实验四DNA回收纯化及重组体的构建

1、实验四实验四 DNA回收纯化及重组体的构建回收纯化及重组体的构建实验目的和要求实验目的和要求学习和掌握从学习和掌握从PCRPCR产物中回收产物中回收DNADNA片段的方法。片段的方法。并了解从琼脂糖凝胶中纯化并了解从琼脂糖凝胶中纯化DNADNA片段的有关技片段的有关技术。术。本实验采用粘末端连接法将本实验采用粘末端连接法将PCRPCR扩增的扩增的DNADNA片段片段插入到插入到pBluescriptpBluescript KS KS质粒载体中，掌握质粒载体中，掌握DNADNA重组方法。通过本实验了解重组方法。通过本实验了解DNADNA重组技术在分重组技术在分子生物学研究中的重要意义。子生物学研

2、究中的重要意义。 DNA片段的纯化：片段的纯化： DNA纯化的主要目的是纯化的主要目的是回收得到纯的目的回收得到纯的目的DNA片段，去除影响片段，去除影响DNA连接酶活性的物质以及其它的连接酶活性的物质以及其它的DNA片片段。纯化段。纯化DNA片段的方法有多种，如：电片段的方法有多种，如：电洗脱法、从低熔点或普通琼脂糖凝胶中回洗脱法、从低熔点或普通琼脂糖凝胶中回收、玻璃珠纯化、柱层析以及硅胶吸附等收、玻璃珠纯化、柱层析以及硅胶吸附等方法。目前一些生物公司推出了直接从方法。目前一些生物公司推出了直接从 PCR产物中或琼脂糖凝胶中回收产物中或琼脂糖凝胶中回收DNA片段片段的试剂盒，有效地加快了的试

3、剂盒，有效地加快了DNA的纯化的速的纯化的速度。度。相关基础知识相关基础知识 DNA重组本质上是一个酶促生化过程，是指重组本质上是一个酶促生化过程，是指将外源目的基因片段通过将外源目的基因片段通过DNA连接酶的的作连接酶的的作用插入到质粒载体中的过程。用插入到质粒载体中的过程。DNA片段只有片段只有与载体重组并转入合适的宿主细胞中才能进与载体重组并转入合适的宿主细胞中才能进行复制。通过此方法可以对单个基因的功能行复制。通过此方法可以对单个基因的功能进行研究。结合进行研究。结合PCR技术还可以应用于疾病技术还可以应用于疾病诊断、合成具有商业意义的产品，如胰岛素、诊断、合成具有商业意义的产品，如胰

4、岛素、干扰素等。干扰素等。DNA重组重组因为载体具有能够在特定宿主细胞中独立自我因为载体具有能够在特定宿主细胞中独立自我复制的复制起始点，保证插入的外源片段的复复制的复制起始点，保证插入的外源片段的复制；并且具有多个限制性内切酶的单一位点，制；并且具有多个限制性内切酶的单一位点，即多克隆位点，用于插入外源片段，而又不破即多克隆位点，用于插入外源片段，而又不破坏质粒本身的结构；还具有易于筛选和检测的坏质粒本身的结构；还具有易于筛选和检测的标记性基因，如抗药性基因、酶基因或营养缺标记性基因，如抗药性基因、酶基因或营养缺陷型等。但针对不同的研究目，选择的择载体陷型等。但针对不同的研究目，选择的择载体

5、也是不同的，不仅要考虑上述特性，而且还要也是不同的，不仅要考虑上述特性，而且还要考虑所选载体是表达载体还是非表达载体、是考虑所选载体是表达载体还是非表达载体、是真核生物表达载体还是原核生物表达载体以及真核生物表达载体还是原核生物表达载体以及酶切位点等方面的问题。酶切位点等方面的问题。载体的选择：载体的选择：主要有两种：主要有两种：T4T4噬菌体噬菌体DNADNA连接酶和大肠杆连接酶和大肠杆菌菌DNADNA连接酶。连接酶。E. coliE. coli DNA DNA 连接酶催化连接酶催化DNADNA分子连接的机理与分子连接的机理与T4T4噬菌体噬菌体DNADNA连接酶连接酶基本相同，只是辅助因子

6、不是基本相同，只是辅助因子不是ATPATP而是而是NADNAD+ +。T4T4噬茵体噬茵体DNADNA连接酶催化连接酶催化DNADNA连接反应分为连接反应分为三步。三步。DNA连接酶连接酶 T4噬菌体噬菌体DNA连接酶还有一种连接酶还有一种E. coli DNA连接酶没有的特性即将两个平末端的连接酶没有的特性即将两个平末端的双链双链DNA分子连接起来的功能。对于这种分子连接起来的功能。对于这种连接反应的机理目前还不清楚，总的来说连接反应的机理目前还不清楚，总的来说这种连接的效率比粘性末端的连接效率要这种连接的效率比粘性末端的连接效率要低得多，可能是因为平末端低得多，可能是因为平末端DNA分子无

