第4章 胚胎培养

1、胚胎培养主讲教师 荣海燕主要内容含义含义第一节 胚培养第二节胚乳培养第二节胚乳培养第三节胚珠和子房培养第三节胚珠和子房培养第四节第四节 其它生殖器官培养其它生殖器官培养复习思考题复习思考题含义含义采用人工的方法将胚从种子、子房或胚珠中采用人工的方法将胚从种子、子房或胚珠中分离出来，再放在无菌的条件下，让其进一分离出来，再放在无菌的条件下，让其进一步生长发育，以至形成幼苗的过程。步生长发育，以至形成幼苗的过程。胚电镜扫描图片第一节 胚培养一、培养类型二、培养过程三、培养基与培养条件四、胚培养的应用一、培养类型分裂一次分裂一次顶细胞顶细胞多次分裂多次分裂球状胚体球状胚体分裂分裂分化分化子叶子叶胚芽

2、胚芽胚轴胚轴胚根胚根几次分裂几次分裂胚柄胚柄1吸收养料供胚发育吸收养料供胚发育 2产生激素促进胚发育产生激素促进胚发育基细胞基细胞（近珠孔）（近珠孔）胚胚（2N）（2N）（2N）（2N）（2N）受精卵受精卵荠菜胚的发育过程荠菜胚的发育过程一一. .培养类型培养类型1、离体胚培养时期、离体胚培养时期 A.异养期异养期 B.自养期自养期 A.异养期，完全依赖于周围细胞中的代谢，而异养期，完全依赖于周围细胞中的代谢，而且依赖于周围胚乳消耗的养料。且依赖于周围胚乳消耗的养料。B.自养期，胚自养期，胚能吸收培养基中的无机盐和糖，经过自身的代能吸收培养基中的无机盐和糖，经过自身的代谢作用合成其生长所必需的

3、物质。谢作用合成其生长所必需的物质。2 2、离体胚培养类型、离体胚培养类型 成熟胚培养成熟胚培养 幼胚培养幼胚培养幼胚培养幼胚培养（子叶（子叶形成之前）形成之前） 成熟胚培养成熟胚培养 （子叶形成以后）（子叶形成以后） 据培养目的不同据培养目的不同剥取的离体胚发育时剥取的离体胚发育时期的不同期的不同胚培养胚培养成熟胚培养一般较易获得成功成熟胚培养一般较易获得成功2 2、离体胚培养类型、离体胚培养类型1.1.幼胚培养过程幼胚培养过程2.2.成熟胚培养过程成熟胚培养过程二二.胚培养过程胚培养过程（1）子房表面消毒后，在无菌条件和高倍解）子房表面消毒后，在无菌条件和高倍解剖镜下切取完整胚，然后接种。

4、剖镜下切取完整胚，然后接种。 1.幼胚培养过程幼胚培养过程适宜时间摘取子房适宜时间摘取子房70%酒精表面消毒酒精表面消毒30S5%次氯酸钠液中灭菌次氯酸钠液中灭菌10分钟分钟无菌水冲洗数次无菌水冲洗数次无菌条件下取出胚珠无菌条件下取出胚珠接种于固体培养基接种于固体培养基培养培养基本培养基：基本培养基： MSNistch White 剥去珠被取出幼胚剥去珠被取出幼胚（2）幼胚培养的发育途径）幼胚培养的发育途径按正常胚胎发育途径形成植株按正常胚胎发育途径形成植株胚胚“早熟萌发早熟萌发”脱分化形成愈伤组织脱分化形成愈伤组织按正常胚胎发育途径形成植株按正常胚胎发育途径形成植株成熟胚成熟胚未成熟胚未成熟

