聚合酶链式反应-2014

1、第三章第三章 聚合酶链式反应聚合酶链式反应 （polymerase chain reaction, PCR）聚合酶链反应聚合酶链反应称称皮克皮克(pg)水平的水平的DNA特异地扩增特异地扩增100万倍左右，达到微克万倍左右，达到微克( g)水平。水平。在分子生物学、基因工程研究，以及遗传病、在分子生物学、基因工程研究，以及遗传病、传染病和恶性肿瘤等基因诊断和研究中得传染病和恶性肿瘤等基因诊断和研究中得到广泛应用。到广泛应用。 70年代的初期由年代的初期由Dr. H. Klenow发现了较具有实验价值发现了较具有实验价值及实用性的及实用性的Klenow fragment of E. Coli ；

2、 1976年从年从 温泉中的细菌（温泉中的细菌（Thermus aquaticus）分离出）分离出来的来的Taq polymerase ，它的特性能，它的特性能耐高温耐高温。 80年代之年代之后它被广泛运用；后它被广泛运用； 1983年美国年美国Mullis等人发明了聚合酶链反应方法；等人发明了聚合酶链反应方法； 1985年美国年美国PE-Cetus公司开发出了具有应用价值的公司开发出了具有应用价值的PCR技术；技术； 1987年引入了耐高温的年引入了耐高温的DNA聚合酶，从而使聚合酶，从而使PCR成为成为一项成熟的技术，而迅速在世界各地推广。一项成熟的技术，而迅速在世界各地推广。 1993年

3、年Mullis也因此获得了诺贝尔化学奖。也因此获得了诺贝尔化学奖。PCR技术的发现技术的发现Kary B Mullis (1944-)l 1983 年提出年提出PCR方法方法l 19931993年度诺贝尔化学奖年度诺贝尔化学奖 一、一、PCR基本原理基本原理 PCR是一项是一项DNA体外合成技术体外合成技术，类似于生类似于生物体内的物体内的DNA复制过程。复制过程。 依据依据DNA半保留复制的机理。半保留复制的机理。 PCR合成合成DNA比细胞内复制过程简单。比细胞内复制过程简单。第一节第一节 PCR技术的原理和特点技术的原理和特点细胞内复制的过程细胞内复制的过程1）细胞内）细胞内有关蛋白质有

4、关蛋白质参与下，参与下，DNA双螺旋解双螺旋解链成两条链成两条单链单链，各自作为，各自作为模板模板。2）引物酶以两条单链为模板各自合成一段引）引物酶以两条单链为模板各自合成一段引物，物，引物引物提供提供3-OH末端。末端。3）DNA聚合酶聚合酶以亲代以亲代DNA单链为模板，以单链为模板，以dNTP为原料，按照碱基配对的原则，从引为原料，按照碱基配对的原则，从引物的物的3端，循端，循53方向，将脱氧核苷酸聚方向，将脱氧核苷酸聚合，最终形成子代的合，最终形成子代的DNA双链。双链。Denaturing95CAnnealingTm-5CExtension72CPCR的原理的原理PCR的基本过程的基本

5、过程1.变性变性：将反应体系升温至将反应体系升温至95左右，样品中左右，样品中双链双链DNA解开成解开成两条单链两条单链，各自作为各自作为模板模板（待拷贝的待拷贝的 DNA 称为模板）称为模板）。2.退火退火：将温度降至引物的将温度降至引物的Tm值以下值以下( (55左左右右) )，5端端和和3端端的的引物引物各自与两条单链各自与两条单链DNA模板模板的互补区域的互补区域结合结合。5533模板链模板链3端端引物引物5端端引物引物333. 延伸延伸：将温度升到将温度升到75左右左右，耐热耐热的的Taq DNA聚合酶催化四种聚合酶催化四种 dNTP，从，从引物引物3-OH端开始，依据模板碱基序列互

