细胞生物学试验手册

1、细胞生物学实验手册这本实验教材是为高等医学院校细胞生物学教学编写的，适用于五年制本科、七年制 临床专业和研究生班。以及细胞生物学实验课的教学目的，主要是通过根本技能训练以及观察分析实验结果，使 学生了解并掌握有关的实验技术原理和操作方法，进而培养学生动手实践、观察分析和解 决问题的能力。 为到达此目的， 实验内容自成体系，着眼于加强学生的基末技能训练， 观察分析问题和科学思维能力的培养。大多数实验采用生活细胞材料，由学生自己动手取 材和实验，使学生能对细胞获得生动的认识。选编了一些生物医学常用的细胞生物学根本 实验，如细胞的显微测量、细胞活力测定、细胞计数、细胞组分的分级别离、细胞组分的化 学

2、反响、细胞生理活动、细胞染色体技术、细胞培养、细胞融合、免疫荧光技术、电镜技术 等，为后续的课程及医学研究打下一定根底。全书内容共 23 个实验，五年制本科、七年制医学专业和研究生班教学根据具体情况 选择根本实验，由学生自己动手操作，少数应用大型精密仪器的实验进行参观示教，另附 实验报告一册。本教材由王芸庆主编、谢荣林副主编，参加编写的有陈兴、谢荣林、宁刚、刘冬杰、黄 东阳、纪晓辉、时伟红、朱亚勤、黄集前、王明武、毕卫真、张婕、三维琴和王世藩。荆永 显、李虹、王序绘制插图，毕卫真负责印刷出版事宜。教材初稿曾于 1989 年?全国医学细胞生物学实验课培训班?试用，参加该班的教师提 出许多珍贵的经

3、验及修改意见，谨此致谢。现在第四版在 1993 年第三版根底上对局部实 验进行了补充和修改，并增加了“酸性磷酸酶的显示实验。由于经验缺乏，水平有限，本 教材一定还有很多缺点和错误，敬请使用者批评指正。目录、八前言实验室规那么 (1)常用实验动物了解和解剖器械的使用 (2)细胞生物学实验绘图方法与要求(4)实验一动物细胞的根本形态观察和显微测量(5)实验二线粒体的活体染色及电镜照片观察 (8)实验三液泡系的活体染色及电镜照片观察 (10)实验四细胞中微丝的染色及微丝与细胞形态的实验观察 (11)实验五细胞器的光镜切片和电镜照片观察(13)实验六细胞生理活动的观察 (16)实验七细胞组分的化学反响

4、(20)实验八细胞核与线粒体的分级别离(23)实验九细胞分裂的形态观察(26)实验十正常细胞与肿瘤细胞常规核型的标本制备 (31)实验一细胞融合(36)实验十二应用细胞融合技术制备染色体提前凝集标本(38)实验十三培养细胞的形态观察和计数 (40)实验十四细胞的原代和传代培养 (43)实验十五酸性磷酸酶的显示(46)实验十六肿瘤细胞的软琼脂集落培养和测定(48)实验十七电镜生物标本的制备及镜下观察(50)实验十八整装培养细胞生物膜系统的光镜和透射电镜标本制备与观察(54)实验十九免疫荧光抗体法检查细胞外表抗原(56)实验二十姊妹染色单体互换标本制备与分析(58)实验二一银染核仁形成区的光镜和电

5、镜标本制备及观察 (60)实验二十二染色体扫描电镜标本制备及观察(63)实验二十三细胞显微摄影 (65)附录一 离心机转数与离心力的换算表(67)附录二 溶液的配制(68)主要参考资料(77)实验室规那么一、遵守实验纪律，按时到达实验室，不得迟到或早退。实验中途因故需外出时应向任 课教师请假。二、进入实验室之前要换好白大衣及拖鞋。三、保持实验室安静，不许在实验室内大声喧哗及随意走动。四、必须严肃认真地进行实验。实验期间不得进行任何与实验无关的活动。五、实验室内各组仪器及器材由各组自已使用，不得互相调换。要保护仪器、标本和设 备。如遇仪器损坏或不灵，应及时报告任课教师，以便修理或更换，不要自行乱

6、修。 损坏器材或设备者应按有关规定进行赔偿。六、注意节约实验材料、药品和水、电等。七、保持实验室内清洁整齐。实验结束后，各组必须认真清理各自的实验台面，将器材 清洗后点清数目，然后摆放整齐。班级值日生负责清扫室内卫生，关好水、电开关 和门、窗等，经教师允许前方可离开实验室。八、动物尸体、纸片及实验废物应放到指定地点，不得随意乱丢。九、有不遵守上述要求者，任课老师将终止其实验，并取消其当堂实验成绩。常用实验动物的了解和解剖器械的使用一、常用实验动物 常用的实验动物有蟾蜍、小白鼠、大白鼠、豚鼠、猫、兔和狗等。在医学实验中，常常 根据不同的实验目的而选用不同的动物进行实验研究。例如， 蟾蜍可以用于观

7、察离体心脏搏动情况的实验， 小白鼠常用于样本很大的实验 如药物的半数致死量的测定等 ，猫常用于测 定脑内电位的实验，而狗是局解手术中常用的实验动物。在我们细胞生物学实验中， 除应用培养细胞外， 最常用的动物是蟾蜍和小白鼠， 下面对 其特点及根本处置做一简单的介绍。蟾蜍蟾蜍是两栖类动物， 由于其取材方便， 常用于各种实验。 其细胞较哺乳类动物的细胞大 得多，因此常用于观察细胞形态的实验。1 雌雄鉴别通常雄性蟾蜍较雌性的为小，且在其前肢的I3趾基部有被称为婚垫的黑疣。2 捉拿及处死方法：常用捣髓法处死蟾蜍， 即用解剖针捣毁其脑组织和脊髓。 具体方法是， 左手握住蟾蜍的 身体和四肢， 使其腹部贴着掌

