细胞实验技术-课堂PPT-第二讲

1、Passage culture of adherent cell lines (subculture)Methods in Cell Biology细胞株传代培养细胞株传代培养原理原理 细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。 传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。 培养细胞的生长和增殖过程培养细胞的生长和增殖过程 1. 1. 培养细胞生命期（培养细胞生命期（Life Span of Culture CellsLife Sp

2、an of Culture Cells）指细胞在整个离体培养过程中持续增殖和生长的时间，分指细胞在整个离体培养过程中持续增殖和生长的时间，分为：原代培养期、传代期和衰退期。为：原代培养期、传代期和衰退期。2. 2. 组织培养细胞一代生存期组织培养细胞一代生存期 所谓细胞所谓细胞“一代一代”一词一词，仅指从细胞接种到分离再培养时的一段时间，这已成，仅指从细胞接种到分离再培养时的一段时间，这已成为培养工作中的一种习惯说法，它与细胞倍增一代非同为培养工作中的一种习惯说法，它与细胞倍增一代非同一含义。一含义。如某一细胞系为第如某一细胞系为第153153代细胞，即指该细胞系已传代代细胞，即指该细胞系已传

3、代153153次。它与细胞世代（次。它与细胞世代（GenerationGeneration）或倍增或倍增( ( DoublingDoubling）不同；在细胞一代中，细胞能倍增不同；在细胞一代中，细胞能倍增3 36 6次。次。培养细胞一代生长过程培养细胞一代生长过程（一）潜伏期（潜伏期（Latent Latent phasephase）： 细胞从接种到贴壁生长繁殖的一段时间。n二倍体细胞该期时间长（24-96h）n连续细胞系时间短（10-30min）（二）指数生长期： 细胞增殖最旺盛时期，一般用细胞分裂指数（Mitotic index，MI）表示，即细胞群中每1000个细胞中的分裂细胞数。 体

4、外培养细胞分裂指数介于0.1-0.5%，且受细胞种类培养液成分、pH、温度等影响。n指数生长期是细胞活力最好的时期，可对细胞进行各种实验n指数生长期持续3-5d后，随细胞数量不断增多，生长空间日趋减少，细胞相互接触汇合成片，呈现接触抑制。而恶性细胞则无接触抑制现象。n癌细胞则由于营养成分的消耗和细胞代谢产物的影响而发生密度抑制（三）停滞期： 即细胞数量达到饱和密度后，细胞与营养液的交换面积减少，代谢产物积累，pH下降细胞停止增殖，进入停滞期。 在此时应及时进行传代，否则因细胞中毒受损，大量细胞出现死亡，至少再传1-2代后，细胞才能恢复。细胞传代方法细胞传代方法1悬浮生长细胞传代悬浮生长细胞传代

5、 离心法传代：离心（离心法传代：离心（1000转转/分分）去上清，沉淀物加新培养液后再混）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。匀传代。 直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除l2-23，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。2 半悬浮生长细胞传代半悬浮生长细胞传代（Hela细胞）此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。 3贴壁生长细胞传代贴壁生长细胞传代 采

6、用酶消化法传代。常用的消化液有采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液。的胰蛋白酶液。Passage culture of adherent cell lines(subculture)Overview: Remove medium from culture container,rinse with PBS,expose cells to trypsin,incubate, stop trypsin activity by adding serum containing medium, dissociate cells, dilute and return to incubator

7、.贴壁细胞传代培养过程n1. 弃去培养瓶中的培养液。加入23ml的PBS或D-Hanks液，轻轻振荡漂洗细胞，以除去悬浮在细胞表面的碎片。贴壁细胞传代培养过程n2、加入0.5-1 ml 0.25的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准），静置2-5 min（倒置显微镜下动态监测），待细胞单层收缩突起出现空隙时，终止消化。刚加入刚加入合适合适过头过头3. 加入加入3倍胰酶体积的完全培养液。用吸管吸取瓶内培倍胰酶体积的完全培养液。用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液。养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液。4. 收集细胞悬液于离心管中，室温离心收集细胞悬液于离心管中，室温离心5分钟。

8、分钟。5. 去上清，加适量新鲜培养液重悬细胞，吸取一定量至去上清，加适量新鲜培养液重悬细胞，吸取一定量至有新培养皿中，添加适量新鲜完全培养基。有新培养皿中，添加适量新鲜完全培养基。 余下的细余下的细胞悬液接种于原来的培养皿内。胞悬液接种于原来的培养皿内。6. 将培养皿放入培养箱中培养。将培养皿放入培养箱中培养。注意事项1 1传代培养时要注意传代培养时要注意无菌操作无菌操作并防止细胞之间的交叉污并防止细胞之间的交叉污染。所有操作要尽量靠近酒精灯火焰。每次最好只进行染。所有操作要尽量靠近酒精灯火焰。每次最好只进行一种细胞的操作。每一种细胞使用一套器材。培养用液一种细胞的操作。每一种细胞使用一套器材

9、。培养用液应严格分开。应严格分开。 2 2传代时间的掌握传代时间的掌握：每天观察细胞形态，掌握好细胞是：每天观察细胞形态，掌握好细胞是否健康的标准：健康细胞的形态饱满，折光性好，生长否健康的标准：健康细胞的形态饱满，折光性好，生长致密时即可传代。致密时即可传代。 3 3、消化时间的掌握消化时间的掌握1. Pipette off spent medium and discard2. Add PBS to the flask, being careful not to disturb the monolayer. Rinse the monolayer by gently rocking the

10、flask back and forth. Remove the PBS and discard.3. Add trypsin and rock the flask to ensure that the entire monolayer is covered with the trypsin solution.4. Incubate until the cells begin to detach. 5. Add serum-containing medium and pipette the cells up and down until the cells are dispersed into

11、 a single cell suspension.6. Count the cell either by hemocytometer or Coulter counter and dilute to the appropriate concentration for seeding.7. Add the appropriate volume of cell suspension to a new flask containing medium.8. Place flask in incubator, loose the cap turn to allow for gas exchange.D

12、iscussion Serum contains trypsin inhibors.Thus it is important to remove traces of serun in step 2.The serum in the medium in step 5 will inactivate the remaing trypsin and prevent cell damage.If dealing with a serum-free medium, it may be necessary to use an alternative trypsin inhibitor such as so

13、ybean trypsin inhibitor.The incubation time for the trypsin and the degree of force reqired to get the cells into single cell suspension varies between cell lines.It may be necessary to adjust these parameters to suit your particular cells.本次课内容：传代培养本次课内容：传代培养(RSC96)1. 弃去培养瓶中的培养液。弃去培养瓶中的培养液。加入加入23ml的的PBS液，轻轻振荡漂洗细胞，除去悬液，轻轻振荡漂洗细胞，除去悬浮在细胞表面的碎片。浮在细胞表面的碎片。2. 加入加入0.5-1 ml 0.25的胰蛋白酶液，轻轻震荡之后去掉，在显微镜下动态监的胰蛋白酶液，轻轻震荡之后去掉，在显微镜下动态监测。测。3. 加入加入3ml完全培养液，用吸管吸取瓶内培养液，反复