6、补方式端开始，依据模板碱基序列互补方式依次聚合，合成一条互补的依次聚合，合成一条互补的DNA链链。55335DNA聚合酶聚合酶5Cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循环后，模板次循环后，模板DNA的含量的含量可以扩大可以扩大100万倍以上。万倍以上。PCR的扩增效应的扩增效应 理论上，每增加理论上，每增加1个循环，双链个循环，双链DNA片段片段会增加会增加1倍，使倍，使DNA量可成指数量可成指数(2n)增加。增加。 实际上，扩增效应低于指数增加，约为实际上，扩增效应低于指数增加，约为(1+X)n。 一般进行一般进行30个左右的循环，特定区域

7、的个左右的循环，特定区域的DNA量可至少增加量可至少增加 106 倍。倍。PCR产物的积累规律产物的积累规律 PCR反应初期反应初期，目的，目的DNA片段的增加呈片段的增加呈指数扩增指数扩增。随着目的。随着目的DNA扩增产物的逐扩增产物的逐渐积累，酶的催化反应渐积累，酶的催化反应趋于饱和趋于饱和，此时，此时DNA扩增产物的增幅减慢，即出现扩增产物的增幅减慢，即出现“平平台效应台效应”。 到达平台期所需要的循环次数一般在到达平台期所需要的循环次数一般在30次次循环之后。循环之后。 PCR DNA复制复制部位部位： DNA体外合成放大过程 生物体内DNA合成引物：引物： DNA片段 RNA片段 （

8、作为新链的一部分） （复制终止时被切除）催化酶：催化酶：TaqDNA聚合酶 DNA聚合酶 有5 3核酸外切酶 有5 3核酸外切酶 无3 5核酸外切酶 有3 5核酸外切酶基本过程：基本过程：每循环一次包括 复制起始、链延伸和 变性、退火、延伸 终止三阶段反应实质：反应实质：扩增靶DNA 合成子代DNAPCR仪仪 聚合酶链反应中的聚合酶链反应中的变性、退火、变性、退火、延伸延伸的的温度温度和和时间时间，以及以及循环次数循环次数，是由是由具有程控的具有程控的快速升温快速升温和和快速降温快速降温装置的装置的PCR仪控制。仪控制。PCR仪仪越快，越精确，越昂贵ABI 7500实时荧光定量实时荧光定量PC

9、R仪仪 普通梯度普通梯度PCR仪仪二、二、PCR技术的特点技术的特点1. 高度的敏感性高度的敏感性：可将可将极微量极微量(pg)DNA，扩增，扩增到紫外光可见的水平到紫外光可见的水平( (ug) )，这是这是最主要的特最主要的特点点，PCR产物的生成量以指数方式增加，产物的生成量以指数方式增加，它它可对单拷贝基因、单个细胞、单根头发、一可对单拷贝基因、单个细胞、单根头发、一滴血等滴血等微量标本微量标本进行分析。进行分析。2. 高度的特异性高度的特异性：PCR扩增的特异性由扩增的特异性由两个引物的序列决定两个引物的序列决定，因此引物设计因此引物设计至关重要。至关重要。 引物与模板引物与模板DNA

10、特异正确的结合；特异正确的结合；遵循碱基配对原则；遵循碱基配对原则；Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；聚合酶合成反应的忠实性； 选择特异性与保守性高的靶基因。选择特异性与保守性高的靶基因。基因基因组组3. 适用样品的广泛性适用样品的广泛性： 对样品的要求并不对样品的要求并不十分严格：十分严格： 1) )可以是可以是DNA，也可以是，也可以是RNA 2) )可以是纯化的，也可以是粗制的可以是纯化的，也可以是粗制的 3) )可以是新鲜组织，也可以是陈旧组织可以是新鲜组织，也可以是陈旧组织 4) )可以是细胞，也可以是体液可以是细胞，也可以是体液4. 操作简便、快速操作简便、快速：PCR自动化，

11、数小时自动化，数小时完成。完成。扩增产物一般用电泳扩增产物一般用电泳分析，不一定要分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。用同位素，无放射性污染、易推广。 三、参与三、参与PCR反应体系反应体系 的因素及其作用的因素及其作用 模板模板 引物引物 Taq DNA聚合酶聚合酶 dNTP Mg2+ 缓冲液缓冲液 反应温度反应温度 循环次数循环次数 PCR仪等仪等n PCR体系体系（一）模板（一）模板核酸核酸 1. 1. 模板模板：指：指能扩增能扩增靶靶DNA片段片段的的核酸核酸2. 2. DNA是是直接模板直接模板，RNA是是间接模板间接模板 RNA样品必须先经过样品必须先经过逆转录逆转录生成

