pcr说明及注意事项

1、PCR技术产生的背景：DNA双螺旋结构于1953年发现，自此确立了它就是细胞里携带遗传信息的分子。第一个细胞内用来复制DNA所需的聚合酶polymerase，即PCR之P），也早在1956年分离成功。几十年来，在试管内复制DNA已是许多实验室的例行工作。 PCR技术浅淡 微生物教研室：曹康PCR的发明人，一般公认是穆里斯（K. Mullis），他于1983年发明了PCR技术，这是分子生物学上的一次革命，他也因此获得了1993年的诺贝尔化学奖。 PCR技术的基本原理1, 变性：一般9395度2, 退火：一般55度左右，根据具体 的情况决定 3，延伸：一般72度,PCR产物每kb一 分钟pcr.s

2、wf.swf常用的PCR技术普通PCRRT-PCRRace PCR巢式PCRReal-time PCR通常，PCR在分子克隆和DNA分析中有着以下多种用途：(1) 生成双链DNA中的特异序列作为探针；(2) 由少量mRNA生成 cDNA文库；(3) 从cDNA中克隆某些基因；(4) 生成大量DNA以进行序列测定；(5) 突变的分析；我们可以利用PCR做些什么工作克隆基因，构建质粒扩增核酸，用于检验质粒点突变连接(overlap PCR)要将两段100多个碱基的片段连起来用PCR可以吗？没有酶切位点！各位高手可否介绍一下经验？连接PCR要注意些什么？多谢！(丁香园某求助帖） 可以。我就这样做过。

3、1. 针对这两个片段设计两对引物。第一对引物的下游引物和第二对引物的上游引物各长40bp左右，并有20bp左右的同源性配对序列（象骨折打的石板）。2. 分别PCR这两段序列，并分别回收纯化这两个PCR片段。3. 将上述两个PCR片段加入一PCR体系中，只不加引物，其他同普通的PCR，做PCR。4. 回收200多bp的PCR目的片段。放入测序载体，测序证实。(丁香园某回答贴）overlap PCR 在设计引物之前应当明确PCR试验的目的以及各种资料和信息1. 引物长度一般为18-35bp,以保证特异性.当然不是说越长越好,太长的引物同样会降低特异性2，上下游引物长度相差一般不超过3个碱基prim

4、ers design3. 引物GC含量尽量是40604. 尽量避免发卡结构，特别是3端发卡结构5. 尽量避免引物二聚体特别是3端引物二聚 体6，尽量避免错配，特别是3端错配7，尽量避免3端最后一个碱基是A。8，上下游Tm值相差最好不要超过5C9， Tm值的计算： Tm4（GC）2（AT）(本公式适用于20个碱基以下，20个碱基以上推荐使用软件计算）10,根据需要可在引物5端加入酶切位点和保护碱基11,引物设计的最后一项：Genebank网比对/Blast使用软件帮助设计引物 目前常用的引物设计软件有Primer Primier 5.0和Oligo以及其他各种软件和一些网上在线设计，其中以Pri

5、mer Primer 5.0功能最全最为常用。 Primer Primer 5.0的主要功能有：分析限制性内切酶位点，自动搜索，手动设计等功能。 关于PCR引物设计的思考 1，任何引物设计软件都不能代替人性化的思考。2,核酸结构是三维的，而一般的引物设计软件很难考虑到核酸的三维结构。3，理论与实践并不一定完全一致 关于PCR试验结果的思考 影响PCR的主要因素怎样理解 PCR技术？1，模板模板在PCR反应中起至关重要的作用，常见的模板性质：A 质粒DNAB 基因组DNAC RNA(RT-PCR)2，引物引物的特异性很重要3，引物浓度0.11pmol/ul 引物浓度太低PCR产量低，引物浓度太高

