黄酮的提取与分离

1、第三节第三节 提取与分离提取与分离一、提取一、提取 1 1、黄酮苷类与极性较大的苷元、黄酮苷类与极性较大的苷元( (羟基黄酮羟基黄酮, ,双双黄酮黄酮, ,橙酮橙酮, ,查耳酮等查耳酮等) )丙酮丙酮, ,乙酸乙酯乙酸乙酯, ,乙醇乙醇, ,甲醇甲醇, ,甲醇甲醇- -水水(1:1)(1:1)等提取等提取 2 2、多糖苷类、多糖苷类: : 沸水提取沸水提取 3 3、花色苷类、花色苷类: 0.1% : 0.1% 盐酸提取盐酸提取4 4、黄酮苷元、黄酮苷元: : 氯仿氯仿, ,乙醚乙醚, ,乙酸乙酯等提取乙酸乙酯等提取（一）溶剂萃取法（一）溶剂萃取法1 1、原理：黄酮类化合物与混入杂质极性不同、原

2、理：黄酮类化合物与混入杂质极性不同2 2、举例：、举例：石油醚石油醚 除叶绿素、胡萝卜素等脂溶性色素；除叶绿素、胡萝卜素等脂溶性色素；乙醇乙醇 除蛋白质、多糖类等水溶性杂质。除蛋白质、多糖类等水溶性杂质。（二）碱提取酸沉淀法（二）碱提取酸沉淀法1 1、原理：黄酮类化合物易溶于碱性水。、原理：黄酮类化合物易溶于碱性水。2 2、常用碱液：碳酸钠、常用碱液：碳酸钠, , 氢氧化钠氢氧化钠, , 氢氧化钙等氢氧化钙等 例如：从槐花米提取芦丁过程例如：从槐花米提取芦丁过程 槐花米槐花米加加6 6倍量水倍量水煮沸煮沸以石灰乳调以石灰乳调pH=8-9pH=8-9微沸微沸30min30min趁热过滤趁热过滤残

3、渣再残渣再水煮一次水煮一次合并两次滤液合并两次滤液 60-70 60-70时以时以浓盐酸调节浓盐酸调节pH=4-5pH=4-5静置静置2424小时小时抽滤抽滤水洗至中性水洗至中性 60 60干燥得粗品芦丁干燥得粗品芦丁沸水重结晶沸水重结晶 70-8070-80干燥得纯品芦丁。干燥得纯品芦丁。（三）碳粉吸附法（三）碳粉吸附法 1 1、适用范围：主要用于苷类的精制。、适用范围：主要用于苷类的精制。2 2、使用过程：、使用过程： 植物甲醇粗提物植物甲醇粗提物，加入活性炭，检查上清；，加入活性炭，检查上清； 沸水、沸甲醇、沸水、沸甲醇、7%7%酚酚/ /水、水、15%15%酚酚/ /醇洗脱；醇洗脱；

4、减压浓缩减压浓缩7%7%酚酚/ /水洗脱液至小体积；水洗脱液至小体积； 乙醚除去残留的酚乙醚除去残留的酚 水层中含有较纯的黄酮苷类。水层中含有较纯的黄酮苷类。（四）聚酰胺吸附法（四）聚酰胺吸附法1 1、 聚酰胺对于黄聚酰胺对于黄酮类化合物是比较理想的酮类化合物是比较理想的 吸附剂吸附剂 2 2、洗脱剂：不同浓度的乙醇、丙酮以及碱水、洗脱剂：不同浓度的乙醇、丙酮以及碱水3 3、分离效果：粗分、分离效果：粗分 例如：银杏叶黄酮的提取例如：银杏叶黄酮的提取 （五）超临界流体萃取法（五）超临界流体萃取法1 1、以、以COCO2 2为单一流体萃取极性较低的游离黄酮为单一流体萃取极性较低的游离黄酮或黄酮的