7、法分子无法形成类似粘性末端分子那样的相对稳定的形成类似粘性末端分子那样的相对稳定的结构。结构。1.1. WeissWeiss单位（单位（WeissWeiss等等,1968,1968），是指在），是指在3737o oC C下下2020分钟内催化分钟内催化1nM 1nM 3232P P从焦磷酸根置换到从焦磷酸根置换到 , , - -3232P P ATPATP所需酶量；所需酶量；2.2. （NEBNEB公司，粘性末端）将公司，粘性末端）将1 1 g g由由HindHindIIIIII酶解酶解的的 DNADNA的的1212碱基对粘性末端在碱基对粘性末端在16160 0C C条件下、条件下、3030分

8、钟、分钟、2020 l l反应体系中连接反应体系中连接5050时所需酶量。时所需酶量。3.3. (Takara(Takara公司公司) )在在2020 l l的反应体系中，的反应体系中，6 6 g g的的 DNA-DNA-HindHindIIIIII的分解物在的分解物在16160 0C C反应反应3030分钟时，分钟时，有有9090以上的以上的DNADNA片段进行连接的酶的活性为片段进行连接的酶的活性为1U1U。 相当于相当于 ATP-PpiATP-Ppi交换反应中交换反应中0.008 Weiss U0.008 Weiss U。对于对于T4-T4-噬菌体噬菌体DNADNA连接酶的活性测定至少有

9、连接酶的活性测定至少有三种以上的方法：三种以上的方法：连接反应的一项重要参数是温度。理论上连接反应的一项重要参数是温度。理论上讲连接反应的最佳温度是讲连接反应的最佳温度是37，此时连接，此时连接酶的活性最高。但酶的活性最高。但37时粘性末端分子形时粘性末端分子形成的配对结构极不稳定，因此人们找到了成的配对结构极不稳定，因此人们找到了一个既可最大限度地发挥连接酶的活性，一个既可最大限度地发挥连接酶的活性，又有助于短暂配对结构稳定的最适温度即又有助于短暂配对结构稳定的最适温度即1216。DNA的连接主要有粘性末端和平端连接法，的连接主要有粘性末端和平端连接法，这些主要根据外源片段的末端性质、质粒这

10、些主要根据外源片段的末端性质、质粒性质以及两者的酶切位点来确定。性质以及两者的酶切位点来确定。 连接连接粘末端连接法粘末端连接法若若DNA插入片段与适当的载体存在同源粘性末插入片段与适当的载体存在同源粘性末端，这将是最方便的克隆途径。同源粘性末端端，这将是最方便的克隆途径。同源粘性末端包括相同内切酶产生的粘性末端和不同的内切包括相同内切酶产生的粘性末端和不同的内切酶产生的互补粘性末端。相同内切酶产生的粘酶产生的互补粘性末端。相同内切酶产生的粘末端连接得到的重组质粒能够保留接合处的限末端连接得到的重组质粒能够保留接合处的限制酶切位点，因此可以使用原来酶将插入片段制酶切位点，因此可以使用原来酶将插

11、入片段从重组体上完整地重新切割下来。而不同酶产从重组体上完整地重新切割下来。而不同酶产生的粘性末端连接得到的重组质粒不能够保留生的粘性末端连接得到的重组质粒不能够保留接合处的限制酶切位点，因此不可以使用原来接合处的限制酶切位点，因此不可以使用原来酶将插入片段从重组体上完整地重新切割下来。酶将插入片段从重组体上完整地重新切割下来。以上两类粘性末端的连接方法都很重要。以上两类粘性末端的连接方法都很重要。另外，当用单酶切时，虽然产生了互补的粘性另外，当用单酶切时，虽然产生了互补的粘性末端，但由于载体存在自连现象，也会降低正末端，但由于载体存在自连现象，也会降低正确插入的频率。通过一些处理可以减少自连