8、心， 食指压住蟾蜍头部前端使其尽量腹屈。 在头与躯干之间可 触及一凹陷即枕骨大孔所在处，右手持解剖针直插入此凹陷约I2mm随即将针尖转向头侧插入颅腔捣毁脑组织。 然后将解剖针抽回并转向尾侧刺入脊椎管内捣毁其脊髓。 如此直 至其四肢松软，呼吸消失为止。小白鼠 小白鼠是哺乳动物，是最为常用的实验动物。1 捉拿方法： 将小白鼠放在鼠笼盖铁网上， 用右手持其尾巴向后拉， 小鼠那么会尽力向前蹬。 用左手的 拇指和食指抓住其头顶部皮肤，然后用左手小指与手掌之间夹住其尾巴。2 处死方法：处死应以安乐死为原那么， 即使之无痛苦而迅速死亡。 常用的方法有颈椎脱位法， 断头法 和二氧化碳吸入法等。 断头法需用特殊

9、的断头器， 二氧化碳吸入法那么将小鼠放入盛有二氧化 碳的容器内即可。 颈椎脱位法的具体方法是： 左手拇指和食指按住小白鼠的头部， 左手捉住 其尾巴迅速向后猛拉，使其颈椎脱位而立即死亡。3 给药方法：小自鼠的给药途径有经口给药、 腹腔内注射、 尾静脉注射、皮下注射、 皮内注射和肌肉 注射等。我们常用的是腹腔注射。具体方法是：左手捉住小鼠 如前所述 ，在其腹正中线稍 外侧避开膀胱和血管 用酒精消毒后，首先将注射针头向头部方向刺入皮下，进针12mm后，再以 45°角刺穿腹部肌肉而进入腹腔 刺穿腹肌时有一落空感 。针头刺入腹腔后切勿 左右摆动，以免损伤肠管或肝脏。注意每次注入的液体量应为0.

10、10.2ml /10克体重。二、常用手术器械及操作方法：1 解剖针：用于挑、刺等。常用来捣髓处死蟾蜍，持法如执笔法。2 解剖刀 即外科手术刀 ：用于各种皮肤切口和组织切除等。持法有执弓法与执笔法 两种。 前者用于较大力量切开较长距离的坚韧的组织， 如大动物的皮肤切口等； 后者那么用于 小力量的短距离切开，或别离皮肤和肌肉等。3 大剪刀：用于剪毛、皮肤、皮下组织和肌肉等。持法如图。4 眼科剪刀：用于剪断神经、血管、筋膜等细软组织。5 眼科镊子：用于提取神经、血管和筋膜等细软组织。6 钝头镊子：用于提取脏器、组织等。7 有钩镊子：用于提取皮肤切口等。常用手术器械执手术刀的姿势执手术剪的姿势执手术镊

11、的姿势执手术刀、手术剪、手术镊的姿势 张之曾编细胞生物学实验绘图方法与要求一、在仔细观察的根底上，选择典型结构进行描绘，要求真实、准确 注意各部结构的比例关系 。二、用铅笔绘图，线条要明确清晰，图的深浅明暗一律以点的疏密来表示，点要圆而一致， 不得涂暗影或进行其它美术加工。三、各部结构名称要在一侧引直线注明。各引线要平行不得交叉。四、每幅图的大小、位置在纸面上必须安排得当并注意纸面的整洁。实验一 动物细胞的根本形态观察和显微测量【实验目的 】制备不同细胞的临时制片， 观察、了解细胞的根本形态， 学会使用测微尺，通过测量对 红细胞的进化进行分析。【实验用品 】一、材料和标本 蟾蜍一只，人血液一滴

12、。二、器材和仪器 配有目镜测微尺的显微镜一台、载片十张、盖片三张、吸水纸、手术 器材一套、解剖盘一个、镜台测微尺一个、小平皿一个、牙签。三、试剂 1 甲苯胺兰、 1甲基兰、 Ringer 氏液 两栖类用 。【实验内容 】一、细胞的根本形态观察 一 原理 细胞的形态结构与功能相关是很多细胞的共同特点，在分化程度较高的细胞更为明显， 这种合理性是生物漫长进化过程所形成的。例如： 具有收缩机能的肌细胞伸展为细长形；具有感受刺激和传导冲动机能的神经细胞有长短不一的树枝状突起； 游离的血细胞为圆形、 椭 圆形或圆饼形。不管细胞的形状如何，细胞的结构一般分为三大局部：细胞膜、细胞质和细胞核。 但也 有例外

13、。例如：哺乳类红细胞成熟时细胞核消失。 二 观察方法与结果1 制备蟾蜍脊髓压片观察脊髓前角运动神经细胞。 取蟾蜍一只，破坏脑和脊髓，在口裂处剪去头部，除去延脑，剪开椎管，可见乳白色脊 髓，取下脊髓放在平皿内，用 Ringer 氏液洗去血液后放在载片上，剪碎。将另一载片压在 脊髓碎块上，用力挤压。将上面的载片取下即可得到压片。在压片上滴一滴甲苯胺兰染液， 染色 10 分钟，盖上盖片，吸去多余染液。在显微镜下观察，染色较深的小细胞是神经胶质 细胞。 染成兰紫色的、大的、有多个突起的细胞是脊髓前角运动神经细胞，胞体呈三角形或星形，中央有一个圆形细胞核，内有一个核仁 参照照片 。2 蟾蜍骨骼肌细胞的剥

14、离与观察 剪开蟾蜍腿部皮肤， 剪下一小块肌肉， 放在载片上， 用镊子和解剖针剥离肌肉块成为肌 束，继续剥离，可得到很细的肌纤维 肌细胞 。尽可能拉直肌纤维。在显微镜下观察，肌细 胞为细长形，可见折光不同的横纹，每个肌细胞有多个核，分布于细胞的周边参照照片 。3 蟾蜍肝脏压片的制备与观察剪开蟾蜍腹腔，取一小块约23mm3肝放在平皿内，用 Rin ger氏液洗净，用镊子轻 压将肝中的血挤出。 然后放在载片上，制片方法同脊髓压片。 染色用甲基兰。显微镜下观察 可见肝细胞核染成兰色，肝细胞紧密排列，挤成多角形 参照照片 。4 蟾蜍血涂片的制备与观察 取一滴蟾蜍血液，靠近一端滴在载片上将另一载片的一端呈

