T载体与目的基因连接

1、一.重组质粒的构建 T 质粒载体重组的 DNA 分子是在 DNA 连接酶的作用下，有 Mg2、ATP 存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源 DNA 分子进行连接。DNA 连接酶有两种：T4 噬菌体 DNA 连接酶和大肠杆菌 DNA 连接酶。两种 DNA 连接酶都有将两个带有相同粘性末端的 DNA 分子连在一起的功能，而且 T4 噬菌体 DNA 连接酶还有一种大肠杆菌 DNA 连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链 DNA 分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接率低，一般可通过提高 T4 噬菌体 DNA连接酶浓度或增加 DNA 浓度来提高平末端的连接效率。T4 噬菌体 D

2、NA 连接酶催化DNA 连接反应分为 3 步：首先，T4DNA 连接酶与辅因子 ATP 形成酶-ATP 复合物；然后，酶-ATP 复合物再结合到具有 5磷酸基和 3羟基切口的 DNA 上，使 DNA 腺昔化；最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。连接反应通常将两个不同大小的片断相连。很多 DNA 聚合酶在进行 PCR 扩增时会在 PCR 产物双链 DNA 每条链的 3端加上一个突出的碱基AopUCm-T 载体是一种已经线性化的载体，载体每条链的 3端带有一个突出的 To 这样，pUCm-T 载体的两端就可以和 PCR 产物的两端进行正确的 AT 配对，在连接酶的催化下，就可以把 PCR 产

3、物连接到 pUCm-T 载体中，形成含有目的片断的重组载体。连接反应的温度在 37C 时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。因此采取折中的温度，即 12-16C,连接 12-16h（过夜），这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。二 .感受态制备原理细菌在 0CCaCl2低渗溶液中胀成球形，丢失部分膜蛋白，成为容易吸收外源 DNA的感受态。三 .-半乳糖甘酶显色反应选择法LacZ 基因是大肠杆菌乳糖操纵子中的一个基因，可以编码 3半乳糖核甘酶。3 一半乳糖核甘酶是由 4 个亚基组成的四聚体，可催化乳糖的水解.用 X-Gal 为底物进行染色时，

4、呈蓝色。现在一些特定的质粒（比如 pUC/pBS 等），常带有 3半乳糖核甘酶的调控序列和 3半乳糖核甘酶 N 端 146 个氨基酸（“肽段）的编码序列，在这个编码序列里还插入一个多克隆位点（MCS，它并不影响 lacZ 的表达。另外，常用的大肠杆菌带有3 一半乳糖核甘酶 C 端部分序列（3 肽段），的编码序列。在各自独立的情况下，这些质粒与大肠杆菌各自编码的 3半乳糖核甘酶片段都没有酶的活性。只有当携带 a肽编码信息的克隆载体成功进入宿主细胞，在培养基诱导物 IPTG 的诱导下，载体质粒能够合成 3 一半乳糖核甘酶 N 端（a 肽段），这样就与宿主细胞合成的 3 一半乳糖核音酶 C 端部分序

5、列（3 肽段）互补，形成完整的 3 一半乳糖核甘酶活性蛋白。而当外源基因插入到此种载体质粒 lacZ 的多克隆位点后，会造成 lacZ 基因不能表达，从而不能合成 3 一半乳糖核甘酶；而对于空载体，lacZ 基因正常表达，通过“互补合成 3 一半乳糖核甘酶，分解培养基里的色素底物 X-gal,最终形成蓝色的化合物，出现蓝色菌斑。实验准备：清洗，5 个 100ml 锥形瓶（外加 1 个小的），6 副培养皿，3 个小试剂瓶，接种环，涂布棒。准备 100ml 超纯水。溶液:LB300ml（液体 50ml+50ml,固体100ml）,0.1mol/LCaCl210ml,100mg/mlAmp1ml,2

6、0mg/mlX-gal1ml,200mg/mlIPTG1ml。大肠杆菌菌液1mlo感受态细胞连接产物4 管 4x5=20ul 做 4 份目的基因T 载体T4 连接酶10 x 冲液4x4uL4x1uL4x0.5uL4x1uL灭菌：5 个 100ml 锥形瓶（外加 1 个小的），6 副培养皿，3 个小试剂瓶，接种环，涂布棒，10ml超纯水，LB 培养基，1.5mlEP 管，大小枪头，过滤用具 2 副，0.1mol/LCaCl2实际配置 20mg/mlX-galX-gal 为 5-澳-4-氯-3-口引喋-3-D 半乳糖甘。用二基甲酰胺（DMF 溶解 X-gal配制成的 20mg/ml（取 0.02g