5、碳苷类；或黄酮的碳苷类；2 2、在、在COCO2 2中加入水、乙醇等作为夹带剂，萃取中加入水、乙醇等作为夹带剂，萃取极性较高的黄酮或黄酮苷类。极性较高的黄酮或黄酮苷类。例如：从甘草中提取黄例如：从甘草中提取黄酮类化合物，以酮类化合物，以COCO2 2为单为单一流体可萃取极性较低的干草查耳酮一流体可萃取极性较低的干草查耳酮A A、B B；在在COCO2 2- -水水- -乙醇乙醇溶剂体系中则可提取极性较高的溶剂体系中则可提取极性较高的甘草素与异甘草素。甘草素与异甘草素。二、分离二、分离 （一）柱色谱法（一）柱色谱法1. 1. 硅胶柱色谱：硅胶柱色谱： 主要适于分离异黄酮、二氢黄酮、二氢黄主要适于

6、分离异黄酮、二氢黄酮、二氢黄酮醇及高度甲基化（或乙酰化）的黄酮及黄酮醇及高度甲基化（或乙酰化）的黄酮及黄酮醇类。酮醇类。 在加水去活化后可用于分离极性较大的化在加水去活化后可用于分离极性较大的化合物，如多羟基黄酮醇及其苷类等。合物，如多羟基黄酮醇及其苷类等。 硅胶中混存少量金属离子，应预先用硅胶中混存少量金属离子，应预先用浓盐酸处理除去，以免干扰分离效果。浓盐酸处理除去，以免干扰分离效果。 分离黄酮苷元时，用氯仿分离黄酮苷元时，用氯仿- -甲醇混合溶甲醇混合溶剂做移动相；剂做移动相； 分离黄酮苷时，用氯仿分离黄酮苷时，用氯仿- -甲醇甲醇- -水或乙酸水或乙酸乙酯乙酯- -丙酮丙酮- -水做移

7、动相。水做移动相。2. 2. 聚酰胺柱色谱聚酰胺柱色谱 可用于分离各种类型的黄酮类化合物，可用于分离各种类型的黄酮类化合物， 包括苷与苷元、查耳酮与二氢黄酮等。包括苷与苷元、查耳酮与二氢黄酮等。 分离的机理分离的机理: : 主要为氢键吸附主要为氢键吸附 ，其吸附，其吸附 强度主要取决于羟基的数目、位置以及溶剂强度主要取决于羟基的数目、位置以及溶剂的影响。的影响。 吸附规律如下吸附规律如下: :a. a. 酚羟基数目越多，吸附力越强；酚羟基数目越多，吸附力越强；b. b. 如酚羟基所处位置易形成分子内氢键，如酚羟基所处位置易形成分子内氢键， 则吸附力减小。则吸附力减小。c. c. 分子内芳香程度

8、越高、共轭双键越多，分子内芳香程度越高、共轭双键越多， 则吸附力增强。则吸附力增强。总之，一般吸附力由大到小的顺序为：总之，一般吸附力由大到小的顺序为：黄酮醇黄酮醇 黄酮黄酮 二氢黄酮醇二氢黄酮醇 异黄酮异黄酮 洗脱规律如下洗脱规律如下: :a.a. 不同类型黄酮化合物，先后流出顺序为：不同类型黄酮化合物，先后流出顺序为： 异黄酮异黄酮 二氢黄酮醇二氢黄酮醇 黄酮黄酮 黄酮醇黄酮醇b. b. 相同苷元，洗脱先后顺序为：相同苷元，洗脱先后顺序为： 叁糖苷叁糖苷 双糖苷双糖苷 单糖苷单糖苷 苷元苷元c. c. 母核上增加羟基，洗脱速度即相应下降；母核上增加羟基，洗脱速度即相应下降；d. d. 羟基