15、45°角紧贴在血滴的前缘，均匀用力向前推，使血液在载片上形成均匀的薄层。图I 一 1。晾干。显微镜观察可见蟾蜍红细胞为椭球形，有核。白细胞数目少，为圆形。取人血一滴，制片方法同上。显微镜观察可见人红细胞为凹圆盘形，无核。自细胞数目 少，为圆形。6 .人口腔上皮细胞标本的制备与观察用牙签刮取口腔上皮细胞均匀地涂在载片上不可反复涂沫，滴一滴甲苯胺兰染液， 染色5分钟，盖上盖片，吸去多余染液。显微镜下观察可见复盖口腔外表的上皮细胞为扁平椭 圆形，中央有椭圆形核，染成兰色。二、测微尺的使用一原理测微尺分目镜测微尺和镜台测微尺，两尺配合使用。目镜测微尺是一个放在目镜像平面上的玻璃圆片。圆片中央

16、刻有一条直线，此线被分为假设干格，每格代表的长度随不同物镜的放大倍数而异。因此，用前必须测定。镜台测微尺是在一个载片中央封固的尺，长1毫米1000卩m,被分为100格，每格长度是10微米。二方法1 .将镜台测微尺放在显微镜的载物台上夹好，小心转动目镜测微尺和移动镜台测微尺 使两尺平行，记录镜台测微尺假设干格所对应的目镜测微尺的格数图1 2。2. 按下式求出目镜测微尺每格代表的长度镜台测做尺的假设干格数目镜测微尺每格代表的长度 卩m=X10三、测量人口腔上皮细胞从显微镜载物台上取下镜台测微尺，换上人口腔上皮细胞标本，测量细胞、细胞核的长短径。【作业】一、分别求出使用低倍镜 10X，高倍镜40X时

17、目镜测微尺每格代表的长度：低倍镜：目镜测微尺每格代表的长度=XlO卩m=卩m高倍镜：目镜测微尺每格代表的长度=XlO卩m=卩m二、分别绘制所观察的 6种细胞并注明根本结构。三、计算蟾蜍红细胞的核质比例。计算细胞、细胞核体积的公式：.3圆 形V=4/3 n r r为半径椭圆形V=4/3 n ab a、b为长、短半径核质比N / D=Vr Vc VnVn为核的体积，Vc是细胞质的体积实验二 线粒体 Mitochondrion 的活体染色及电镜照片观察【实验目的 】 掌握一种活体染色方法 , 了解光学显微镜和电子显微镜下线粒体根本形态结构。【实验用品 】一、材料和标本 兔子一只、线粒体的电镜照片。二

18、、器材和仪器 显微镜、 手术器材一套、 解剖盘、 小平皿、 载片、 盖片、 吸水纸、 10ml 注射器、吸管。三、试剂I / 300詹纳斯绿B染液、Rin ger氏液哺乳类用。【实验内容 】一、兔肝细胞线粒体的活体染色一原理 线粒体是细胞内一种重要细胞器， 是细胞进行呼吸作用的场所。 细胞的各项活动所需要 的能量， 主要是通过线粒体呼吸作用来提供的。 活体染色是应用无毒或毒性较小的染色剂真 实地显示活细胞内某些结构而又很少影响细胞生命活动的一种染色方法。詹纳斯绿B 是线垃体的专一性活体染色剂。 线粒体中细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态呈蓝绿色，而在周围的细胞质中染料被复原，成为无色状态。二方法

19、 用空气栓塞处死兔子， 置于解剖盘内， 迅速翻开腹腔， 取兔肝边缘较薄的肝组织一小块23mm,放入盛有Rin ger氏液的平皿内洗去血液用镊子轻压，用吸管吸去Ringer氏 液，在平皿内加1/300詹纳斯绿B染液，让组织块上外表露在染液外面，使细胞内线粒体 的酶系可进行充分的氧化, 这样才有利于保持染料的氧化状态, 使线粒体着色。 当组织块边 缘染成篮色时即可,一般需要染 30 分钟。染色后, 将组织块移到载片上, 用镊子将组织块拉碎, 就会有一些细胞或细胞群从组织 块脱离。将稍大的组织块去掉,使游离的细胞或细胞群留在载片上,加一滴Ringer 氏液,盖上盖片,吸去多余水分。 三结果 显微镜观

20、察,肝细胞质中许多线粒体被染成蓝绿色,呈颗粒状。二、线粒体的光镜切片观察用詹纳斯绿B染色的兔肝细胞光镜切片，肝细胞中的线粒体呈蓝绿色的颗粒。 三线粒体的电镜照片观察 不同细胞中线粒体的形态和数目不同。线粒体的外形多样,如圆形、椭圆形、哑铃形和杆状。线粒体的数目与细胞类型和细胞的生理状态有关, 线粒体多聚集在细胞生理功能旺盛 的区域。线粒体脊的数目与分布方式是多种多样的。 一般与线粒体长轴垂直排列, 但也可见到与 线粒体长轴平行排列的脊。 脊的横切面呈囊状或管状。 脊的数量与细胞呼吸机能的强度有很 大关系。这有三张线粒体超薄切片的电镜照片： 第一张是小鼠肾小管上皮细胞中线粒体的电镜照 片,可见线

21、粒体呈椭圆形和杆状,由双层膜包围, 内膜向内突起成平板状脊,脊与线粒体长 轴垂直排列， 肾小管上皮细胞重吸收作用需要能量， 线粒体数目多。 第二张是恒河猴脊髓突 触内线粒体。可见线粒体体积小、数目多，脊与线粒体呈同心圆排列。 第三张是小鼠睾丸间 质细胞线粒体，线粒体的脊为分支的管，在照片上呈单层膜泡状。【作 业 】 绘制光镜下肝细胞活体染色所见的线粒体及电镜下肾小管上皮细胞中线粒体的形态结构。 时伟红编 实验三 液泡系 Vacuolar system 的活体染色 及电镜照片观察【实验目的 】 掌握一种活体染色方法，了解光学显微镜和电子显微镜下液泡系的根本形态结构。【实验用品 】一、材料和标本