12、现确插入的频率。通过一些处理可以减少自连现象的发生。常用的方法是用小肠碱性磷酸酶象的发生。常用的方法是用小肠碱性磷酸酶(CIP)去掉载体去掉载体5 -磷酸来达到抑制磷酸来达到抑制DNA片段的片段的自身环化的目的。自身环化的目的。综上所述，在进行基因重组时，一般采用插入综上所述，在进行基因重组时，一般采用插入片段及载体两端具有两个相应的能够产生粘性片段及载体两端具有两个相应的能够产生粘性末端的酶进行酶切后重组，如插入片段和载体末端的酶进行酶切后重组，如插入片段和载体的一端为的一端为EcoR I ，另一端为，另一端为BamH I，它们都能，它们都能产生粘性末端，不仅易于连接，而且又不能互产生粘性末

13、端，不仅易于连接，而且又不能互补，所以能够得到较好的重组结果。补，所以能够得到较好的重组结果。平端连接法：平端连接法：待插入片段的平末端主要由两方面来源，即由待插入片段的平末端主要由两方面来源，即由酶切后产生的平端和补平后产生的平端。一般酶切后产生的平端和补平后产生的平端。一般由酶切产生的平端较易连接。但在试验过程中，由酶切产生的平端较易连接。但在试验过程中，往往会遇到插入片段和载体之间没有互补的末往往会遇到插入片段和载体之间没有互补的末端，这时，就需要将末端进行端，这时，就需要将末端进行“补平补平”或去除或去除3 突出端，突出端，然后再用然后再用T4噬菌体噬菌体DNA连接酶连接连接酶连接两个

14、平端。不过，平端连接的效率是比较低的，两个平端。不过，平端连接的效率是比较低的，一般通过提高一般通过提高DNA的浓度或增加连接酶的用量的浓度或增加连接酶的用量可提高平端的连接效率，有时也可采取可提高平端的连接效率，有时也可采取在平端在平端加上合成的接头加上合成的接头的方法，产生粘性末端，也可的方法，产生粘性末端，也可以提高连接的效率以提高连接的效率 。适当的插入片段与载体分子比率能适当的插入片段与载体分子比率能减少多拷贝插入片段的形成，一般减少多拷贝插入片段的形成，一般采用载体：插入片段摩尔数为采用载体：插入片段摩尔数为1：2-3的比例。的比例。载体及插入片段的量载体及插入片段的量实验材料与仪

15、器：实验材料与仪器：PCRPCR产物产物(0.8kb(0.8kb，带有，带有BamBamHIHI、 HinHindIIIdIII酶切位点酶切位点) )pBluescriptpBluescript KS KS 质粒质粒(3.0kb)(3.0kb)NEB 1kb NEB 1kb 标准分子量片段标准分子量片段BamBamHIHI、 HinHindIIIdIII限制酶及限制酶及 1010K bufferK buffer琼脂糖琼脂糖T4 DNA ligaseT4 DNA ligase 及其缓冲液及其缓冲液(Takara)(Takara)TBETBE缓冲液缓冲液(10(10) )溴化乙啶染色液溴化乙啶染色

16、液(10mg/ml)(10mg/ml)上样液上样液(3(3) )电泳仪，电泳槽，紫外透射仪，凝胶电泳仪，电泳槽，紫外透射仪，凝胶成像仪，一次性塑料手套等成像仪，一次性塑料手套等实验方法和步骤实验方法和步骤 PCRPCR产物的纯化产物的纯化-PCR-PCR产物以及空载体产物以及空载体的酶切的酶切-乙醇沉淀乙醇沉淀-电泳检测电泳检测-连连接接-16-160 0C C过夜过夜A 从从 P C R 产 物 中 直 接 回 收 纯 化产 物 中 直 接 回 收 纯 化 D N A (Promega 公司公司) 1) 直接加直接加100l纯化缓冲液于纯化缓冲液于1.5ml离心管，离心管，再加入再加入303

17、00l PCR反应物，反应物，Vortex混混合；合；2) 加入加入1ml树脂轻轻树脂轻轻Vortex 3次，每次间隔次，每次间隔1分钟；分钟；3) 进入进入C步骤。步骤。DNA回收纯化步骤：回收纯化步骤：回收回收PCR产物常采用两中方法，即直接回收产物常采用两中方法，即直接回收和从凝胶中回收，目前有许多公司出售相关和从凝胶中回收，目前有许多公司出售相关的试剂盒的试剂盒。B 从琼脂糖凝胶回收纯化从琼脂糖凝胶回收纯化DNA1) 用琼脂糖凝胶分离用琼脂糖凝胶分离PCR片段，用片段，用UV观察观察EB染色条带；染色条带；2) 用干净的刀片切出所需用干净的刀片切出所需DNA条带，注条带，注意要在长波长