9、数目相同时，其位置影响洗脱顺序：羟基数目相同时，其位置影响洗脱顺序： 邻位羟基黄酮邻位羟基黄酮 对位（或间位）羟基黄酮对位（或间位）羟基黄酮 e. e. 查耳酮比相应二氢黄酮难于洗脱。查耳酮比相应二氢黄酮难于洗脱。 f. f. 洗脱能力与介质有关洗脱能力与介质有关 水水 甲醇或乙醇甲醇或乙醇 丙酮丙酮 稀稀NaOHNaOH水水溶液或氨水溶液或氨水 甲酰胺甲酰胺 二甲基甲酰胺二甲基甲酰胺 3 3，5 5，7 7，33，4-4-五羟基黄酮五羟基黄酮 3 3，5 5，7 7，33，44，5-5-六羟基黄酮六羟基黄酮 常用洗脱剂：常用洗脱剂： 碱性水溶液、含盐水溶液、碱性水溶液、含盐水溶液、 醇及含水

10、醇等。醇及含水醇等。 其它洗脱溶剂：含水丙酮、甲醇氯仿等其它洗脱溶剂：含水丙酮、甲醇氯仿等（二）梯度（二）梯度pHpH萃取法萃取法1 1、适用范围：酸性强弱不同黄酮苷元的分离。、适用范围：酸性强弱不同黄酮苷元的分离。2 2、原理：根据黄酮类苷元酚羟基数目及位置、原理：根据黄酮类苷元酚羟基数目及位置不同其酸性强弱也不同的性质，可以将总黄不同其酸性强弱也不同的性质，可以将总黄酮溶于有机溶剂后，依次用酮溶于有机溶剂后，依次用5%5%NaHCONaHCO3 3、 5%Na5%Na2 2COCO3 3、0.2%NaOH0.2%NaOH及及4%4%NaOHNaOH水溶液水溶液萃取，将黄酮按较强酸性至较弱酸

11、性的顺序进萃取，将黄酮按较强酸性至较弱酸性的顺序进行分离。行分离。 3 3、分离规律如下：、分离规律如下： 酸性酸性 溶解性溶解性7 7，4-4-二二OH 5%OH 5%NaHCONaHCO3 3液液 7-7-或或4-OH 5%4-OH 5%NaNa2 2CO3CO3液液 一般一般OH 0.2%OH 0.2%NaOHNaOH液液 5-OH 4%5-OH 4%NaOHNaOH液液（三）根据分子中某些特定官能团进行分离（三）根据分子中某些特定官能团进行分离1 1、铅盐沉淀法：适用于具有邻二酚羟基的分离、铅盐沉淀法：适用于具有邻二酚羟基的分离 具有邻二酚羟基的黄酮成分，可被中性醋酸具有邻二酚羟基的黄

12、酮成分，可被中性醋酸铅沉淀；铅沉淀； 不含邻二酚羟基结构的黄酮成分，可被碱性不含邻二酚羟基结构的黄酮成分，可被碱性醋酸铅沉淀。醋酸铅沉淀。2 2、硼酸络合法：、硼酸络合法：具有邻二酚羟基的黄酮可与硼酸络合，生成物具有邻二酚羟基的黄酮可与硼酸络合，生成物易溶于水，借此可与不含邻二酚羟基结构的易溶于水，借此可与不含邻二酚羟基结构的黄酮成分分离。黄酮成分分离。3 3、脱铅方法、脱铅方法 HH2 2S S法：铅盐沉淀悬浮于乙醇中，通入法：铅盐沉淀悬浮于乙醇中，通入HH2 2S S进行复分解，滤去进行复分解，滤去PbSPbS沉淀，可得黄酮类成分。沉淀，可得黄酮类成分。该法缺点：初生态该法缺点：初生态Pb

13、SPbS沉淀具有较高吸附性。沉淀具有较高吸附性。 现通用法：使用硫酸盐或磷酸盐，或使用现通用法：使用硫酸盐或磷酸盐，或使用阳离子交换树脂脱铅。阳离子交换树脂脱铅。 三、提取分离实例三、提取分离实例 从柠檬果皮中分离降血压有效成分从柠檬果皮中分离降血压有效成分 柠檬果皮柠檬果皮2kg2kg搅碎搅碎热水浸取热水浸取 滤液滤液浓浓缩后加缩后加3 3倍量乙醇倍量乙醇 水提取物水提取物 hexane( hexane(己烷己烷) )提取提取 n-BuOHn-BuOH提取提取n-BuOHn-BuOH提取物提取物加碱加碱式醋酸铅式醋酸铅 黄色铅盐沉淀黄色铅盐沉淀碳酸氢钠碳酸氢钠 滤液滤液66MHClMHCl调