22、蟾蜍一只，软骨细胞电镜照片。二、器材和仪器 光学显微镜一台、 手术器材一套、 解剖盘一个、 载片、盖片、 吸水纸。三、试剂 l 3000 中性红染液、 Ringer 氏液两栖类用 。【实验内容 】一、蟾蜍胸骨剑突软骨细胞液泡系活体染色及观察 一 原理在动物细胞内， 但凡由膜所包围的小泡和液泡除线粒体外都属于液泡系， 包括高尔基器、 溶酶体、微体、消化泡、自噬小体、 残体、胞饮液泡和吞噬泡， 都是由一层单位膜包围而成。 软骨细胞内含有较多的粗面内质网和兴旺的高尔基复合体， 能合成与分泌软骨粘蛋白及胶原 纤维等，因而液泡系兴旺。中性红是液泡系特殊的活体染色剂， 只将液泡系染成红色， 在细胞处于生活

23、状态时， 细 胞质及核不被染色，中性红染色可能与液泡中的蛋白有关。(二 方法取一只蟾蜍，破坏脑和脊髓，剪开胸腔，取胸骨剑突软骨最薄局部的一小片，放在载片上，滴两滴1/3000中性红染液，染色 810分钟，用吸水纸吸去染液，加一滴Ringer 氏液，盖上盖片，吸去多余 Ringer 氏液。(三 结果显微镜下观察， 可见软骨细胞为椭圆形，细胞核周围有许多染成玫瑰红色大小不一的小泡，即软骨细胞液泡系。二、大白鼠胫骺软骨细胞电镜照片的观察动物细胞液泡很小， 即使是活体染色也只能看出是一个小点， 为了进一步看清液泡的结 构我们有必要观察软骨细胞的电镜照片。大白鼠胫骺骨细胞电镜照片， 细胞核与核仁很清楚，

24、 细胞质中有丰富的粗面内质网， 液 泡系兴旺，液泡由单层膜包围，细胞周边有液泡释放。【作 业 】绘制光镜下软骨细胞液泡系。 时伟红编 实验四 细胞中的微丝染色及微丝与细胞形态的实验观察【实验目的 】 掌握微丝的染色方法，了解光学显微镜和电子显微镜下微丝的根本形态结构。【实验用品 】一、材料和标本 盖片培养的成纤维细胞三片。二、 器材和仪器光学显微镜一台、镊子一把、小平皿六个、载片三个、吸水纸、37C恒温箱。三、试剂 PBSpH7.2、2% Trit on X 100 液、M缓冲液、3%戊二醛固定液、0.2 % 考马斯亮兰染液、100卩g/ml的细胞松驰素 B DMEM培养液。【实验内容 】一、

25、成纤维细胞微丝的染色及其对细胞松驰素B的反响一原理微丝普遍存在于多种细胞， 对细胞的形状和运动有一定作用。细胞松驰素B可与微丝的亚单位肌动蛋白结合，从而破坏微丝，改变细胞的形状。二细胞松驰素B处理成纤维细胞与染色观察 1在平皿中有三张成纤维细胞贴壁生长的盖片，在超净工作台内将一张盖片移入另一 皿中继续培养，用作对照。2在有两片的平皿内加 100卩g/ml的细胞松弛素 B 4滴继续培养半小时。3. 将用细胞松弛素B处理过的两张盖片取一张做染色处理，另一张用培养液洗五次在平皿内换五次培养液，每次都要摇动 ，继续培养、观察。两小时后细胞形状恢复，接近正 常。4 对恢复的盖片与第一张没用药的盖片一同做

26、染色处理。5.染色处理 将需染色的盖片放入盛有 PBS的平皿内用吸管轻轻吹洗盖片，换液三次，每次3分钟， 洗去培养液。 将盖片移入2% Trit on X 一 100液，置37C恒温箱内处理 2030分钟，以提取骨 架以外的蛋白质，使骨架图像清晰。 立刻将盖片移入 M缓冲液，换洗三次，每次 3分钟。M缓冲液有稳定细胞骨架的 作用。 将盖片移入 3%戊二醛固定 15分钟。 将盖片移入 0.2 %考马斯亮兰染液中，染色 15 分钟。然后小心地用自来水冲洗，空 气枯燥。 三结果光镜观察， 微丝聚集成的张力纤维束被染成蓝色。 在没用药的标本上， 成纤维细胞多数 有突起，微丝沿突起规那么排列； 用细胞松

27、驰素 B 处理的标本， 由于微丝被破坏突起缩回，多 数细胞形状变圆； 用药处理后又洗去药的标本， 由于解除了药的作用， 肌动蛋白重新聚台形 成微丝，细胞形状恢复正常。二、 丽藻细胞内胞质环流及其对细胞松弛素B的反响 一原理丽藻细胞大， 整个细胞的中央为大液泡占据。 靠近液泡是一层溶胶样流动的内质， 在内 质与质膜之间， 为静止的外质， 其中含有叶绿体。 内质中含有许多颗粒，可以清楚地看到胞 质环流。在丽藻细胞中的微丝与胞质环流有密切关系。 成束的微丝出现在外质与内质接口 溶 胶和凝胶接口并交织一起，与环流方向平行。用细胞松弛素B处理后，就可抑制胞质的环流运动。 二 方法1 .剪下一小块丽藻叶片

28、12cm,置于载片上，盖上盖片。2 观察阳光充足时效果较好 。3 .再取一块丽藻叶片，滴一滴细胞松弛素B， 1015分钟后盖上盖片，观察。4 .洗去药物，再观察。 三 结果在丽藻内质中可以看到胞质环流，用细胞松弛素B处理后，胞质环流停止，洗去药物，又出现胞质环流。三、微丝的电镜照片观察恒河猴脊髓内神经纤维中微丝电镜照片，可见微丝是实心结构，直径58cm,它均匀地分散于细胞基质中，或排列成束和网状。【作 业 】 绘出三种不同情况下细胞中微丝的分布。 时伟红编 实验五细胞器的光镜切片和电镜照片观察【实验目的】观察除了实验二五以外的其它细胞器在光学显微镜和电子显微镜下的根本形态结构。【实验内容】一、

