章基因重组与基因工程PPT学习教案

1、会计学1第1页/共76页第2页/共76页第3页/共76页 接合作用接合作用第4页/共76页 转化作用转化作用第5页/共76页第6页/共76页第7页/共76页19721972年，伯格首次证明可以用两种不同物种的基因来人工合成年，伯格首次证明可以用两种不同物种的基因来人工合成DNADNA分子分子. . 因在核酸的生化领域完成的重大研究获得了因在核酸的生化领域完成的重大研究获得了19801980年的诺贝尔化学奖。年的诺贝尔化学奖。 加州大学旧金山分校的赫伯特加州大学旧金山分校的赫伯特博耶和斯坦福大学的斯坦利博耶和斯坦福大学的斯坦利科恩公布了他们的重组试验。他们使用的是大肠杆菌中具有抗四环素功能的科恩

2、公布了他们的重组试验。他们使用的是大肠杆菌中具有抗四环素功能的pSC101pSC101质粒，通过在这个质粒中嵌入能够抗卡那霉素的基因，含有该质粒的大肠杆菌就可以在同时加入了四环素和卡那霉素的培养基中生存繁殖。质粒，通过在这个质粒中嵌入能够抗卡那霉素的基因，含有该质粒的大肠杆菌就可以在同时加入了四环素和卡那霉素的培养基中生存繁殖。第8页/共76页名词解释第9页/共76页重组重组DNADNA分子的获得分子的获得重组重组DNADNA分子的扩增（克隆）分子的扩增（克隆）第10页/共76页 生物技术工程生物技术工程: : 基因工程、蛋白质工程、基因工程、蛋白质工程、 酶工程、细胞工程等酶工程、细胞工程等

3、 目的目的 : 1 1、获得大量某一感兴趣的基因或、获得大量某一感兴趣的基因或DNADNA序列序列 2 2、获得感兴趣基因的表达产物、获得感兴趣基因的表达产物( (蛋白质蛋白质) )基因工程基因工程- 实现基因克隆所采用的方法实现基因克隆所采用的方法 及相关的工作称基因工程及相关的工作称基因工程, , 又称重组又称重组DNADNA工艺学。工艺学。 第11页/共76页（二）（二） 工具酶工具酶第12页/共76页BamH I第13页/共76页第14页/共76页斜体斜体第15页/共76页二元旋转对称二元旋转对称BamH IEcoR VGATATCCTATAGGAT ATCCTA TAG+平末端切口平

4、末端切口第16页/共76页BamH IBst I同功异源酶同功异源酶第17页/共76页BamH IBgl II同尾酶同尾酶第18页/共76页第19页/共76页第20页/共76页载载体体的的选选择择标标准准第21页/共76页第22页/共76页定义：存在于细菌染色体外的小型环状双链定义：存在于细菌染色体外的小型环状双链DNADNA分子。分子。特点：能在宿主细胞独立自主地进行复制特点：能在宿主细胞独立自主地进行复制 带有某些遗传信息，赋予宿主细胞一定的遗传性状带有某些遗传信息，赋予宿主细胞一定的遗传性状1 1、质粒、质粒第23页/共76页ori第24页/共76页多克隆位点多克隆位点(multipul

5、 cloning site, MCS):(multipul cloning site, MCS): 人为添加的一段人为添加的一段核苷酸序列，约几十个核苷酸，含有多个酶的单一酶切位点。核苷酸序列，约几十个核苷酸，含有多个酶的单一酶切位点。第25页/共76页表达载体除具有克隆载体的基本元件外，还具有表达所需元件：表达载体除具有克隆载体的基本元件外，还具有表达所需元件：原核表达载体原核表达载体 启动子启动子 转录终止序列转录终止序列 核糖体结合位点（核糖体结合位点（RBSRBS）真核表达载体真核表达载体 启动子启动子 Poly(A) signalPoly(A) signal 增强子增强子（有（有/