6、容易引发非特异性扩增。Mg离子的作用主要是 dNTP-Mg 与核酸骨架相互作用 并能影响Polymerase的活性，一般的情况下 Mg的浓度在0.5-5mM之间调整，同样要记住的是在调整了dNTPs的浓度后要相应的调整Mg离子的浓度。在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.52.0mmol/L为宜 Mg离子浓度Mg离子浓度升高则PCR特异性增加， Mg离子降低则有可能出现非特异性扩增退火温度升高退火温度PCR产量低，降低退火温度则有可能出现非特异性扩增保护碱基的个数：(NEB)BamH 1 EcoR 1 Hind 2 Xho 1Pst 3 Xba 1保护

7、碱基的性质：灵活处理关于酶切位点与保护碱基 本实验室经常使用宝生物的Taq酶rTaq： 普通Taq酶，1kb以下片断使用比较合适DNA聚合酶的选择EXTaq 具有一定的保真性，2kb以下片断使用比较合适 LATaq 保真性比EXTaq要好，适用于2kb以上的片断1，具有35核酸外切酶活性，所以具有保真性2，PCR产物末端没有T3, 扩增效率往往不如普通Taq酶，可以用普通Taq酶和pfu按20：1混合使用关于高保真DNA聚合酶（pfu）PCR究竟能扩多长的片段？ RNA模板： 使用一般的试剂，RT-PCR一般只 能扩到2kb左右质粒模板：5kb一般不成问题基因组DNA模板：使用特殊的酶和缓冲液

8、原理 上讲可以扩出1025kb (长距离PCR） RT-PCR各有优缺点。比较如下：二步法:可使用oligo(dT)，随机六聚体引物或基因特异性引物进行第一链合成。高灵活性：可选用不同的酶系统。可优化困难的RT-PCR反应。可实现长模板mRNA的转录扩赠(使用ELONG ASE Enzyme Mix) 。 最适用于克隆产物(使用高确限度酶或混合酶) 。 一步法和二步法一步法:第一链合成时只能使用基因特异性引物。 高灵敏度：使用预混合的SUPETSCRIPT H和Taq聚合酶，可检测到低至01pg的mRNA。高便利性：所使用的酶已经预混合。移液步骤少，减少污染机会。最适于大量样品的分析。总的原则

9、：1，做任何实验要有对照2，做任何实验要变通，走多条路，不要在一棵树上吊死。PCR反应条件的摸索不出现扩增条带 PCR反应的关键环节有模板核酸的制备，引物的质量与特异性，酶的质量， PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。 不出现扩增条带出现非特异性扩增带 PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次，是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶的量过多有

10、时也会出现非特异性扩增。 对策有：必要时，重新设计引物。减低酶的量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温度点法(93变性，65左右退火与延伸，也叫两步法)。 出现片状拖带或涂抹带 PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶的量过大或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。 其对策有：减少酶的量，或调换另一来源的酶。减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓 度。增加模板量，减少循环次数。 模板：模板中含有杂蛋白质，模板中含有Taq酶抑制剂，模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，在

11、提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。 hot start PCR 热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一。尽管Taq DNA聚合酶的最佳延伸温度在72，聚合酶在室温仍然有活性。因此，在进行PCR反应配制过程中，以及在热循环刚开始，保温温度低于退火温度时会产生非特异性的产物。这些非特异性产物一旦形成，就会被有效扩增。在用于引物设计的位点因为遗传元件的定位而受限时，热启动PCR尤为有效。 利用mRNA的3末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以Oligo(dT)30MN作为锁定引物在反转录酶MMLV作用下，反转录合成标准第一链cDNA。 利用该反转录酶具有的末端转移酶活性，在反转录达到第一链的5末端时自动加上3一5个(dC)残基 5 Race技术含有SMART寡核苷酸序列Oliogo(dG)通用接头引物与cDNA第一链配对后，转换为以SMART序列为模板继续延伸而连上通用接头。然后用一个含有部分接头序列的通用引物UPM(universal primer,UPM)作为上游引物，用