29、三种细胞器的光镜切片一高尔基复合体 Golgi Complex用镀银法染色的豚鼠脊神经节光镜切片：神经细胞因合成运输大量的蛋白质而含有兴旺的内质网和高尔基复合体， 在低倍镜下观察，神经节的假单极细胞体被神经束分隔成群。神经细胞的胞体呈圆形或椭圆形。转换高倍镜观察，细胞中央不着色的圆形区为细胞核。在核的周围有黑褐色颗粒状或呈不规那么的条索状结构即为高尔基复合体。图5 一 l神经节细胞示高尔基复合体二尼氏小体Nissl ' s Body甲苯胺兰染色的牛脊髓涂片， 尼氏小体即光镜下的粗面内质网。 在低倍镜卡观察，染成蓝色 的大三角形、星形细胞就是脊髓前角神经细胞， 染色较深的小细胞为神经胶质

30、细胞。 转换高 倍镜观察，可见脊髓前角神经细胞的细胞质中许多蓝色颗粒或网状结构即为尼氏小体。图5 2脊髓前角神经细胞的尼氏小体三中心体Centrosome铁苏木素染色的马蛔虫子宫切片, 卵壳，细胞与卵壳之间的腔叫卵壳腔。 它与周围致密的细胞质中心球，在低倍镜下观察可见许多受精卵细胞，细胞的外面有在某些卵细胞内，于核附近有圆形的小粒一一中心粒， 组成中心体。转换高倍镜观察， 可见中心体的外围还有星状的放射细丝即星体。染色体中心体图53马蛔虫受精卵细胞、分裂中期示中心体二、六种细胞器的电镜照片一高尔基复合体 Golgi Complex人体胃粘膜细胞高尔基复合体电镜照片：细胞质中有散在的高尔基复合体

31、，其结构要由三局部组成：扁平囊、大囊泡和小囊泡，它们共同构成紧密重叠的囊泡结构。扁平囊约38层，它们平行排列，略弯曲成弓形。凸出的一侧为形成面，可见许多小囊泡，凹入的一侧 为成熟面，可见扁平囊末端呈球形膨大，在分泌细胞中膨大局部不断脱离扁平囊，形成分泌泡。 二内质网Endoplasmic Reticulum人胃壁细胞、恒河猴脊髓前角运动神经细胞粗面内质网电镜照片：粗面内质网在分泌蛋白质的细胞中较兴旺，在细胞核周围可见有较密集的膜层结构即为粗面内质网，它们大都呈片状排列，粗面内质网可与细胞核膜相通连。在粗面内质网的膜外外表附着许多小颗粒，即核糖体。人胃粘膜盐酸细胞、 小鼠睾丸间质细胞滑面内质网电

32、镜照片：盐酸细胞分泌盐酸， 细胞中密集的圆泡，无核糖体附着即滑面内质网，参加盐酸的合成。小鼠睾丸间质细胞中含有丰富的分支管状滑面内质网，合成固醇类的雄激素。 三中心粒Centriole白血病细胞的中心粒电镜照片：中心粒是相互垂直的两个短筒状小体，从横切面看，每个短简由9组三联体微管组成。 四溶酶体Lysosome小鼠肝细胞、人胃癌细胞溶酶体电镜照片：溶酶体为一层单位膜包围的囊状结构。溶酶体呈球形，质地均匀，吞噬性溶酶体依结合物不同而呈不同形态，溶酶体主要含酸性水解酶。 五核糖体Ribosome小鼠肾细胞核糖体电镜照片： 核糖体是由核糖核酸和蛋白质构成的大小亚基组成的椭圆形颗粒，附着于内质网上的

33、称附着核糖体，此外还有散在于细胞质中的游离核糖体，而多个核糖体由mRNA串连在一起叫多聚核糖体。 六细胞核Cell Nucleus豚鼠肝细胞核、人胃癌细胞核电镜照片：可见核膜由双层单位膜构成。内外核膜相距一定的距离结合形成核孔。核膜外层也附着核糖体并与内质网相通。核中的海绵状球形结构就是核仁，它由纤维和颗粒构成。在核膜内面和核仁四周，着色较深的为异染色质，其余着色较浅的是常染色质。三、观察恒河猴脊髓前角运动细胞的电镜照片，总结细胞的超微结构照片中是一个多角形的脊髓前角运动细胞，细胞外表以非常细的线条与周围分界，就是细胞膜。中央有圆形的细胞核，核膜密布核孔，核膜内侧少量着色深而致密的是异染色质，

34、 色浅的是常染色质。核中央海绵状的一团深色结构是核仁。细胞膜与核膜之间为细胞质。其扁平囊细中有许多膜性结构形成扁平囊状或管泡状，密集成排的膜上附有颗粒，这就是粗面内质网。 分散于细胞质中内质网间的许多圆形或棒状膜结构是线粒体。 在核的四周可见小泡， 等集合形成的高尔基复合体。 在细胞质中还可见一些不规那么形的黑色致密结构是脂褐质， 胞质基质中分散存在纤细的微丝和微管是细胞骨架成份。 时伟红编 实验六 细胞生理活动的实验观察【实验目的 】通过制片与观察加深理解细胞的运动、吞噬等生理活动。【实验用品 】一、材料和标本 雄性蟾蜍、小白鼠、 l 鸡血悬液、 6淀粉肉汤、草履虫。二、器材和仪器 光镜、