6、/无）无）第26页/共76页2 2、噬菌体、噬菌体第27页/共76页噬菌体噬菌体DNADNA改造系统改造系统第28页/共76页第29页/共76页EEEEEEInsertEEEEDigestLigateEcoRIEEEEE EDigestLigateInsert置换型置换型插入型插入型第30页/共76页M13M13是一种线状、单链是一种线状、单链DNADNA噬菌体噬菌体 ，只感染雄性大肠杆菌，感染细菌后，经过复制转变为双链的复制型，复制型，只感染雄性大肠杆菌，感染细菌后，经过复制转变为双链的复制型，复制型M13M13可用作克隆载体。可用作克隆载体。第31页/共76页3 3、粘性质粒（、粘性质粒（

7、cosmidcosmid）一种克隆载体，由质粒和噬菌体的一种克隆载体，由质粒和噬菌体的coscos粘性末端构建而称成，粘性末端构建而称成，容量可达容量可达50Kb50Kb。COSCOS粘性末端：粘性末端：在在噬菌体线性双链噬菌体线性双链 DNADNA分子的两端，各有一条由分子的两端，各有一条由1212个核苷酸组成的彼此完全互补的个核苷酸组成的彼此完全互补的55单链突出序列。单链突出序列。第32页/共76页容量大，容量大， 酵母人工染色体可携带酵母人工染色体可携带 长约长约 0.5-2Mb0.5-2Mb外源外源DNADNA片段片段, , 细菌人工染色体可携带约细菌人工染色体可携带约0.1-0.4

8、Mb0.1-0.4Mb外源外源DNADNA片段。片段。4 4、其他、其他可携带外源可携带外源DNADNA入哺乳动物细胞中，因此可用于基因治疗。入哺乳动物细胞中，因此可用于基因治疗。第33页/共76页第34页/共76页第35页/共76页化学合成法化学合成法 利用利用DNADNA合成仪合成，适用于编码小分子多肽链的基因的合成。合成仪合成，适用于编码小分子多肽链的基因的合成。要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。第36页/共76页 分离组织或细胞染色体分离组织或细胞染色体DNADNA基因片断基因片断克隆载体克隆载体重组重组DNADNA分

9、子分子含重组分子的转化菌含重组分子的转化菌鉴定文库的克隆数和特征鉴定文库的克隆数和特征限制性内切酶限制性内切酶受体菌受体菌基因组基因组DNADNA文库文库： 存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNADNA的集合。的集合。从基因组从基因组DNADNA文库中文库中获取目的基因获取目的基因第37页/共76页名词解释第38页/共76页第39页/共76页 从从cDNAcDNA文库中获取目的基因文库中获取目的基因组织或培养细胞组织或培养细胞载载 体体mRNA cDNAcDNAcDNA与载体连接与载体连接导入大肠杆菌导入大肠杆菌 含重组分子的转化菌含重组

10、分子的转化菌鉴定鉴定cDNAcDNA文库的克隆数与特征文库的克隆数与特征第40页/共76页名词解释第41页/共76页第42页/共76页第43页/共76页DNA ligase第44页/共76页第45页/共76页GAATTCCTTAAGEcoR IG AATTCCTTAA GEcoR IEcoR I同一限制酶切位点的连接同一限制酶切位点的连接自连？方向？自连？方向？第46页/共76页不同限制酶切位点的连接不同限制酶切位点的连接最常用最常用第47页/共76页自连？方向？自连？方向？第48页/共76页第49页/共76页第50页/共76页（四）重组（四）重组DNADNA导入受体细胞导入受体细胞第51页/

11、共76页 低渗使细胞膨胀低渗使细胞膨胀E. coli + 0.1M CaCl21 1、氯化钙法：低渗、氯化钙法：低渗 + + 热休克热休克细胞处于感受态细胞处于感受态热休克使细胞进一步膨胀，膜通透性更强热休克使细胞进一步膨胀，膜通透性更强重组重组DNADNA进入受体细胞进入受体细胞2 2、电穿孔：、电穿孔：利用高脉冲电流在细胞表面打孔，利用高脉冲电流在细胞表面打孔， 重组重组DNADNA分子经孔进入受体细胞。分子经孔进入受体细胞。第52页/共76页- 针对载体携带某种针对载体携带某种/ /些标志基因和目的基因些标志基因和目的基因 而设计的筛选方法而设计的筛选方法第53页/共76页EcoRI1.

