基因诊断与基因治疗

1、 基因诊断（基因诊断（4-184-18） 基因治疗（基因治疗（4-254-25）48小时内使用最有效基因诊断（一）核酸分子杂交技术（二）聚合酶链反应 (PCR)（三）基因测序（四）基因芯片常用固相核酸杂交方法 (1) Southern 印迹杂交法 限制性内切酶酶切 检测杂交信号检测杂交信号 提取提取DNADNA Southern 法可用于检测特异的DNA序列片段,进行基因定位、分子量测定等。Kary Mullis research scientist in the 1980s at a California biotechnology company called Cetus co-winne

2、r of 1993 Nobel Prize PCR产物以指数形式增加，即Y = 2n n为循环数他们给DNA 的测序带来了一场革命，分享了1980年的诺贝尔化学奖。后来Sanger法发展为自动化测序法，并为人类基因组测序做出了卓越贡献。Fred Sanger 发明的末端合成终止法 (sanger法)Walter Gilbert发明的化学裂解法 Maxam-Gillbert法n快速、高通量、平行化、自动化基因诊断方法经典基因诊断.限制性内切酶法.RFLP分析法.寡核苷酸分析法优点缺点特异基因诊断未知基因诊断直接，过程简单过程繁杂准确性低，过程繁条件严格基因诊断进展.PCR方法.PCR-序列分析法

3、.DNA芯片技术简单、经济、敏感操作直接、准确集成度高、快速、并行假阳性高价格高尚无成熟产品问世遗传疾病肿瘤感染性疾病，传染性流行病判断个体疾病易感性器官移植组织配型法医学中个体识别、亲子鉴定镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析Mst酶切位点(CCTNAGG)5 3 正常基因5 3 突变基因突变基因1.15kb1.35kb0.2kb正常珠蛋白基因： 5CCTGAGG3镰刀型贫血： 5CCTGTGG30.2kb1.15kb1.35kb正常人突变携带着 患者实时监测 荧光 起始模板Real Time vs. Traditional PCRPCRTheoreticalReal LifeLog T

4、arget DNA理想的PCR反应XnX0 2n*Xn：第n次循环后扩增产物数量X0 ：起始模板数量n：扩增循环数荧光定量PCR原理Ct值定量的数学原理非理想的PCR反应XnX0 （1En）n*Xn：第n次循环后扩增产物数量X0 ：起始模板数量n：扩增循环数En：扩增效率荧光定量PCR原理Ct值定量的数学原理在扩增产物达到荧光阈值时XCtX0 （1En）CtM （1）*XCt ：荧光扩增信号达到阈值时扩增产物的量，在阈值设定以后，它是一个常数，：荧光扩增信号达到阈值时扩增产物的量，在阈值设定以后，它是一个常数，定为定为M方程式（1）两边同取对数得：Log2MLog2X0 *（1En）Ct （2

5、）整理方程式（2）：Log2X0 Log 2M Ct Log2（1En）荧光定量PCR原理Ct值定量的数学原理 TaqMan Probe Molecular Beacon TaqManSYBR Green I GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAADissociation curvePrimer Length: 15-30bpPCR Product: 100-200bpG+C%: 4060Tm of primers: 55-60 Tm of probes: 65 (10 )No G at 5探针中GC含量的差异对定量PCR反应效率的影响Absolute Quantification0123456Sample1Sample2Sample3Sa