14、调pH=5n-BuOHpH=5n-BuOH提取提取得粗黄酮得粗黄酮类类凝胶过滤凝胶过滤不同不同pHpH水洗水洗 不同部分反复不同部分反复柱层析柱层析反复重结晶反复重结晶得不同单体。得不同单体。 四、含黄酮类化合物中药实例四、含黄酮类化合物中药实例1.1.黄芩黄芩 黄芩苷是黄芩的主要有效成分黄芩苷是黄芩的主要有效成分, ,具有抗菌、具有抗菌、消炎作用。尚有降转氨酶的作用。消炎作用。尚有降转氨酶的作用。 黄芩变绿过程黄芩变绿过程OOHOHOROOOHOHOHOOOOHOOO黄芩苷黄芩苷黄芩素（黄色）黄芩素（黄色）绿色绿色2. 2. 槐花米槐花米 芦丁是槐花米的有效成分；芦丁是槐花米的有效成分； 芦

15、丁分子中含有较多酚羟基，显示酸性而芦丁分子中含有较多酚羟基，显示酸性而易溶于碱液中，酸化后又析出。易溶于碱液中，酸化后又析出。OOOOHHOOHOHGlc-RhaRutinose第四节第四节 黄酮类化合物的检识与结构鉴定黄酮类化合物的检识与结构鉴定一、黄酮类化合物的检识一、黄酮类化合物的检识 1 1、颜色：、颜色： 黄酮（醇）类黄酮（醇）类黄色；查耳酮黄色；查耳酮橙黄色橙黄色 二氢黄酮（醇）、异黄酮二氢黄酮（醇）、异黄酮无色或微黄色无色或微黄色 2 2、显色反应：、显色反应： 盐酸镁粉、盐酸镁粉、NaBHNaBH4 4、AlClAlCl3 3、醋酸铅等、醋酸铅等 （一）纸色谱（一）纸色谱1 1

16、、应用范围：适合于检识各种类型黄酮类化合、应用范围：适合于检识各种类型黄酮类化合物，包括苷与苷元。物，包括苷与苷元。2 2、双向纸色谱双向纸色谱是检识植物粗提物中黄酮类化合是检识植物粗提物中黄酮类化合物存在的最好方法之一。物存在的最好方法之一。 第一向第一向通常采用一种通常采用一种“醇性醇性”溶剂溶剂展开，展开，如如n-BuOH-HOAcn-BuOH-HOAc-H-H2 2O(4:1:5 O(4:1:5 上层上层 BAW)BAW)、n-BuOH-HOAcn-BuOH-HOAc-H-H2 2O(3:1:1 O(3:1:1 ，TBA)TBA)与水饱和与水饱和的的n-BuOHn-BuOH等；等； 第

17、二向第二向通常用一种通常用一种 “ “水性水性”溶剂展开，溶剂展开， 如如2%2%5%5%HOAcHOAc等等3 3、检识黄酮类苷元：一般用、检识黄酮类苷元：一般用“醇性醇性”展开剂；展开剂； 检识黄酮苷：一般用检识黄酮苷：一般用“水性水性”展开剂。展开剂。4 4、RfRf与黄酮类化合物结构的关系：与黄酮类化合物结构的关系：（1 1）水性溶剂水性溶剂展开时，平面型分子几乎停留原展开时，平面型分子几乎停留原点不动点不动( (RfRf0.02);0.70.7） 单糖苷单糖苷 双糖苷双糖苷。（3 3）醇性溶剂展开时，羟基被甲氧基取代，）醇性溶剂展开时，羟基被甲氧基取代，因极性减小，因极性减小，RfR

