实验技能理论材料-微生物与生化药学

1、蛋白质多肽的分离纯化方法 2.1根据分子大小不同进行分离纯化 蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同,因此可以利用一些较简单的方法使蛋白质和小分子物质分开,并使蛋白质混合物也得到离。根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法。透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中,再浸入透析液进行分离。超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜,而蛋白质被截留在半透膜上的过程。这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。它们经常和盐析、盐溶方法联合使用,在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无

2、机盐。由于超滤过程中,滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度减慢,截流物质的分子量也越来越小。所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤得到更理想的效果。离心常用密度梯度(区带)离心。常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度。可以根据所需密度和渗透压的范围选择合适的密度梯度。凝胶过滤也称凝胶渗透层析,是根据蛋白质分子大小不同分离蛋白质最有效的方法之一。凝胶过滤的原理是当不同蛋白质流经凝胶层析柱时,比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构,而被排阻在凝胶珠之外,随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运动并最先流出柱外;反之,比凝胶珠孔径小的分子后流出柱外。目前常

3、用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等。凝胶过滤在目标蛋白的提取过程中也被用来除去与目标蛋白分子量差异大的杂蛋白小分子的杂质。2.2 根据溶解度不同进行分离纯化影响蛋白质溶解度的外部条件有很多,比如溶液的pH值、离子强度、介电常数和温度等。但在同一条件下,不同的蛋白质因其分子结构的不同而有不同的溶解度,根据蛋白质分子结构的特点,适当地改变外部条件,就可以选择性地控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度,达到分离纯化蛋白质的目的。常用的方法有等电点沉淀和pH值调节、蛋白质的盐溶和盐析、有机溶剂法、双水相萃取法、反胶团萃取法等。等电点沉淀和pH值调节是最常用的方法。每种蛋白质都有自己的等

4、电点,而且在等电点时溶解度最低;而在非等电点时很容易溶解。因而可以通过调节溶液的pH值来分离纯化蛋白质。有用此法有提取茶叶蛋白质、葵花脱脂粕蛋白质、葡萄籽蛋白质相关报道。 蛋白质的盐溶和盐析是中性盐显著影响球状蛋白质溶解度的现象,其中,增加蛋白质溶解度的现象称盐溶,反之为盐析。同样浓度的二价离子中性盐,如MgCl2、(NH4)2SO4对蛋白质溶解度影响的效果,要比一价离子中性盐如NaCl、NH4Cl大得多。盐析是提取血液中免疫球蛋白的常用方法,如多聚磷酸钠絮凝法、硫酸铵盐析法,其中硫酸铵盐析法广泛应用于生产。由于硫酸铵在水中呈酸性,为防止其对蛋白质的破坏,应用氨水调pH值至中性。为防止不同分子

5、之间产生共沉淀现象,蛋白质样品的含量一般控制在0.2% 2.0%。利用盐溶和盐析对蛋白质进行提纯后,通常要使用透析或者凝胶过滤的方法除去中性盐。有机溶剂提取法的原理是:与水互溶的有机溶剂(如甲醇、乙醇)能使一些蛋白质在水中的溶解度显著降低;而且在一定温度、pH值和离子强度下,引起蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度不同,因此,控制有机溶剂的浓度可以分离纯化蛋白质。例如,在冰浴中磁力搅拌下,在4预冷的培养液中缓慢加入乙醇(-25),可以使抗冻蛋白析出,从而纯化抗冻蛋白。由于在室温下,有机溶剂不仅能引起蛋白质的沉淀,而且伴随着变性。因此,通常要将有机溶剂冷却,然后在不断搅拌下加入有机溶剂防止局部浓度过高,蛋

6、白质变性问题就可以很大程度上得到解决。对于一些和脂质结合比较牢固或分子中极性侧链较多、不溶于水的蛋白质,可以用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂提取,它们有一定的亲水性和较强的亲脂性,是理想的提取液。冷乙醇分离法提取免疫球蛋白最早由Cohn于1949年提出,用于制备丙种球蛋白。冷乙醇法也是目前WHO规程和中国生物制品规程推荐的方法,不仅分辨率高、提纯效果好、可同时分离多种血浆成分,而且有抑菌、清除和灭病毒的作用。萃取是分离和提纯有机化合物常用的一种方法,而双水相萃取和反胶团萃取可以用来分离蛋白质。双水相萃取技术(Aqueous two phase extraction,ATPE)是指亲水性聚合物水溶液

7、在一定条件下形成双水相,由于被分离物在两相中分配的不同,便可实现分离,被广泛用于生物化学、细胞生物学和生物化工等领域的产品分离和提取。此方法可以在室温环境下进行,双水相中的聚合物还可以提高蛋白质的稳定性,收率较高。对于细胞内的蛋白质,需要先对细胞进行有效破碎。目的蛋白常分布在上相并得到浓缩,细胞碎片等固体物分布在下相中。采用双水相系统浓缩目的蛋白,受聚合物分子量及浓度、溶液pH值、离子强度、盐类型及浓度的影响。反胶团萃取法是利用反胶团将蛋白质包裹其中而达到提取蛋白质的目的。反胶团是当表面活性剂在非极性有机溶剂溶解时自发聚集而形成的一种纳米尺寸的聚集体。这种方法的优点是萃取过程中蛋白质因位于反胶