12、生成cDNA， cDNA作为作为PCR扩增扩增的的模板模板。这个技术称为。这个技术称为逆转录逆转录PCR（RT-PCR）。）。 病原体标本：病原体标本：有病毒、细菌、真菌、螺有病毒、细菌、真菌、螺旋体、立克次体、支原体等。旋体、立克次体、支原体等。 病理生理标本：病理生理标本：有细胞、血液、绒毛、有细胞、血液、绒毛、羊水细胞、尿液、上皮细胞、体外培养羊水细胞、尿液、上皮细胞、体外培养细胞系。细胞系。 法医学标本：法医学标本：有血斑、精斑、毛发等。有血斑、精斑、毛发等。 考古标本：考古标本：残留有核酸物质残留有核酸物质3. 3. 常见的扩增对象常见的扩增对象( (含核酸的标本含核酸的标本) )：

13、4.4.避免有影响扩增反应的物质存在避免有影响扩增反应的物质存在 如：如：核酸酶核酸酶：降解降解DNA、RAN 蛋白酶：降解蛋白酶：降解Taq DNA聚合酶聚合酶 血红素、抗凝剂：抑制血红素、抗凝剂：抑制Taq DNA聚合酶聚合酶活性活性理论上，要获得最好的特异性及忠实性的扩理论上，要获得最好的特异性及忠实性的扩增只向反应体系中加入增只向反应体系中加入单一拷贝的靶序列单一拷贝的靶序列DNA作为模板。作为模板。 人基因组人基因组DNA0.1-1 g大肠杆菌基因组大肠杆菌基因组DNA10-100 ngDNA0.5-5 ng质粒质粒DNA0.1-10 ng5. 模板量要合适模板量要合适，一般，一般为

14、为102105拷贝。拷贝。50l PCR反应体系中模板反应体系中模板DNA推荐使用量推荐使用量 （二）引（二）引 物物1）引物：）引物：2条条人工合成的、能与模人工合成的、能与模板板DNA互补结合的互补结合的脱氧寡核苷脱氧寡核苷酸。酸。1. 1. 引物的性质和作用引物的性质和作用2）引物的序列引物的序列：根据：根据欲扩增的欲扩增的DNA片片段段两端序列两端序列而设计的而设计的。5端引物：端引物：与模板链的与模板链的5端序列端序列相同相同；3端引物端引物：与模板链的：与模板链的3端序列端序列互补互补。5533模板链模板链3端端引物引物5端端引物引物333)3) 引物决定引物决定PCR扩增产物的扩

15、增产物的特异性特异性和和 长度长度。4) ) 引物设计决定引物设计决定PCR反应的成败。反应的成败。特异性特异性：引物只针对引物只针对DNA的一个特定序列的一个特定序列互补结合，互补结合，因此因此2条引物与条引物与DNA模板模板特异性结合决定了要扩增的特异性结合决定了要扩增的DNA区区域。域。长度长度：2条引物分别互补于所要扩增条引物分别互补于所要扩增DNA片段的两端，使片段的两端，使DNA片段的片段的扩增只扩增只限于引物之间的部位限于引物之间的部位。2. 引物设计的基本要求引物设计的基本要求1）引物长度要合适引物长度要合适，一般为，一般为1630个核个核苷酸，苷酸，常用常用20bp左右。左右

16、。 引物过短引物过短：会影响：会影响PCR的特异性；的特异性； 引物过长引物过长：需提高相应的退火温度：需提高相应的退火温度2）G+C含量一般占含量一般占4060，有利于引物有利于引物与模板的结合。与模板的结合。G C太少扩增效果不佳，太少扩增效果不佳，G C过多易出现非特异条带。过多易出现非特异条带。3） ATCG 4 种碱基随机分布，种碱基随机分布，避免连续出现避免连续出现3个以上相同的个以上相同的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列，最好随机分布。列，最好随机分布。否则易使引物与模板否则易使引物与模板的的嘌呤或嘧啶密集区嘌呤或嘧啶密集区发生错配。发生错配。4）引物引物内部内