7、X-gal,用 DMF 定容为 1ml）的贮存液。保存于一玻璃管或聚丙烯管中，装有 X-gal 溶液的试管须用铝箔封裹以防因受光照而被破坏， 并应贮存于-20C。X-gal 溶液无须过滤除菌。（DMF 二甲基甲酰胺；Dimethylformamide;N,N-Dimethylformamide;DMF;CAS:68-12-2 理化性质：无色、淡的胺味的液体。 分子式C3-H7-N-O。分子量73.10。相对密度0.9445 （25C）。熔点-61Co沸点152.8C。 ）溶于 DMSO 溶解度可达 20mg/ml。也溶于 DMF 溶于 DMSQ溶解度可达 20mg/ml。也溶于 DMF200m

8、g/mlIPTG 在 0.8ml 蒸储水中溶解 0.2gIPTG 后，用蒸储水定容至 1ml,用0.22 科 m 滤器过滤除菌，贮存于-20C。LB 培养基：配制每升培养基，应该在 950ml 去离子水中加入：胰化蛋白月东 10g 酵母提取物 5gNaCl10g 摇动容器直至溶质溶解.用 5mol/LNaOH 调 pH 至 7.3.用去离子水定容至 1L.在 15psi 高压下蒸汽灭菌20min.（100mlLB 培养基加入 1.5g 琼脂粉为固体培养基）0.1mol/LCaCl2:取 0.11098g 氯化钙固体定容至 10mlAmp（100mg/ml）：溶解 0.1g 氨苇青霉素钠盐于足量

9、的水中，最后定容至 1ml,用 0.2211m 滤膜过滤除菌.实验过程（一） .目的基因片段与载体连接器材旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面离心管架，台式离心机，干式恒温气浴。试齐 IT 载体，T4DNA 连接酶，连接酶缓冲液，无菌 ddWater。操作步骤PCR 产物与 T 载体直接连接：（1） 事先将干式恒温仪（或冰盒里的水）温度设定在 1416Co（2） 取 4 个灭菌的 200ul 微量离心管，加入：（需要调整）4ml 目的基因；1mlT 载体；0.5mlT4DNA 连接酶（TAKARA,350U/ul）;1ml 连接酶缓冲液 10 xbuffer;3

10、.5mlddWater，总量 10ml 体系。（3） 述混合液轻轻震荡后再短暂离心，然后置于 14。C 干式恒温仪（或 14。C水中）中保温过夜（12-16h）。（4） 连接后的产物可以立即用来转化感受态细胞或置 4。C 冰箱备用。（二） .大肠杆菌感受态细胞的制备细菌转化仪器：旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，50ml 微量离心管，1.5ml 微量离心管，台式冷冻离心机，制冰机，恒温摇床，分光光度计，超净工作台，恒温培养箱，摇菌试管，三角烧瓶，接种环，恒温摇床，培养皿（已铺好固体 LB-Amp） ,酒精灯，玻璃涂棒，恒温培养箱，滤膜和过滤器试剂： E.coli 菌种， LB 培养基，

11、0.1mol/LCaCl2 溶液， 无菌 ddWater,LB 培养基 （不加抗菌素），LB 培养基（加抗菌素），无菌 ddwater,IPTG,X-gal。步骤（1）在超净工作台中，将 1ml 大肠杆菌菌液加入 100mlLB 液态培养基（不含抗菌素），37c 摇床培养过夜。（2） 取 0.5ml 上述菌液转接到含有 50mLLB 培养基的三角烧瓶中，37c 下250r/min 摇床培养 23h,测定 OD590 为 0.350.4 左右（0.40.6,细胞数108/mL,此为关键参数！）。（注意：此步摇菌的时候，要有一管不加菌的 LB 培养液同时摇菌）（3） 将 1ml 菌液加入到 4 支