12、1.外源基因插入外源基因插入EcoR I EcoR I 位点，位点， 重组重组DNADNA分子为分子为ampampr r, tet, tetr r, , 含有重组含有重组DNADNA的受体菌在含有的受体菌在含有 ampamp和和tettet的培养板上能够存活。的培养板上能够存活。 抗药性标记选择抗药性标记选择 初步筛选初步筛选Question： 含有自连质粒含有自连质粒的受体菌？的受体菌？第54页/共76页 插入失活插入失活3.3.外源基因插入外源基因插入BamH IBamH I位点，位点， 重组重组DNADNA分子为分子为ampampr r, tet, tets s 含有重组含有重组DNAD

13、NA的受体菌在含的受体菌在含 ampamp的培养板上存活，在的培养板上存活，在 含有含有tettet的培养板上死亡。的培养板上死亡。2.2.外源基因插入外源基因插入Pst IPst I位点，位点， 重组重组DNADNA分子为分子为ampamps s, tet, tetr r 含有重组含有重组DNADNA的受体菌在含的受体菌在含 tettet的培养板上存活，在的培养板上存活，在 含有含有tettet的培养板上死亡。的培养板上死亡。EcoRI第55页/共76页第56页/共76页标志补救标志补救 有些载体有些载体(pUC18)(pUC18)具有一段大肠杆菌具有一段大肠杆菌半乳糖苷酶的启动子及其氨基端

14、肽链（半乳糖苷酶的启动子及其氨基端肽链（肽）的肽）的DNADNA序列，此结构称为序列，此结构称为lac Zlac Z基因。而一些宿主菌突变体（基因。而一些宿主菌突变体（JM109) JM109) 具有编码具有编码半乳糖苷酶羧基端肽链（半乳糖苷酶羧基端肽链（片段）片段）的的DNADNA序列。单独存在的序列。单独存在的肽和肽和片段片段各自都不具有酶活性，但它们可以通过片段互补的机制形成具有功能活性的各自都不具有酶活性，但它们可以通过片段互补的机制形成具有功能活性的半乳糖苷酶分子。半乳糖苷酶分子。Lac ZLac Z基因编码的基因编码的肽链与失去了正常氨基端的肽链与失去了正常氨基端的半乳糖苷酶突变体

15、互补，这种现象称为半乳糖苷酶突变体互补，这种现象称为互补。互补。第57页/共76页第58页/共76页 蓝白斑筛蓝白斑筛选选第59页/共76页原原 位位 杂杂 交交核酸分子杂交：核酸分子杂交：在复性过程中，将不同来源的在复性过程中，将不同来源的DNADNA单链分子或单链分子或RNARNA分子放在同一溶液中，只要在分子放在同一溶液中，只要在DNADNA或或RNARNA的单链分子之间存在着一定程度的碱基配对关系，就可以在不同的分子间形成杂化双链，这种现象称为核酸分子杂交。的单链分子之间存在着一定程度的碱基配对关系，就可以在不同的分子间形成杂化双链，这种现象称为核酸分子杂交。 探针探针是经过特殊标记的核酸片段，具有特定的序列，能够与待测的核酸片段互补结合，因此可用于检测核酸样品中的基因。是经过特殊标记的核酸片段，具有特定的序列，能够与待测的核酸片段互补结合，因此可用于检测核酸样品中的基因。原位杂交原位杂交是在原位裂解细菌使是在原位裂解细菌使DNA变性，利用变性，利用探针技术所进行的核酸分子杂交。探针技术所进行的核酸分子杂交。此法更适用于筛选基因文库此法更适用于筛选基因文库 第60页/共76页第61页/共76页第62页/共76页第63页/共76页Question: 选用什么酶切？选用什么酶切？