17、部不能存在互补序列，不能存在互补序列，以避免形成以避免形成发夹结构。发夹结构。5）两个引物两个引物之间之间不能存在互补序列，不能存在互补序列，以避免以避免形成形成引物二聚体。引物二聚体。6）引物与非特异性序列的同源性不能超过引物与非特异性序列的同源性不能超过70%或不能连续或不能连续8个碱基互补，个碱基互补，否则导致非否则导致非特异性扩增。特异性扩增。7）引物引物3末端碱基一定要与模板正确配对，末端碱基一定要与模板正确配对，引引物物3端最佳碱基选择是端最佳碱基选择是G和和C。8）引物的引物的5端可以修饰，端可以修饰，如：引入酶切位点、如：引入酶切位点、启动子序列、用荧光素、生物素等标记等启动子

18、序列、用荧光素、生物素等标记等9）引物扩增跨度：引物扩增跨度： 以以200-500bp为宜，特定条为宜，特定条件下可扩增长至件下可扩增长至10kb的片段。的片段。 3GC3.3.引物的使用要求引物的使用要求 引物浓度要远高于模板浓度，引物浓度要远高于模板浓度，以最低引物量以最低引物量产生所需要的结果为好。引物浓度产生所需要的结果为好。引物浓度偏高偏高会引会引起错配和起错配和非特异性非特异性扩增，且可增加引物之间扩增，且可增加引物之间形成形成二聚体二聚体的机会。的机会。 合适的退火温度比引物本身的合适的退火温度比引物本身的Tm低低 5 ，一般在一般在 55 左右。左右。（三）（三）Taq DNA

19、聚合酶聚合酶 Taq DNA聚合酶是从一种水生栖聚合酶是从一种水生栖嗜热菌嗜热菌YT1株株(嗜热嗜热真菌真菌)分离提取出来，该酶基因全长分离提取出来，该酶基因全长2.49kb，编码，编码832个氨基酸。该酶虽然在个氨基酸。该酶虽然在90以上几乎无以上几乎无DNA合成，合成， 但但确有良好的热稳定性确有良好的热稳定性。（天然酶）。（天然酶） 另一类通过基因工程合成的酶。（基因工程酶）另一类通过基因工程合成的酶。（基因工程酶） Taq DNA聚合酶的聚合酶的热稳定性热稳定性是该酶用于是该酶用于PCR反应的反应的前提条件，也是前提条件，也是PCR反应能迅速发展和广泛应用的原反应能迅速发展和广泛应用的

20、原因。因。(一一)酶活性与热稳定性酶活性与热稳定性1）酶蛋白分子量）酶蛋白分子量 94KDa，比活性，比活性200 000/mg，Taq酶的酶的浓度浓度通常通常为为12.5/ l，太多太多浪费并易导致浪费并易导致非非特异性扩增。特异性扩增。 2）热稳定性好：能耐受热稳定性好：能耐受DNA变性时的高温变性时的高温 在在92.5、95 、97.5时，时，PCR混合物中的混合物中的Taq DNA聚合酶分别经聚合酶分别经130min、40min、5min后，仍可后，仍可保持保持50%的活性。的活性。 PCR反应时变性温度为反应时变性温度为9520sec，50个循环后，个循环后，Taq DNA聚合酶仍有

21、聚合酶仍有65%的活性。的活性。 1）Taq DNA聚合酶是聚合酶是Mg2+ 依赖性酶，对依赖性酶，对Mg2+ 浓度非常浓度非常敏感。敏感。2）Mg2+浓度浓度2.0mmol/L时，能最大限度地激活时，能最大限度地激活TaqDNA聚合酶的活性。聚合酶的活性。3）Mg2+ 能与能与dNTP结合而降低结合而降低PCR反应液中游离的反应液中游离的Mg2+ 浓度，浓度，优化浓度优化浓度一般反应一般反应 中中Mg2+ 浓度至少应比浓度至少应比dNTP总浓度高总浓度高0.51.0 mmol/L。4）适当浓度的）适当浓度的KCl能使能使Taq DNA聚合聚合 酶的催化活性提高酶的催化活性提高5060%。(二