5、胚正常发育形成小苗正常发育形成小苗维持胚的生长，进行正常的胚胎发维持胚的生长，进行正常的胚胎发育成熟，完成胚胎发育的全过程。育成熟，完成胚胎发育的全过程。 胚胚“ “ 早熟萌发早熟萌发”离体的幼胚在培养基上不能长出成熟胚的各种离体的幼胚在培养基上不能长出成熟胚的各种结构，越过正常胚胎发生过程中的若干阶段，结构，越过正常胚胎发生过程中的若干阶段，直接长成幼苗。直接长成幼苗。未成熟幼胚未成熟幼胚畸形苗畸形苗分离变异体分离变异体发育不正常而死（即胚性发育）发育不正常而死（即胚性发育）脱分化形成愈伤组织脱分化形成愈伤组织离体胚离体胚愈伤组织愈伤组织激素浓度高激素浓度高胚状体或不定芽胚状体或不定芽分化培

6、养基分化培养基小植株小植株2.2.成熟胚培养过程成熟胚培养过程培养方法：培养方法：A、将受精后成熟或未成熟种子或果实，、将受精后成熟或未成熟种子或果实，用用70%75%酒精表面消毒消毒几分钟酒精表面消毒消毒几分钟B、用、用0.1%升汞溶液或饱和漂白粉溶液升汞溶液或饱和漂白粉溶液消毒消毒10min，无菌水反复冲洗，无菌水反复冲洗C、无菌操作台上，直接或在解剖镜下、无菌操作台上，直接或在解剖镜下剥取胚接种在培养基上剥取胚接种在培养基上成熟胚是自养的，培养基需要简单。成熟胚是自养的，培养基需要简单。未成熟的幼胚，当它在胚囊里生长时，不仅未成熟的幼胚，当它在胚囊里生长时，不仅依赖于周围细胞中的代谢，而

7、且依赖于周围依赖于周围细胞中的代谢，而且依赖于周围胚乳消耗的养料。与成熟胚的相对自养性比胚乳消耗的养料。与成熟胚的相对自养性比较，幼胚则完全是异养的，在离体情况下，较，幼胚则完全是异养的，在离体情况下，要求更复杂的培养基。除了一般的无机盐成要求更复杂的培养基。除了一般的无机盐成分外，还要加入微量元素和各种生长辅助物分外，还要加入微量元素和各种生长辅助物质。胚龄越小，要求的培养基成分就越复杂。质。胚龄越小，要求的培养基成分就越复杂。三、培养基与培养条件三、培养基与培养条件 胚龄 胚长度（m） 营养需要（培养基营养）早球形胚后球形胚心形胚鱼雷胚成熟胚 2060 6180 81450 4517007

8、00（最大极限）小于40m长的胚所需营养尚不清楚大量元素、微量元素、VB1、VB6、烟酸、糖2%、IAA0.1mg/L+KT0.01mg/L大量元素、微量元素、VB1、VB6、烟酸、糖2%Ca（NO3）2480mg/L、KNO363mg/L、KCl 42mg/L、MgSO463mg/L、KH2PO442mg/L、VB1、VB6、烟酸、糖2%Ca（NO3）2480mg/L、KNO363mg/L、KCl 42mg/L、MgSO463mg/L、糖2%荠菜不同发育时期胚培养的营养需要荠菜不同发育时期胚培养的营养需要1. 1. 培养基：培养基：White Rangwang MS B5 Nitsch 无机

9、盐无机盐+糖糖(3-5%)+生长辅助物质生长辅助物质(维生素、维生素、AA、椰乳等椰乳等)有利，光照不利于胚根生长。有利，光照不利于胚根生长。幼胚需高无机盐、高幼胚需高无机盐、高AAAA、高蔗糖、高渗透、高蔗糖、高渗透压。压。 液体培养基利于幼胚培养，固体培养基利液体培养基利于幼胚培养，固体培养基利于成熟胚培养。于成熟胚培养。2.培养条件培养条件：A.pH值在值在5.2-6.3，与植物有关。，与植物有关。 B.温度：多数胚温度：多数胚25，有的需变温或较低较高，有的需变温或较低较高温度。温度。 C.光照：通常弱光培养。光暗交替有利幼胚生光照：通常弱光培养。光暗交替有利幼胚生长长原胚原胚(幼胚幼