35、2ml 注射器、载玻片、盖玻片、解剖器材、滴管、移液管、试 管、玻璃片、黑纸。三、试剂 0.3 台盼兰、 1刚果红。【实验内容 】一、细胞的吞噬活动 一 原理 白细胞是机体防御系统中能游走的单位。它分为粒细胞系、单核细胞系、淋巴系三类。它们有许多生理功能， 如游走性、 变形运动、 趋化性、 吞噬异物等。 在白细胞中， 以粒细胞、 单核细胞的吞噬活动较强， 故称此二类细胞为吞噬细胞。 单核细胞由血液进入组织后逐渐演 变成巨噬细胞。 吞噬细胞主要靠吞噬来处理异物。 吞噬细胞首先由于趋化作用而向异物游走， 然后伸出伪足包围异物， 并发生内吞作用形成吞噬泡将异物吞入细胞， 继而溶酶体与吞噬泡 融合消化

36、异物。( 二 l 小白鼠腹腔巨噬细胞吞噬活动的观察 实验前二天，每天向小鼠腹腔注射6淀粉肉汤0. 5 1ml(含 0.3台盼兰，起标记作用 ，以刺激腹腔产生较多的巨噬细胞 此步由教师在实验前进行完毕。2 实验时，每组取一只经上述处理的小鼠，腹腔注射1 鸡血悬液 0.51ml，注射后轻揉小鼠腹部以使红细胞悬液分散均匀。3 1 小时后，用颈椎脱位法处死小鼠，迅速剖开小鼠腹壁，向腹腔注入05ml1ml生理盐水，用牙签轻轻搅拌使生理盐水与腹腔液混匀。4用注射器抽取腹腔液，滴片，然后盖上盖片。5镜检，高倍镜下画图记录所见结果。二、暗视野观察细胞的纤毛和鞭毛运动(一 原理暗视野照明法是一种不使照射被检物体

37、的光线直接进入物镜的照明方法。常常用它来观察没有染色的活体细胞或胶体粒子。 利用此照明法， 在镜检时不能直接看到通过标本的照明 光线，只有被检物体反射或衍射的光线进入物镜可以提高分辨率， 在暗视野中可以看到明亮 的被检物体的存在和运动，但它们的内部结构却看不清楚。 二 自制遮光板变普通显微镜为“简单的暗视野显微镜。步骤：1将显微镜聚光器调到最高位，用低倍镜调焦至清楚。 2取下目镜，从镜筒中观察并调节光圈的大小，使其与镜筒中所见物镜的视野相等。 3放一块透明玻璃于载物台透光孔上，用尺子测量光圈孔径。4按照图 6-1 的形状，用黑纸剪成与调节后光圈孔径一样大小的中央遮光板。5将中央遮光板放置在显微

38、镜的滤光框上，即可进行标本的暗视野观察。 注：如果使用高倍镜观察标本时，应按高倍镜调焦的视野大小重新制作中央遮光板。a.光圈孔径b .滤光片直径三观察蟾蜍上颌粘膜上皮细胞的纤毛运动步骤：1 .用捣毁脑脊髓的方法处死蟾蜍。2 .腹部向上将蟾蜍固定在蜡盘上。3 .沿蟾蜍二侧口角向后剪开约I厘米，将下颌翻转固定在腹部。4 .在上颌中线距喉头 1厘米处放置腊屑，观察腊屑向什么方向移动？记录腊屑开始移动到消失的时间见图6-2蟾蜍口腔内面图。5 .然后，用眼科剪刀剪取咽头前部的上颌粘膜约2X 2cm2小块，用牙签挑取剪下的粘膜，将纵切面贴于载片上。6 .加一滴生理盐水于载玻片标本上，加盖玻片，镜检。丄曲沟

39、外孔图62蟾蜍口腔内面图结果：1 .在低倍镜下观察上颌粘膜细胞纤毛运动的现象。2 .换高倍镜仔细观察纤毛有规律的运动。四暗视野观察蟾蜍精子的鞭毛运动步骤：1 .将前面实验所用蟾蜍沿腹中线开腹，暴露出黄色圆柱状精巢。2 .剪取一侧精巢于盛有自来水的平皿中，用镊子夹住精巢的一端，清洗去血污。3 .移取洗净的精巢于另一干净的平皿上，用眼科剪将精巢充分剪碎后，参加数滴自来 水混匀。4 .用吸管吸取平皿内液体， 滴一滴于载玻片上，盖上盖玻片，稍待23分钟于镜下观察。结果：1 在低倍镜下可见到视野中有许多精子：头部呈长锥形，尾为细长的线状结构。2 置高倍镜下观察：可见有许多靠尾部鞭毛弯曲摆动驱使而运动的精

40、子，测量鞭毛长 度。三、草履虫纤毛运动及食物泡的形成图63 草履虫草履虫是一种单细胞动物。虫体由一个细胞组成，能执行复杂的生理功能。其体表，均匀密布纤毛，为运动细胞器。身体的前部有口沟，由前端斜向伸至体中部，口沟的底部为胞口， 下部一短管斜向后部而入胞质， 称胞咽。纤毛有规律的摆动使食物在胞 咽聚结形成食物泡吞噬泡，最后脱离胞咽入胞质。 食物泡随细胞质由体后端到前端不停环 流，并与溶酶体含酸性水解酶融合，行使细胞内消化。根据食物泡中刚果红指示剂的颜色变化酸性时，为红色；近中性时，为黄色；碱性时，为蓝色。可以观察到消化过程。实验步骤：1 取一滴草履虫培养液于载玻片上，放上几根棉花纤维，以减慢草履

41、虫的运动。加盖 玻片，制成临时装片。2 观察草履虫的运动方式观察时光线可调暗些：可见镜下有许多样似倒置鞋底的草 履虫，体表纤毛不断摆动，虫体以其中轴左旋前进，假设遇阻力那么试触后即刻回避而转向。3 .观察草履虫的食物泡的形成：1在盖玻片一侧加一滴I %的刚果红指示剂，用吸水纸从另一侧吸引使指示剂进入盖片 下方，选一运动较缓慢的草履虫，移入高倍镜观察吞噬活动。2几分钟后可见草履虫体内出现许多红色食物泡，随着食物泡不停的在胞质中环流，食物不断消化，泡内酸性减弱或近中性，颜色渐渐呈黄色，食物泡渐小，最后食物泡颜色呈蓝 色，不能被消化的残渣，环流到身体后部的胞肛排出，不排出时不易见到胞肛。 【作 业

