实验四-玉米种子盐溶蛋白凝胶电泳

1、实验四实验四 玉米种子盐溶蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定玉米种子盐溶蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定2014.1.2一、目的要求一、目的要求了解玉米种子盐溶蛋白提取方法、电泳程序、染色和鉴别方法。二、原理和依据二、原理和依据利用不同带电质点在一定电场中的迁移速度不同进行分离，凝胶电泳除了电荷效应，还有分子筛效应和PH梯度等。三、材料、仪器三、材料、仪器和试剂和试剂材料：材料： 玉米种子。仪器：仪器： 电泳仪，电泳槽，离心机，离心管，1/1000电子天平或分析天平，样品钳，广口瓶，移液管及移液管架，微量进样器（1-50l），注射器等电泳用品。试剂：试剂： 丙烯酰胺（Acr），亚甲基丙烯酰胺（Bis），甲酸

2、，甲酸钠，过硫酸铵（APS），四甲基乙二胺（TEMED），NaCl，蔗糖，甲基绿，甘氨酸，考马斯蓝R250，三氯醋酸（TCA），乙醇（96%），乙酸（99%）等。所有化试剂都需是分析级或以上等级。四、四、方法和方法和步骤步骤1溶液配制（1）凝胶溶液的配制贮备液A（分离胶贮备液）：称取90g Acr，3g Bis，加入去离子水350ml，搅拌至完全溶解（约30min）后定容到500ml，放入棕色瓶中低温保存。贮备液B（分离胶缓冲液）：吸取含量88%的甲酸0.427ml，称取甲酸钠（含2个结晶水）1.0456g，加入50ml去离子水，搅拌混匀，并定容到100ml，并调节pH至3.2，倒入棕色瓶中低

3、温保存。贮备液C（分离胶化学聚合催化剂1%APS）：称取2gAPS，加入100ml去离子水，搅拌至完全溶解，并定容到200ml，倒入棕色瓶中低温保存，仅能保存倒入棕色瓶中低温保存，仅能保存1周。周。贮备液D（浓缩胶贮备液）：称取9.3gAcr和0.31gBis，先加入30ml去离子水，搅拌至完全溶解，再定容到50ml，倒入棕色瓶中低温保存。贮备液E（浓缩胶缓冲液）：吸取含量为88%甲酸0.218ml，称取甲酸钠0.5228g，加入30ml去离子水溶解，并定容到50ml，调节pH至5.6。倒入棕色瓶中低温保存。或者先溶解甲酸钠，然后用甲酸滴加，调节pH至5.6。贮备液F（浓缩胶聚合催化剂1%AP

4、S）：称取1gAPS，先用60-70ml去离子水溶解，搅拌至完全溶解后定容到100ml，倒入棕色瓶中低温保存。仅能保存1周。贮备液G（凝胶聚合加速剂TEMED）：吸取1mlTEMED，加去离子水1ml溶解，放入冰箱低温保存。（2）样品提取液的配制称取0.2928g NaCl，20g蔗糖和0.04g甲基绿，加去离子水溶解，充分搅拌至溶解，定容到100ml。（稀盐溶液）（3）电极缓冲液配制吸取含量为88%甲酸溶液8.54ml，称取甘氨酸6.006g，先用1600ml去离子水溶解后定容到2000ml，混匀并调节pH至3.45备用，可重复使用5次（或先将甘氨酸溶解，然后滴加甲酸，调至pH3.45）。（

5、4）蛋白质染色液配称取1g考马斯亮蓝R250，先用95%酒精溶解至100ml，另用去离子水配制10%（W/V）的TCA溶液。使用之前吸取1%考马斯亮蓝液3.5ml于100ml的10%TCA溶液中，配成一块凝胶板染色液。注：该染色液具有注：该染色液具有固定和染色固定和染色两种功能。必须在放入凝胶两种功能。必须在放入凝胶染色前再混合。染色前再混合。（5）凝胶贮备液配制贮备液编号贮备液编号分离胶分离胶浓缩胶浓缩胶配比配比一块板取液量一块板取液量配比配比一块板取液量一块板取液量A515mlB13mlC26mlD11mlE11mlF22mlG80ul40ul40ul2. 操作技术（1）样品制备：取单粒玉