10、胚)的培养的条件的培养的条件 无机氮：无机氮： 渗透压：渗透压： 复杂的天然提取物：复杂的天然提取物： 活性炭：活性炭：包括硝酸盐、亚硝酸盐或铵盐；包括硝酸盐、亚硝酸盐或铵盐；蔗糖，蔗糖，8%-10%8%-10%，不同发育期，渗透压不一样，不同发育期，渗透压不一样，初期高（初期高（WHYWHY）。因为）。因为自然条件下，原胚被一自然条件下，原胚被一层高渗液体包围着。层高渗液体包围着。椰乳椰乳 CM有促进幼胚生长和分化的作用有促进幼胚生长和分化的作用吸附有毒物质吸附有毒物质3 . 有利幼胚培养的因素有利幼胚培养的因素胚乳看护培养，利于原胚的生长有明显的促进胚乳看护培养，利于原胚的生长有明显的促进

11、作用。作用。胚柄的存在对于幼胚的存活至关重要：胚柄的存在对于幼胚的存活至关重要：胚柄促进生长的活性，心形早期活性最高。而胚柄促进生长的活性，心形早期活性最高。而且保留胚柄减少对胚的直接损失。且保留胚柄减少对胚的直接损失。应用克服远缘杂种的不克服远缘杂种的不育性。育性。 败育败育 胚培养胚培养使胚发育不全的植物获得后代。使胚发育不全的植物获得后代。 缩短育种年限。缩短育种年限。 研究与胚发育有关的内外因素。研究与胚发育有关的内外因素。第二节胚乳培养第二节胚乳培养1. 胚乳胚乳X X3 3（2 2极核极核1 1精子）精子）是营养组织，影响胚的发育。是营养组织，影响胚的发育。有些植物在胚发育过程中把

12、胚有些植物在胚发育过程中把胚乳消耗尽（豆科和葫芦科）；乳消耗尽（豆科和葫芦科）；有些植物，胚乳在成熟种子中有些植物，胚乳在成熟种子中存在，贮存大量营养物质（禾存在，贮存大量营养物质（禾谷类，椰子，咖啡）谷类，椰子，咖啡）v将胚乳从母体上分离出来，放在无菌的人工将胚乳从母体上分离出来，放在无菌的人工环境条件下，让其进一步生长发育，以至形环境条件下，让其进一步生长发育，以至形成幼苗的过程。成幼苗的过程。含义含义 胚乳培养再生植株证明了全能性理论；胚乳培养再生植株证明了全能性理论；研究胚和胚乳的关系及胚乳组织的功能；研究胚和胚乳的关系及胚乳组织的功能；再生植株多为三倍体，产生无籽果实；再生植株多为三

13、倍体，产生无籽果实；可以从胚乳愈伤中分离和筛选各种类型的非整倍可以从胚乳愈伤中分离和筛选各种类型的非整倍体植株。体植株。胚乳细胞是研究淀粉、蛋白质和脂类天然产物代胚乳细胞是研究淀粉、蛋白质和脂类天然产物代谢途径的理想系统。谢途径的理想系统。胚乳培养的意义胚乳培养的意义胚乳愈伤组织的建立胚乳愈伤组织的建立 绝大多数经历愈伤组织阶段（器官发生），极绝大多数经历愈伤组织阶段（器官发生），极少数直接从胚乳直接分化器官少数直接从胚乳直接分化器官( (胚状体胚状体) )。胚乳发育时期胚乳发育时期 发育早期的胚乳，接种不方便，愈伤发育早期的胚乳，接种不方便，愈伤组织的诱导频率很低。组织的诱导频率很低。 处于

14、旺盛生长期的胚乳，离体条件下最处于旺盛生长期的胚乳，离体条件下最易诱导产生愈伤组织。易诱导产生愈伤组织。 接近成熟或完全成熟的胚乳，愈伤组织接近成熟或完全成熟的胚乳，愈伤组织诱导频率很低。诱导频率很低。胚乳培养的方法胚乳培养的方法 旺盛期胚乳特征旺盛期胚乳特征 胚已分化完成胚已分化完成 胚乳已形成细胞组织胚乳已形成细胞组织 充分生长，达到成熟大小充分生长，达到成熟大小 外观为半透明的固体状外观为半透明的固体状 富有弹性富有弹性水稻：授粉后水稻：授粉后4 d 黑麦草：授粉后黑麦草：授粉后8 10 d黄瓜：授粉后黄瓜：授粉后7 16 d 梨：授粉后梨：授粉后20 d大麦：授粉后大麦：授粉后10 2