42、】1 画图记录细胞吞噬实验所见结果，小鼠巨噬细胞吞噬实验如何解释细胞内台盼兰的 着色？2 在观察细胞纤毛和鞭毛运动实验中 , 记录一下腊屑从开始运动到消失的时间。3 鞭毛和纤毛有何异同？ 朱亚勤编 实验七 细胞组分的化学反响【实验目的 】了解核酸、 蛋白质、 糖及酶的细胞化学反响原理， 掌握 Brachet 反响及碱性蛋白、 酸性 蛋白、糖原和过氧化物酶的细胞化学染色方法。【实验用品 】一、材料和标本 蟾蜍、小白鼠各一只、肝脏石腊切片、培养的 Hela 细胞。二、器材和仪器 光学显微镜、解剖器材、蜡盘、载玻片、吸水纸、染色缸、盖玻片、 水浴箱。三、试剂PBS缓冲液pH7.2、甲基绿一呱咯宁醋酸

43、缓冲液、纯丙酮、1/2丙酮+1/2二甲苯、 纯二甲苯、 70乙醇、 5三氯醋酸、 0.1 碱性固绿、 0.1 酸性固绿、 0.5 硫酸铜、 联苯胺混合液、 1 番红、 无水乙醇、过碘酸酒精液、 Schiff 氏酒精液、亚硫酸水、 Ehrlieh 苏木精、 95乙醇、 Carnoy 固定液 甲醇：冰醋酸 =3:1 ，体积比 【实验内容 】细胞的组织化学方法， 是研究细胞成分常用的方法之一。 它是利用化学试剂与细胞内的 某些物质进行化学反响， 从而在细胞局部形成有色沉淀物， 再通过显微镜对组织内的生物化 学成分进行定性、定位、定量研究。一、Brachet反响一显示细胞内的 DNA和RNA 一原理细

44、胞经甲基绿一呱咯宁混合液处理后，其中的DNA和RNA出现不同的呈色反响， 一般认为这是由于带有负电荷的核酸对碱性染料呱咯宁和甲基绿具有亲和力，且这两种染料的作用有选择性，甲基绿染高聚分子的 DNA呈蓝绿色，呱咯宁染低聚分子的 RNA呈红色。由此对细 胞中的DNA和RNA进行定位、定性、和定量分析。 二方法1 .接种Hela细胞于盖片上并培养 2448小时，使长成单层。2 取出盖片，用 PBSpH7.2 轻轻冲洗盖片外表去除残渣。3 .放入Carnoy固定液中固定I小时。4 浸入甲基绿一呱咯宁醋酸缓冲液中 30 分钟染色。5 取出盖片放入蒸馏水中轻轻漂洗 23次23秒钟左右 ，吸去水分。放入纯丙

45、酮 中分色 2 3 秒钟。6. 放入l / 2丙酮+1/2二甲苯中5秒钟。7 放入纯二甲苯中透明 5分钟。8滴一滴中性树胶于载玻片上，将盖片标本面朝下封片。9镜下观察三结果细胞质被染成浅红色，细胞核被染成蓝绿色，而其中核仁被染成紫红色参照照片。二、细胞内碱性蛋白和酸性蛋白的显示一原理由于不同的蛋白质分子所带的碱性和酸性基团的数目不同，在pH值不同的溶液中，蛋白质分子所带的净电荷多少不同。 如在生理条件下， 整个蛋白质所带负电荷多， 那么为酸性蛋 白质；带正电荷多，那么为碱性蛋白质。据此，可将标本经三氯醋酸处理提出核酸后，用不同 pH值的固绿染液分别染色，细胞内的酸性蛋白和碱性蛋白质显示出来。二

46、方法 1以破坏脊髓法处死蟾蜍，将其腹面向上放人蜡盘中，剪开胸腔，翻开心包。小心将 心脏剪一小口， 取心脏血一滴滴在干净载玻片一端，推片，按此法制备二张血涂片，室温晾 干。2. 将涂片作好标记放在 70乙醇中固定 5 分钟，室温晾干。3. 放入5%三氯醋酸中60C 30分钟，抽提出核酸。4清水冲洗屡次 3分钟以上，以冲去痕迹的三氯醋酸。5. 滤纸吸干玻片上水分。6. 一张片放入0.1 %碱性固绿pH8.08.5中染色1015分钟，另一张片放入0.1 %酸 性固绿pH2.02.5染色510分钟。7. 清水冲洗，盖上盖片镜检。三结果 经碱性固绿染色片中，胞质、核仁不着色，细胞核大局部被染成绿色，是为

47、碱性蛋白质存在处参照照片 。经酸性固绿染色片中，因胞质和核仁中有酸性蛋白，被染成绿色。三、细胞内过氧化物酶的显示一原理过氧化物酶能把许多胺类氧化为有色化合物， 用联苯胺处理标本， 细胞内的过氧化物酶 能把联苯胺氧化为蓝色的联苯胺蓝， 进而变为棕色产物， 因而可以根据颜色反响来判定过氧 化物酶的有无或多少。二方法1. 取小鼠一只，以颈椎脱位法将其处死，迅速剖开其后肢暴露出股骨，将股骨一端斜 向剪断，用PBS缓冲液湿润过的注射器针头吸出骨髓一滴滴到载玻片上。2. 推片，室温晾干。3. 将涂片放入 0.5 %硫酸铜中浸 30 秒1 分钟。4. 取出涂片直接放入联苯胺混合液中反响6分钟。5. 清水冲洗