22、二)离子依赖性离子依赖性1）TaqDNA聚合酶具有聚合酶具有53 聚合酶活性聚合酶活性和和53外外切酶活性切酶活性，而，而无无3 5外切活外切活 性性，在，在PCR反应中如反应中如发生某些碱基的错配，该酶是发生某些碱基的错配，该酶是没有校正没有校正功能功能。Taq DNA聚合酶的碱基错配机率为聚合酶的碱基错配机率为2.110-4。2）Taq DNA聚合酶还具有逆转录酶活性聚合酶还具有逆转录酶活性.(三三)忠实性忠实性(四四) Taq酶的最适温度酶的最适温度 7580可延伸约可延伸约150个脱氧核苷酸个脱氧核苷酸/秒秒/酶分子，酶分子，70延伸率大于延伸率大于60个脱氧核苷酸个脱氧核苷酸/秒秒/

23、酶分子，酶分子，55时为时为22个脱氧核苷酸个脱氧核苷酸/秒秒/酶分子。最适温度酶分子。最适温度75左右。左右。 （四）原料（四）原料 原料：原料：四种脱氧核苷三磷酸四种脱氧核苷三磷酸( (dNTP) )：浓度为浓度为 20200mol/L。 Mg2+：为为Taq 酶的酶的必需激活剂必需激活剂。 浓度为浓度为0.52.5mmol/L。 太少：太少：酶活性明显降低；酶活性明显降低； 太多太多：导致非特异性扩增。：导致非特异性扩增。（五）（五） Mg2+反应温度和时间反应温度和时间1. 变性：变性： 95，30”1 双链双链DNA变成单链。变成单链。2. 退火：退火：55，30”1 引物与模板互补

24、结合。引物与模板互补结合。退火退火温度对特异性影响很大。温度对特异性影响很大。退火温度退火温度=Tm值值-(510) Tm值值= 4(G+C)2(A+T） Tm值值= 62.3 0.41(G-C%)3. 延伸：延伸：7275， 1 2 Taq 酶催化酶催化dNTP，从引物从引物3-OH端开始，与模板互补，端开始，与模板互补，合成一条新的合成一条新的DNA链链。小于小于20bp片段片段大于大于20bp片段片段 反应缓冲液：反应缓冲液：常用常用10mmol/L Tris-HCl缓冲缓冲液，液，pH8.38.8为为Taq 酶最适酶最适pH值值。 循环次数：循环次数：主要取决于模板主要取决于模板DNA

25、的起始浓度，的起始浓度，合适的循环数为合适的循环数为25 30次次。 循环数太少：产物量不多循环数太少：产物量不多 循环数太多：非特异性扩增会增加，出现循环数太多：非特异性扩增会增加，出现平台效应平台效应PCR反应体系反应体系5扩增缓冲液扩增缓冲液 10ul 4种种dNTP混合物混合物 各各200umol/L 引物引物 各各10100pmol 模板模板DNA 0.12ug Taq DNA聚合酶聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加双蒸水至加双蒸水至 50ul 1.无扩增产物模板模板: :含有抑制物，含量含有抑制物，含量低低BufferBuffer对样品不合适对样品不合适引物设计不当

26、或者发生降引物设计不当或者发生降解解反应条件：退火温度太低反应条件：退火温度太低延伸时间太短延伸时间太短 原原因因对对策策纯化模板或者使用试剂盒纯化模板或者使用试剂盒提取模板提取模板DNADNA或加大模板或加大模板的用量的用量更换更换BufferBuffer或调整浓度或调整浓度重新设计引物（避免链间重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物或者换一管新引物提高退火温度、延长延伸提高退火温度、延长延伸时间时间现象：对照组有条带，而样品则无对照组有条带，而样品则无；2. 非特异性扩增 现象：现象：PCRPCR扩增后出现的条带与预计的大扩增后出现的条带与预计的