6、米种子，在单粒样品磨碎仪上粉碎后，收集到1.5ml离心管中，按约1 1的量用洗瓶或滴管加入样品提取液，摇匀，放置5min后，再摇一次，5000rpm离心15min，取上清液点样。在做玉米品种测定时，可不用离心，自然沉降30min后，取上清液即可，该样品浸提在冰箱中进行更好。点样后样品可放入冰箱中保存两天，再电泳时，只需将样品重新摇动一次就行。一般加样30-50ul。（2）凝胶制备:电泳槽准备：垂直板夹芯电泳槽安装比较简便，先将玻璃装入橡胶封条中，然后插入有机玻璃制成的电泳槽中，拧紧螺栓，固定好成胶模。此步操作要注意玻璃板必须洗干净，而且要干燥，手指不能接触玻板表面，操作时可戴细纱手套用或用手拿

7、住玻板棱，另外，胶模在电泳槽中要放水平，位置合适，以防漏水。配胶：从冰箱中取出凝胶贮备液，根据电泳槽的大小，按表4中的比例取出一定体积的分离胶各贮备液混匀，同样取出浓缩胶溶液，混匀，G液先不加入液先不加入，将各贮备液再放回冰箱。注意注意取贮备液用的移液管要分别使用，不能混用取贮备液用的移液管要分别使用，不能混用。封底缝：为了使胶和下槽相通，成胶模下边有一条底缝，灌制分离胶前必须先将底缝用胶封住，根据底缝大小，取适量分离胶混合液，加入适量G液（用微量注射器加入），然后迅速摇匀，沿下槽玻板外壁倒入，将底缝封住。将电泳槽在实验台面上振动一下，使底缝封平。对于多个电泳槽的封底缝可用同时进行。一般5-1

8、0min，分离胶就会聚合将底缝封住。灌分离胶：封底后，用滤纸条插入两玻板之间，吸去因成胶而析出的水，从分离胶混合液中取出一块板的胶量，按比例加入G液，迅速摇匀，将电泳槽倾斜，将分离胶混合液倒入两玻板之间达一定高度（距玻板上边约1.0-1.5cm）。灌胶过程中注意不能产生气泡，如出现气包可用细不锈钢丝快速挑出。灌胶后，用预先准备好的注射器注水封住胶面，水封的动作必须要轻，不能冲坏胶面，当水封后，分离胶和水层间有一界面，等一下界面消失，再出现界面时表明凝胶已成，此时倒出封水，用滤纸吸干，注意滤纸不能接触胶面。灌浓缩胶：取适量浓缩混合液，按比例加入G号溶液，迅速摇匀，灌入电泳槽中，插好事先准备的样品

9、刷，用夹子夹住。该胶聚合很快，故动作要快，样品梳要插平。加样：浓缩胶聚合后，倒入电极缓冲，上槽电极缓冲液面要高于短玻板，然后小心拔出样品梳，用微量进样器吸取20-30ul玉米蛋白提取液的上清液依次在样品槽中点样，每点一个样要清洗微量进行器。电泳：点样完毕，将电源线正极接上槽，负极接下槽将电源线正极接上槽，负极接下槽，接通冷却水，打开电泳仪电源开关，采用稳压方式，调节电压300-600V。注意电源正负极不能接反，电泳开始后，观察电泳情况，刚开始甲基绿在浓缩胶中会浓缩成一条细线，进入分离胶后，甲基绿开始扩散电泳至槽底部距胶底部边缘0.5-1.0cm处时，关闭电泳仪（一般电泳时间为1.0-1.5h）。卸板：卸板：倒出电极缓冲液，拧松固定螺杆，将玻璃板和密封胶带一同取出，卸下密封胶带，用不锈钢刀小心撬开玻板，如发生粘板，用长针头注射器一边注射水一边剥离，剥离完后将凝胶板倒入染色液中，用刷子将胶板完全按入染色液中。染色：染色：该染色方法快速，本底不着色，一般染10-30min就可观察谱带，完全染色则需要4h以上的时间。该染色液中考马斯亮蓝R250呈悬浮状，在染色过程中会沉集在胶板和染色盘底，可重复使用。洗板：洗板：将染好的胶板用铲子铲出，放在白瓷砖上。若胶面沉集有染料，影响结果观察，可用刷子沾取0.5%（W/V）的洗衣