15、0 d 玉米和小麦：授粉后玉米和小麦：授粉后8 12 d一些草本植物胚乳培养的适宜取材时期一些草本植物胚乳培养的适宜取材时期一般情况下：接近成熟或完全成熟的胚乳一般情况下：接近成熟或完全成熟的胚乳callus诱导率很低，诱导率很低，甚至无甚至无callus木本植物，如：桑寄生科、檀香科植物，其成熟胚乳和诱木本植物，如：桑寄生科、檀香科植物，其成熟胚乳和诱导产生导产生callus（一）培养基及植物生长物质（一）培养基及植物生长物质WTWT、MSMS植物激素植物激素生长素细胞分裂素合理搭配，效果更好生长素细胞分裂素合理搭配，效果更好 一般植物一般植物 均适宜均适宜特殊种类激素特殊种类激素 如如:

16、: 大麦大麦2,4-D2,4-D 猕猴桃玉米素猕猴桃玉米素无特别要求，任何一种生长素均可无特别要求，任何一种生长素均可 如如: :枣枣二二.培养基与培养条件培养基与培养条件旺盛期的未成熟胚乳，在诱导培养基上无需原位胚的旺盛期的未成熟胚乳，在诱导培养基上无需原位胚的参与，就能形成愈伤组织。参与，就能形成愈伤组织。完全成熟的胚乳，生理活动很弱，在诱导脱分化前，完全成熟的胚乳，生理活动很弱，在诱导脱分化前，必须借助于原位胚的萌发，使其活化。必须借助于原位胚的萌发，使其活化。胚在萌发时产生某种物质胚在萌发时产生某种物质“ “ 胚因子胚因子”。外源。外源GA3GA3能能部分取代胚因子。部分取代胚因子。（

17、二）胚在胚乳培养中的作用胚在胚乳培养中的作用（三）（三） 培养方法：培养方法：A、取授粉、取授粉4-8d后的幼果，常规消毒后的幼果，常规消毒B、无菌条件下切开果实，取出种子，分离出胚乳、无菌条件下切开果实，取出种子，分离出胚乳C、接种在培养基上，在、接种在培养基上，在25-27和黑暗条件或散射和黑暗条件或散射光下培养形成愈伤组织光下培养形成愈伤组织D、转到分化培养基上，待愈伤组织长出芽后，切下、转到分化培养基上，待愈伤组织长出芽后，切下不定芽不定芽E、插入生根培养基中，光下培养、插入生根培养基中，光下培养10-15d，切口处长，切口处长出白色的不定根出白色的不定根胚乳培养过程胚乳培养过程胚乳胚

18、乳胚状体发育成苗胚状体发育成苗不定芽苗不定芽苗柚，柑桔和枣柚，柑桔和枣大麦大麦, , 水稻水稻, , 玉米玉米, , 苹果苹果, , 马铃薯马铃薯愈伤组织愈伤组织形态发生形态发生（四）胚乳培养的应用（四）胚乳培养的应用 培养胚乳的首要目的是为了直接获得培养胚乳的首要目的是为了直接获得三倍体植株。三倍体植株。三倍体三倍体六倍体六倍体生产生产倍性多样性倍性多样性筛选非整倍体植株筛选非整倍体植株杂种胚乳杂种胚乳附加系和换代系附加系和换代系遗传育种遗传育种 第三节胚珠和子房培养第三节胚珠和子房培养 柱头柱头花柱花柱子房子房花梗花梗花托花托花组成花组成胚囊胚囊卵细胞卵细胞株心株心珠珠 孔孔反足细胞反足细