18、f将增大。将增大。（4 4）醇性溶剂展开时，如黄酮类化合物羟）醇性溶剂展开时，如黄酮类化合物羟基被苷化，因极性增大，基被苷化，因极性增大，RfRf将下降。将下降。 5 5、大部分极性大的黄酮出现在滤纸的右上方，、大部分极性大的黄酮出现在滤纸的右上方，极性小的黄酮则出现在滤纸的左下方。极性小的黄酮则出现在滤纸的左下方。6 6、大多数黄酮类化合物在纸色谱上用紫外光、大多数黄酮类化合物在纸色谱上用紫外光灯检查时，可以看到有色斑点，以氨蒸汽处理灯检查时，可以看到有色斑点，以氨蒸汽处理后常产生明显的颜色变化后常产生明显的颜色变化附：黄酮与黄酮醇的斑点颜色变化附：黄酮与黄酮醇的斑点颜色变化滤纸上斑点颜色滤

19、纸上斑点颜色 可能结构可能结构UVUVUV/NHUV/NH3 3 深紫深紫黄或黄绿黄或黄绿（1 1）5-OH5-OH、4-OH4-OH黄酮黄酮（2 2）5-OH5-OH、4-OH 3-OR4-OH 3-OR黄酮醇黄酮醇（3 3）5-OH5-OH、33，4-OH4-OH黄酮黄酮（4 4）5-OH5-OH、34-OH 3-OR34-OH 3-OR黄酮醇黄酮醇亮 蓝 色亮 蓝 色荧光荧光黄绿或黄绿或 蓝绿色蓝绿色（1 1）无）无5-OH 5-OH 黄酮黄酮（2 2）无）无5-OH 5-OH 但有但有3-3-OROR（3 3）无）无5-OH 5-OH 但有但有33，44双双- -OHOH暗 黄 或橙色

20、无颜色变化无颜色变化（1 1）3-OH3-OH或或5-OR 5-OR 黄酮黄酮（2 2）3-OH3-OH、33，4-OH4-OH黄酮醇黄酮醇( (二二) )TLCTLC主要指吸附薄层主要指吸附薄层1 1、硅胶、硅胶TLCTLC 用途：分离与鉴定弱极性黄酮类化合物。用途：分离与鉴定弱极性黄酮类化合物。 分离黄酮苷元常用的展开剂：分离黄酮苷元常用的展开剂： 甲苯甲苯- -甲酸甲酯甲酸甲酯- -甲酸（甲酸（ 541 541 ）等。）等。 分离黄酮苷元的衍生物如甲醚、乙酸乙酯分离黄酮苷元的衍生物如甲醚、乙酸乙酯 等中性成分，常用的展开剂是：苯等中性成分，常用的展开剂是：苯- -丙酮丙酮（9191）或苯

21、）或苯- -乙酸乙酯（乙酸乙酯（7.52.57.52.5）等。）等。2 2、聚酰胺、聚酰胺TLCTLC 特点：特别适合于分离含游离酚羟基的特点：特别适合于分离含游离酚羟基的 黄酮及其苷类。黄酮及其苷类。 常用的展开剂：常用的展开剂： 乙醇乙醇- -水（水（3 3：2 2）、丙酮）、丙酮- -水（水（1 1：1 1）、）、 水饱和的正丁醇水饱和的正丁醇- -醋酸（醋酸（100100：1 1）等）等3 3、常用的薄层色谱显色方法、常用的薄层色谱显色方法 1 1）紫外灯下观察；）紫外灯下观察； 2 2）氨蒸气处理后观察颜色变化）氨蒸气处理后观察颜色变化 3 3）2 2 AlClAlCl3 3甲醇溶液

