7线性相关系数线性相关系数R0.9996线性范围线性范围10 100 mgL-1检出限检出限3.42 mgL-1回收率回收率99.3 %RSD7.9 %(n=6)3.4 和传统方法的对比和传统方法的对比 表表6 微波萃取法与乙醇加热回流萃取法测定微波萃取法与乙醇加热回流萃取法测定加兰他敏的结果比较加兰他敏的结果比较 加兰他敏的含量加兰他敏的含量/ mgL-1 RSD/%(n=6)萃取时间萃取时间/min微波萃取法微波萃取

18、法 96.64.45 乙醇加热回乙醇加热回流萃取法流萃取法99.4 9.91204. 结论结论 本实验建立了本实验建立了MAEMAEGCGCMSMS分析石蒜中加兰分析石蒜中加兰他敏的方法，并且利用正交设计实验优化了他敏的方法，并且利用正交设计实验优化了微波萃取测定石蒜样品中加兰他敏的条件微波萃取测定石蒜样品中加兰他敏的条件, ,方方法平均回收率法平均回收率99.3 %99.3 %，检出限，检出限3.42 mg3.42 mgL L-1-1，RSD = 4.4 %RSD = 4.4 %，线性范围，线性范围10 10 100 mg 100 mgL L-1-1。将。将本方法与乙醇加热回流提取法相比，结果表本方法与乙醇加热回流提取法相比，结果表明本方法省时、精密度好、操作简便，适合明本方法省时、精密度好、操作简便，适合于石蒜中加兰他敏的快速测定。于石蒜中加兰他敏的快速测定。 致致 谢谢 u在本论文的研究工作和写作过程中，得到了许多人的在本论文的研究工作和写作过程中，得到了许多人的指导、关心和帮助。指导、关心和帮助。u首先，要衷心感谢我的导师李攻科教授，感