19、胞珠珠 被被胚珠胚珠极核极核 株柄株柄未受精胚珠未受精胚珠受精胚珠受精胚珠愈伤组织愈伤组织发育成种子发育成种子大孢子或卵分化大孢子或卵分化为单倍体植株为单倍体植株再生植株再生植株一、胚珠培养一、胚珠培养直接成苗直接成苗一、胚珠培养一、胚珠培养适宜时间摘取子房适宜时间摘取子房70%酒精表面消毒酒精表面消毒30S5%次氯酸钠液中灭菌次氯酸钠液中灭菌10分钟分钟无菌水冲洗数次无菌水冲洗数次无菌条件下取出胚珠无菌条件下取出胚珠接种于固体培养基接种于固体培养基培养培养基本培养基：基本培养基： MSNistch White不同植物的胚珠形态结构胚珠培养的方法胚珠培养的方法长度小于长度小于3mm的胚珠，的胚

20、珠，难与直接解剖，可先接难与直接解剖，可先接种于液体培养基中，根种于液体培养基中，根据培养情况采取相应培据培养情况采取相应培养条件。养条件。二、子房培养二、子房培养1.1.摘取时间摘取时间：在开花前在开花前1 15 5天摘下未授粉子房；或授粉天摘下未授粉子房；或授粉后摘下子房。后摘下子房。 2.2.灭菌灭菌：禾谷类用：禾谷类用70%70%酒精擦酒精擦洗幼穗；双子叶植物花蕾用洗幼穗；双子叶植物花蕾用饱和漂白粉灭菌饱和漂白粉灭菌1515分；子房分；子房用用70%70%酒精浸酒精浸3030秒，秒，0.1%0.1%升汞升汞15152020分。无菌水冲洗，无分。无菌水冲洗，无菌滤纸吸干。菌滤纸吸干。柱头

21、柱头花柱花柱子房子房花梗花梗花托花托花组成花组成3.3.接种：接种： 无菌条件下剥开幼花，夹出子房并接无菌条件下剥开幼花，夹出子房并接种于培养基（种于培养基（MSMS、N6N6等）。等）。 4.4.培养：培养： T26,RH50-60%T26,RH50-60%，16h16h散射光。散射光。胚珠胚珠花粉花粉试管内试管内授粉授粉10d后后胚珠胚珠培养培养3周后周后离体受精及植株再生过程离体受精及植株再生过程三、胚珠和子房培养的应用三、胚珠和子房培养的应用 1 1、胚珠、胚珠受精胚珠培养目的受精胚珠培养目的打破种子的休眠打破种子的休眠 挽救胚的发育以获得杂交种挽救胚的发育以获得杂交种未受精胚珠培养目

22、的未受精胚珠培养目的获得单倍体细胞发育而来获得单倍体细胞发育而来 的植株的植株 2 2、子房、子房授粉子房培养目的授粉子房培养目的挽救子房内杂种胚的发育挽救子房内杂种胚的发育未授粉子房培养目的未授粉子房培养目的获得单倍体植株获得单倍体植株 试管受精解决杂交育种中不试管受精解决杂交育种中不 亲和问题。亲和问题。第四节第四节 其它生殖器官培养其它生殖器官培养一、花器培养一、花器培养1.1.取材及处理取材及处理 以健壮植株未开放花以健壮植株未开放花蕾为外植体，蕾为外植体，75%75%酒精酒精浸浸30S30S，饱和漂白粉浸，饱和漂白粉浸10-1510-15分，无菌水冲洗分，无菌水冲洗数次。数次。 2.2.培养基：培养基：MSMS、B5B5等等3.3.接种：接种： 花蕾培养：花蕾培养：花梗插入培花梗插入培 养基中。养基中。 部分花器培养：部分花器培养：切片接入切片接入 培养基中。培养基中。4.4.培养：培养： 加入生长素和加入生长素和CTKCTK，诱，诱导形成愈伤组织或胚状导形成愈伤组织或胚状体，再分化成植株体，再分化成植株。二、种子培养二、种子培养优点：优点： 1.1.植株分化容易，无菌操作方便，植株分化容易，无菌操作方