27、大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。扩增带与非特异性扩增带。引物特异性差引物特异性差模板或引物浓度过模板或引物浓度过高高酶量过多酶量过多MgMg2+2+浓度偏高浓度偏高循环次数过多循环次数过多 原原因因对对策策重新设计引物重新设计引物适当降低模板或引物适当降低模板或引物浓度浓度适当减少酶量适当减少酶量降低降低Mg2+浓度浓度减少循环次数减少循环次数 非特异性扩增3.拖尾 现象现象：产物在凝胶上呈拖尾状态产物在凝胶上呈拖尾状态。 M 1 2模板不纯模板不纯降解降解退火温度偏低退火温度偏低酶量过多酶量过多dNTPdNTP、MgMg2

28、+2+浓度偏浓度偏高高循环次数过多循环次数过多 原原因因对对策策纯化模板纯化模板改变条件改变条件适当提高退火温度适当提高退火温度适量用酶适量用酶适当降低适当降低dNTPdNTP和和MgMg2+2+的浓度的浓度减少循环次数减少循环次数拖尾4.假阳性 原因：靶序列或扩增产物的交叉污染靶序列或扩增产物的交叉污染 现象：空白对照出现目的扩增产物空白对照出现目的扩增产物 对策： 操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；溅出离心管外； 除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒高压消毒。所用

29、离心管及加样枪头等均应一次性使。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。用。 各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。 五、五、 PCR实验注意事项实验注意事项 由于由于PCR的的灵敏性极高灵敏性极高，故，故微量的样品污染便微量的样品污染便可导致可导致假阳性假阳性结果的出现结果的出现。所有的溶液都应该所有的溶液都应该没有核酸和核酸酶的没有核酸和核酸酶的污染污染 采取的措施：采取的措施： 1）隔离不同的操作区）隔离不同的操作区 2）采用一次性用具）采用一次性用具 3）严格按无菌操作原则进行）严格按无菌操作原则进行 4）并设置严格的对照，以提高）并设置严格的对照，

30、以提高PCR结果的正结果的正确性。确性。除实验样品外，除实验样品外，应设几种实验对照应设几种实验对照：1）阳性对照：阳性对照：阳性阳性DNA模板参与的模板参与的PCR反反应；应；阳性对照要选择扩增度中等、重复阳性对照要选择扩增度中等、重复性好，经各种鉴定是该产物的标本。性好，经各种鉴定是该产物的标本。2）阴性对照：阴性对照：无核酸模板参与的无核酸模板参与的PCR反应；反应；在在PCR试剂中不加模板试剂中不加模板DNA或或RNA，进，进行行PCR扩增，以检测试剂是否污染。扩增，以检测试剂是否污染。示例电泳结果示例电泳结果 1 2 3 4 5 MM：DNA marker1：为阳性对照：为阳性对照2

31、：为阴性对照：为阴性对照3-5：为扩增出的：为扩增出的DNA条带条带六、六、 PCR技术技术的主要用途的主要用途PCR利用特异性引物以利用特异性引物以cDNA或基因组或基因组DNA为模为模板获得已知目的基因片段板获得已知目的基因片段, 或与逆转录反应或与逆转录反应相结合，直接以组织和细胞的相结合，直接以组织和细胞的mRNA为模为模板获得目的片段。板获得目的片段。1. 目的基因的克隆目的基因的克隆+A正常人(+)A病 人(-)病原微生物基因正常人 (-)病 人 (+)2. 基因检测基因检测APCR-ASO检测基因检测基因点突变点突变：主是利用：主是利用PCR技技术扩增靶基因的适当片段，然后用人工

32、合成术扩增靶基因的适当片段，然后用人工合成的含突变位点的的含突变位点的标记寡核苷酸探针标记寡核苷酸探针杂交杂交探针杂交NC膜探针restriction fragment length polymorphism 限制性片段长度多态体限制性片段长度多态体3. DNA和和RNA的微量分析的微量分析PCR技术高度敏感，对模板技术高度敏感，对模板DNA的量要的量要求很低，是求很低，是DNA和和RNA微量分析的微量分析的最好最好方方法。法。 PCR后将后将待测待测DNA片段既可克隆到特定片段既可克隆到特定的载体进行序列测定，可直接测定。的载体进行序列测定，可直接测定。PCR技术引入技术引入DNA序列测定，