12、 1.5mL 预冷无菌的聚丙烯离心管中，于冰上放置 10min,然后于4C,5000rpm 离心 5min。立即在涡旋混合器上混匀，插入冰中放置 30mino(5)4C,5000rpm 离心 5min,弃上清液后， 用 100dL 冰冷的 0.1mol/LCaCl2 溶液垂悬， 插入冰中放置 2h,可以直接用作转化实验，或立即放入-4 摄氏度冰柜中保藏。(6)事先将恒温水浴的温度调到 42o(7)从-70C 超低温冰柜中取出一管(100LL)感受态菌，立即用手指加温融化后插入冰上，冰浴 510min。(8)加入 5dL 连接好的质粒混合液(DNA 含量不超过 100ng),轻轻震荡后放置冰上

13、20min。(9)轻轻摇匀后插入 42c 水浴中 90s 进行热休克，然后迅速放回冰中，静置 3min。(10)在超净工作台中向上述各管中分别加入 300 科 LLB 培养基(不含抗菌素)轻轻混匀，然后固定到摇床的弹簧架上 37c 震荡 1h。(11)在超净工作台中取上述转化混合液 200dL,分别滴到含合适抗菌素(Amp100ug/L)的固体 LB 平板培养皿中，再在平板上滴加 40dL20mg/mlX-gal,7L200mg/mlIPTG,用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀(注意：一个不含抗生素作为对照组，玻璃涂布棒上的酒精熄灭后稍等片刻，待其冷却后再涂，菌液涂皿操作时，应避免反复来回涂布，

14、因为感受态细菌的细胞壁有了变化，过多的机械挤压涂布会使细胞破裂，影响转化率。)。(12)在涂好的培养皿上做上标记，先放置在 37c 恒温培养箱中 30min 直到表面的液体都渗透到培养基里后，再倒置过来放入 37C 恒温培养箱过夜。(13)在被细菌污染的桌面上喷洒 70 叱醇，擦干桌面。(14)观察平板上长出的菌落克隆，以菌落之间能互相分开为好。注意白色菌斑。(三).转化克隆的筛选和鉴定器材旋涡混合器，小镣子，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面离心管架，干式恒温气浴(或恒温水浴锅)，制冰机，恒温摇床，超净工作台，酒精灯，无菌牙签，摇菌管。试齐 ILB 培养基(加抗菌素)，

15、PCR 用试剂，引物，质粒提取用试剂，酶切需要的限制性内且酶及其缓冲液，65%甘油(65%甘油，0.1mol/LMgSO4,0.025mol/LTrisClpH8.0)。操作步骤方法一：快速 PCR 筛选法(1)在转化的平板培养基上随机选取 4 个边缘清晰的白色菌落，并用记号笔在其所在的培养皿底部玻璃背面画圈做标记编号。(2)在 0.2mlPCR 微量离心管中配制 256 反应体系。ddwater16 科 l(4)将离心管倒置以倒尽上清液，加入1ml 冰冷的 0.1mol/LCaCl2 溶液,10 xPCRbuffer(不含 MgCl2)2.5l25mMMgCl21.5l2.5mmol/LdN

16、TP2l(每种 dNTP 终浓度 0.2mM)10mol/LPrimeri1 科 l(12.525pmoles)10mol/Lprimer21 科 l(12.525pmoles)模板质粒用小 tip 头轻轻粘一下选中的白色菌落，再伸入 PCR 混合液中洗一洗Taq 酶 0.5 科 l(1.5u)总体积 25 科 l(2)根据厂商的操作手册设置 PCR 仪的循环程序(本实验室已经设置为 WZ:94C5min94C1min60C1min72C1min50sgoto29times72c10min(2)PCR 结束后，取 10 科 l 产物进行琼脂糖凝胶电泳(与原始插入片断同时比对)。观察胶上是否有预计的主要产物带。(3)按照编号找到培养皿中的原菌斑。根据需要进行放大培养提取其质粒(4)提取到的质粒与原先的空载体(或已知分子量的质粒)再对比电泳，以进一步确认。方法二：提质粒再 PCR 或酶切鉴定(1)在超净工作台中取 3 支无菌摇菌管，各加入 3mLLB(含 50mg/mL 氨茉青霉素)，用记号笔写好编号。(2)在超净工作台中将 70%乙醇浸泡的小镣子头用酒精灯烤过，镣取一支无菌牙签。用牙签的尖部接触转化的平板培养基上的一个白色菌落，然后将牙签放入盛有3mLLB(含