18、（意要在长波长（300nm）UV灯下操灯下操作，并快速操作，以免损伤作，并快速操作，以免损伤DNA。应。应尽可能多地去除琼脂糖凝胶，一次操尽可能多地去除琼脂糖凝胶，一次操作可切取多至作可切取多至300mg的条带；的条带；3) 将将300l (300mg) 琼脂糖条片转移至琼脂糖条片转移至1.5ml离心管。直接在离心管。直接在70温育直至温育直至凝胶全部溶化（一般可按公司提供凝胶全部溶化（一般可按公司提供的说明书进行）；的说明书进行）；4) 加加1ml树脂，彻底混合树脂，彻底混合20秒，但不秒，但不用用Vortex；5) 下接下接C步骤。步骤。C 纯化步骤纯化步骤 1) 将取出拉杆的注射器筒（将

19、取出拉杆的注射器筒（3ml）装在）装在纯化柱上，加入上述纯化柱上，加入上述DNA与树脂混合与树脂混合液，然后装上拉杆，慢慢将混合液推液，然后装上拉杆，慢慢将混合液推进纯化柱内；进纯化柱内；2) 卸下注射器筒，拔出拉杆，再将注射卸下注射器筒，拔出拉杆，再将注射器筒装上纯化柱，加器筒装上纯化柱，加2ml 80%的的Isopropanol, 然后装上拉杆，慢慢推然后装上拉杆，慢慢推出液体以清洗柱子；出液体以清洗柱子；3) 再次卸下注射器筒，将纯化柱装在再次卸下注射器筒，将纯化柱装在1.5ml离心管上，离心管上，10000g离心离心2 min，以干燥树，以干燥树脂；脂；4) 再将纯化柱装在一个新的再将

20、纯化柱装在一个新的1.5ml离心管上，离心管上，加加50l水或水或TE缓冲液，缓冲液，1分钟后，分钟后，10000g离心离心20秒，溶出秒，溶出DNA片段；片段；5) 移去纯化柱，将纯化出的移去纯化柱，将纯化出的DNA溶液在溶液在-20下保存备用。下保存备用。D 说明说明若向若向1ml树脂中加入树脂中加入500bp PCR产物产物50ng至至16g，其回收率可在，其回收率可在95以上。同样以上。同样500bp，若从低溶点琼脂糖凝胶中回收其回收率在若从低溶点琼脂糖凝胶中回收其回收率在7090之间。之间。学生学生PCR实验结果实验结果(4 l)PCR 产物纯化后产物纯化后(相当于相当于0.8 l原

21、原PCR产物）产物）pBluescript 酶切后酶切后PCR 纯化并酶切后纯化并酶切后(2 l)DNA重组重组本实验是将具有本实验是将具有BamBamHIHI和和HindHindIIIIII粘性末端的粘性末端的基因片段以及载体通过基因片段以及载体通过DNADNA连接酶连接起来。连接酶连接起来。 方法方法1（酶切后乙醇沉淀，适于（酶切后乙醇沉淀，适于PCR产物的重产物的重组）：组）：1) 在灭菌的在灭菌的 Eppendorf 管中加入制备管中加入制备pBluescript KS空载体空载体0.2-1g(针对本实验，针对本实验，取取4 l约约800ng)，2 l 10酶切缓冲液，酶切缓冲液， B

22、amHI & HindIII酶各酶各1l（各（各5单位），用单位），用无菌双蒸水加至无菌双蒸水加至20l 反应体系，于反应体系，于37保保温温1-3h；2) 在另一管中加入待插入的在另一管中加入待插入的DNA片段（纯化片段（纯化的的PCR产物）产物）0.2-1g(本实验约为本实验约为4-10l)，2l 10酶切缓冲液，酶切缓冲液，HindIII 和和 BamHI酶酶各各1l（各（各5单位），用无菌双蒸水加至单位），用无菌双蒸水加至20l 反应体系，于反应体系，于3 7保温保温 1-3 h ；操作步骤操作步骤3) (根据实验情况而定，完毕后各取根据实验情况而定，完毕后各取3l酶解酶解液做电泳分析，观察酶解是否完全）将酶液做电泳分析，观察酶解是否完全）将酶解液加入解液加入2倍体积的倍体积的100乙醇以及乙醇以及1/10体体积的积的3M NaAC(pH=5.2)，置，置-20冰箱冰箱 30min。4oC，12,000rmin离心离心 10 min，弃上清，加入弃上清，加入100 l 70乙醇乙醇(洗涤沉淀物洗涤沉淀物)，离心去上清，室温干燥离心去上清，室温干燥DNA 沉淀沉淀15分钟左分钟左右，加入右，加入 10 l 水或水或