48、，放入 1%番红溶液中复染 2分钟。6. 清水冲洗，室温晾干。7. 镜检或封片后镜检。三结果 涂片中可见一些细胞中存在着蓝色或棕色颗粒，为过氧化物酶所在位置。四、过碘酸雪夫反响PAS显示细胞内糖原参照照片和示教片 一原理组织、细胞的多糖、粘多糖及粘蛋白等都可用 PAS法来显示，其化学根底是利用过碘酸 的氧化作用，翻开碳链形成醛，生成的醛基与 Schiff 试剂中的无色品红反响形成紫红色化 合物。 二方法1 .取I 2mn厚的肝组织块，用 Carnoy氏液4C固定46小时。2 .乙醇脱水、二甲苯透明。石蜡包埋，切片。3 .用 70%乙醇展片。4 .脱蜡：二甲苯15分钟t二甲苯25分钟t 100%

49、乙醇5分钟t含1 %火棉胶的乙 醇液1分钟t 70%乙醇1分钟。5 .直接浸入过碘酸酒精液反响 515分钟，经 70%乙醇洗片刻。6.浸入 Schiff 氏酒精液反响 15分钟。7 亚硫酸水洗三次，以洗去多余的非特异性结合的色素，以及扩散的染料。8 .流水冲洗35分钟。9 蒸馏水洗。10 .浸入 Ehrlich 苏木精复染 2030 秒，使细胞核着色。10分钟二次。11 .脱水：95 %乙醇3分钟二次t 100%乙醇3分钟二次t二甲苯透明12 .加盖片镜检或树胶封固后镜检。 三 结果 细胞中呈紫红的颗粒即为糖原 参照照片 。五、苏丹川染色一一显示细胞内脂肪 示教片作 业 】1. 用彩色笔绘出B

50、rachet反响及PAS反响的镜下所见。2. 说明着色的碱性蛋白可能是什么物质 ? 纪晓辉编 实验八 细胞核与线粒体的分级别离【实验目的 】通过细胞匀浆和离心的方法分级别离细胞的组分，以了解其原理及过程。 【实验用品 】一、材料和标本 小白鼠、冰块。二、器材和仪器 玻璃匀浆器、 普通离心机、 台式高速离心机、 普通天平、 光学显微镜、 载玻片、盖玻片、刻度离心管、高速离心管、滴管、 10ml 量筒、 25ml 烧杯、玻璃漏斗、解 剖剪、镊子、吸水纸、纱布、螬盘、平皿、牙签。三、试剂0.25mol / L蔗糖一 0.003mol / L氯化钙溶液、1 %甲苯胺兰染液、0.02 %詹 纳斯绿B染液

51、、0.9 % NaCI溶液。【实验内容 】一、原理细胞内不同结构的比重和大小都不相同， 在同一离心场内的沉降速度也不相同， 根据这 一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各种组分分级别离出来。别离细胞器最常用的方法是将组织制成匀浆， 在均匀的悬浮介质中用差速离心法进行分 离，其过程包括组织细胞匀浆、 分级别离和分析三步， 这种方法已成为研究亚细胞成分的化 学组成、理化特性及其功能的主要手段。匀浆 Homogenization 低温条件下，将组织放在匀浆器中，参加等渗匀浆介质 即0.25mol / L蔗糖一 0.003mol /L氯化钙进行破碎细胞使之成为各种细胞器及其包含物的匀 浆。分级别离

52、Fractionation 由低速到高速离心逐渐沉降。先用低速使较大的颗粒沉淀， 再用较高的转速，将浮在上清液中的颗粒沉淀下来，从而使各种细胞结构，如细胞核、 线粒体等得以别离。 由于样品中各种大小和密度不同的颗粒在离心开始时均匀分布在整个离心管 中，所以每级离心得到的第一次沈淀必然不是纯的最重的颗粒， 须经反复悬浮和离心加以纯 化。分析 分级别离得到的组分，可用细胞化学和生化方法进行形态和功能鉴定。二、细胞核的别离提取 一 操作步骤1 用颈椎脱位的方法处死小白鼠后， 迅速剖开腹部取出肝脏， 剪成小块 去除结缔组织 尽快置于盛有0.9 %NaCl的烧杯中，反复洗涤，尽量除去血污，用滤纸吸去外表

53、的液体。2 将湿重约 1g 的肝组织放在小平皿中，用量筒量取 8ml 预冷的 0.25mol L 蔗糖一 0.003mol L 氯化钙溶液，先加少量该溶液于平皿中，尽量剪碎肝组织后，再全部参加。3 剪碎的肝组织倒入匀浆管中，使匀浆器下端浸入盛有冰块的器皿中，左手持之，右手将匀浆捣杆垂直插入管中，上下转动研磨35次，用3层纱布过滤匀浆液于离心管中，然后制备一张涂片，做好标记，自然枯燥。4 .将装有滤液的离心管配平后，放入普通离心机，以2500rpm,离心15分钟； 缓缓取上清液，移入高速离心管中，保存于有冰块的烧杯中，待别离线粒体用；2 同时涂一张上清液片做好标记，自然枯燥；3余下的沉淀物进行下

54、一步骤。5 .用6ml0.25mol/L 蔗糖一 0.003mol / L氯化钙溶液悬浮沉淀物，以2500rpm离心15分钟弃上清， 将残留液体用吸管吹打成悬液， 滴一滴于干净的载玻片上， 涂片， 自然枯燥。6 将、涂片用I %甲苯胺兰染色后盖片即可观察。 二 结果分别于高倍镜下观察三张涂片，描述镜下所见。三、高速离心别离提取线粒体 一 操作步骤1 .将装有上清液的高速离心管，从装有冰块的烧杯中取出，配平后，以 17000rpm离心20 分钟，弃上清，留取沉淀物。2 .参加0.25mol/ L蔗糖一 0.003mol /L氯化钙液Iml，用吸管吹打成悬液，以17000rpm 离心20分钟，将上清吸入另一试管中，留取沉淀物，参加0.1ml 0.25mol/ L蔗糖一 0.003mol /L 氯化钙溶液混匀成悬液 可用牙签 。3 取上清液和沉淀物悬液，分别滴一滴于干净载玻片上 分别标记、 涂片 ，各滴 一滴0.02 %詹纳斯绿B染液盖上盖片染20分钟。 二