33、使测序工序列测定，使测序工作大为简化，也提高了测序的速度；作大为简化，也提高了测序的速度；使用引物对靶序列进行扩增，就可掺入同位使用引物对靶序列进行扩增，就可掺入同位素或非同位素标记的各种碱基，获得所需比活性素或非同位素标记的各种碱基，获得所需比活性的探针的探针 。4. DNA序列测定序列测定5. 用用PCR标记标记DNA探针探针mRNA 第二节第二节 常用几种常用几种PCR反应反应 1)RNase1)RNase2)2)碱性液碱性液( (水解水解RNA) ) 单链单链DNA逆转录酶逆转录酶 ( (使使dNTP 聚合聚合) )RNA-DNA杂化链杂化链PCR 一、逆转录一、逆转录 PCRDNA

34、聚合酶聚合酶双链双链DNA( (使使dNTP 聚合聚合) )PCR 二、实时二、实时 PCR 实时实时PCR（real-time polymerase chain reaction）又称荧光定量又称荧光定量PCR。是指在。是指在PCR反应体系中加入荧光反应体系中加入荧光化学物质，随着化学物质，随着 PCR 反应的进行，反应的进行， PCR 反应产物不反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加，利用荧光信号断累计，荧光信号强度也等比例增加，利用荧光信号积累积累实时实时监测整个监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未进程，最后通过标准曲线对未知模板进行知模板进行定量分析定量分析的方法。的方法。 荧

35、荧 实时实时PCR(real-time PCR)技术通过动态监测反技术通过动态监测反应过程中的产物量，消除了产物堆积对定量分应过程中的产物量，消除了产物堆积对定量分析的干扰，亦被称为定量析的干扰，亦被称为定量PCR，得到广泛应用。，得到广泛应用。 IPCRPCR引物引物n实时实时PCR技术原理技术原理引物之间一段带有标记寡核苷酸链，称作探针引物之间一段带有标记寡核苷酸链，称作探针报告基团报告基团淬灭基团淬灭基团无荧光信号产生无荧光信号产生能量能量激发光激发光完整的探针：完整的探针：5端荧光基团吸收能量后将能量端荧光基团吸收能量后将能量转移给临近的转移给临近的3端荧光淬灭基团（发生荧光共端荧光淬

36、灭基团（发生荧光共振能量转移）振能量转移） ? 53外切酶活性外切酶活性 将探针将探针5端连接的荧光基团端连接的荧光基团从探针上切割下来从探针上切割下来n实时实时PCR技术原理技术原理QR3355上游上游引物引物下游下游引物引物荧光标记分子荧光标记分子RQ 3355荧光报荧光报告分子告分子荧光淬灭荧光淬灭分子分子荧光信号SYBR Green I作用机理EmissionEmissionSYBR Green I作用机理ExcitationEmission 原位原位PCR(In Situ PCR,IS-PCR)是是进行原位扩增进行原位扩增进行定性定量进行定性定量定位定位分分析。析。 把把原位杂交原位

37、杂交的细胞定位技术与的细胞定位技术与PCR的高灵敏的高灵敏度相结合的技术。度相结合的技术。三、原位三、原位 PCR 待检标本先经化学固定，以保持组织细胞的良好形待检标本先经化学固定，以保持组织细胞的良好形态结构。细胞膜和核膜均具有一定的态结构。细胞膜和核膜均具有一定的通透性通透性，PCR扩扩增时，各种成分，如引物，增时，各种成分，如引物，DNA聚合酶，聚合酶，dNTP等均等均可进入细胞内或细胞核内。可进入细胞内或细胞核内。 以固定在细胞内或细胞核内的以固定在细胞内或细胞核内的RNA或或DNA为模板为模板，于于原位原位进行扩增。扩增的产物一般分子较大，或互相进行扩增。扩增的产物一般分子较大，或互相交织，不易穿过细胞膜或在膜内外弥散，被保留在原交织，不易穿过细胞膜或在膜内外弥散，被保留在原位。使原