22、甲醇溶液三、紫外可见光谱在黄酮类化合物鉴定中的应用三、紫外可见光谱在黄酮类化合物鉴定中的应用（一）一般程序：（一）一般程序： 测定样品在甲醇溶液中的测定样品在甲醇溶液中的UVUV光谱；光谱； 在甲醇溶液中分别加入各种诊断试剂后，在甲醇溶液中分别加入各种诊断试剂后， 测紫外可见光谱；测紫外可见光谱； 常用的诊断试剂：常用的诊断试剂： 甲醇钠、醋酸钠、醋酸钠甲醇钠、醋酸钠、醋酸钠/ /硼酸、三氯化铝硼酸、三氯化铝以及三氯化铝以及三氯化铝/ /盐酸等盐酸等（二）黄酮类化合物在甲醇溶液中的（二）黄酮类化合物在甲醇溶液中的UVUV特征特征 OO+OO+OO+BenzoylBenzoyl( (苯甲酰基苯甲

23、酰基) ) cinnamoylcinnamoyl( (桂皮酰基桂皮酰基) )( (峰带峰带II II，220-280nm) 220-280nm) （峰带（峰带I I，300-400nm300-400nm） 反映反映A A环取代情况环取代情况 反映反映B B环取代情况环取代情况 1 1、黄酮与黄酮醇类：、黄酮与黄酮醇类： 在在200-400 nm200-400 nm之间都出现两个吸收峰，之间都出现两个吸收峰，二者峰形相似，但带二者峰形相似，但带位置不同，据此分类。位置不同，据此分类。 在黄酮及黄酮醇母核上，如在黄酮及黄酮醇母核上，如7-7-及及4 4 位引位引入羟基、甲氧基等供电子基，将引起相应

24、吸收入羟基、甲氧基等供电子基，将引起相应吸收带红移。带红移。 通常，整个母核上氧取代程度越高，带通常，整个母核上氧取代程度越高，带越向长波方向位移。越向长波方向位移。 带带的峰位主要受的峰位主要受A-A-环氧取代程度的影响；环氧取代程度的影响； B- B-环的取代基对带环的取代基对带的峰位影响甚微，但的峰位影响甚微，但可影响它的形状。可影响它的形状。 如黄酮及黄酮醇母核上的羟基甲基化或苷化如黄酮及黄酮醇母核上的羟基甲基化或苷化时，将引起带时，将引起带位置紫移；位置紫移； 如黄酮及黄酮醇母核上的羟基被乙酰化了，如黄酮及黄酮醇母核上的羟基被乙酰化了，则原来酚羟基对光谱的影响将完全消除。则原来酚羟基

25、对光谱的影响将完全消除。 2 2、查耳酮及橙酮类、查耳酮及橙酮类共同特征是带共同特征是带很强，为主峰；带很强，为主峰；带较弱，较弱，为次强峰。为次强峰。查耳酮中，带查耳酮中，带位于位于220220270nm270nm，带，带位位于于340340390390nmnm； 查耳酮中，如在环上引入了氧取代基，也引查耳酮中，如在环上引入了氧取代基，也引起带起带位置红移，尤其位置红移，尤其2-2-位引入位引入-OH-OH时影响时影响最大。最大。 查耳酮中，如查耳酮中，如2- OH2- OH被甲基化或苷化，被甲基化或苷化， 则引起带则引起带位置紫移。位置紫移。 橙酮中，常显现橙酮中，常显现3 34 4个吸收峰，但主要吸个吸收峰，但主要吸收峰（带收峰（带）一般位于）一般位于370370430 430 nmnm。 天然橙酮的带天然橙酮的带可能出现在可能出现在370370413 413 nmnm。3 3、异黄酮、二氢黄酮及二氢黄酮醇、异黄酮、二氢黄酮及二氢黄酮醇 这三类化合物中，除有由这三类化合物中，除有由A-A-环苯甲酰系统环苯甲酰系统引起的带引起的带吸收外，因吸收外，因B B环不与吡喃酮环上的环不与吡喃酮环上的羰基共轭（或共轭很弱），故带羰基共轭（或共轭很弱），故带很弱，常在很弱，常在主峰的长波方向处有一肩峰。主峰的长波方向处有一肩峰