8、团的内部而受到反胶团的保护。2.3 根据电荷不同进行分离纯化 根据蛋白质的电荷即酸碱性质不同分离蛋白质的方法有电泳和离子交换层析两类。离子交换层析(Ion exchange chromatography,IEC)是以离子交换剂为固定相,依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。离子交换层析中,基质由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有正电荷的为阴离子交换树脂;反之为阳离子交换树脂。离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化。当蛋白质处于不同的pH值条件下,其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质,被留在层析柱上,通过提高洗脱液中的

9、盐浓度,将吸附在层析柱上的蛋白质洗脱下来,其中结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质,结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。 在外电场的作用下,带电颗粒(如不处于等电点状态的蛋白质分子)将向着与其电性相反的电极移动,这种现象称为电泳。聚丙烯酰胺电泳是一种以聚丙烯酰胺为介质的区带电泳,常用于分离蛋白质。它的优点是设备简单、操作方便、样品用量少。等电聚焦是一种高分辨率的蛋白质分离技术,也可以用于蛋白质的等电点测定。利用等电聚焦技术分离蛋白质混合物是在具有pH梯度的介质中进行的。在外电场作用下各种蛋白质将移向并聚焦在等于其等电点的

10、pH值梯度处形成一个窄条带。2.4 利用疏水基团的吸附作用疏水层析也称疏水作用下层析（hydrophobic interaction chromatography HIC）属于吸附层析一类。蛋白质表面一般有疏水与亲水集团，疏水层析是利用蛋白质表面某一部分具有疏水性，且不同蛋白质的疏水性具有差异，在高盐溶液中，蛋白质会与固定相载体上偶联的疏水性配基发生可逆性结合，在洗脱时，将盐浓度逐渐降低，因其疏水性不同而逐个地先后被洗脱而纯化。可用于分离其它方法不易纯化的蛋白质。一般而言，离子强度（盐浓度）越高，物质所形成的疏水键越强。影响疏水作用的因素包括：盐浓度，温度，pH，表面活化剂和有机溶剂。疏水层析

11、的应用与离子交换层析的应用刚好互补，因此，可以用于分离离子交换层析很难或不能分离的物质。2.5 利用对配体的特异亲和力进行分离纯化 亲和层析是利用蛋白质分子对其配体分子特有的识别能力(即生物学亲和力)建立起来的一种有效的纯化方法。它通常只需一步处理即可将目的蛋白质从复杂的混合物中分离出来,并且纯度相当高。应用亲和层析须了解纯化物质的结构和生物学特性,以便设计出最好的分离条件。近年来,亲和层析技术被广泛应用于靶标蛋白尤其是疫苗的分离纯化,特别是在融合蛋白的分离纯化上,亲和层析更是起到了举足轻重的作用,因为融合蛋白具有特异性结合能力。亲和层析在基因工程亚单位疫苗的分离纯化中应用也相当广泛。2.6

12、蛋白质的鉴定聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE（Polyacrylamide gel electrophoresis）聚丙烯酰氨凝胶电泳，是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法有两种：化学聚合法和光聚合法。化学聚合以过硫酸铵（APS）为催化剂，以四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。SDS(十二烷基磺酸钠)是阴离子表面活性剂，作为变性剂和助溶试剂，

13、它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。作用原理：聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。它有两种形式：非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）及SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）；非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带

14、的电荷量而逐渐呈梯度分开。而SDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。该技术最初由shapiro于1967年建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂（-巯基乙醇）后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小（可以忽略电荷因素）。总结 在实际工作中,很难用单一方法实现蛋白质的分离纯化,往往要综合几种方法才能提纯出一种蛋白质。理想的蛋白质分离提纯方法,要求产品纯度和总回收率越高越好,但实际上两者难以兼顾,因此,考虑分离提纯的条件和方法时,不得不在两者之间作适当的选择;一般情况下,科研上更多地选择前者,工业生产上更多地选择后者。因此,每当需要提纯某

15、种蛋白质时,首先要明确分离纯化的目的和蛋白质的性质,以便选择最佳的分离纯化方法,从而得到理想的效果。今后,蛋白质提纯技术的发展将不断促进对蛋白质性质的研究,同时对蛋白质性质的研究也将反过来提高蛋白质分离纯化技术,两者的互相促进终将会对生命科学的进步作出重大贡献。 核酸的分离与纯化第一节 核酸分离与纯化的设计与原则细胞内的核酸包括DNA与RNA两种分子，均与蛋白质结合成核蛋白（nucleoprotein）。DNA与蛋白质结合成脱氧核糖核蛋白（deoxyribonucleoprotein，DNP），RNA与蛋白质结合成核糖核蛋白（ribonucleoprotein，RNP）。其中真核生物的DNA又

16、有染色体DNA与细胞器DNA之分。前者位于细胞核内，约占95%，为双链线性分子；后者存在于线粒体或叶绿体等细胞器内，约占5%，为双链环状分子。除此之外，在原核生物中还有双链环状的质粒DNA；在非细胞型的病毒颗粒内，DNA的存在形式多种多样，有双链环状、单链环状、双链线状和单链线状之分。DNA分子的总长度在不同生物间差异很大，一般随生物的进化程度而增长。如人的DNA大约由3.0×109个碱基对（base pair, bp）组成，与5243bp的猿猴病毒（simian virus 40, SV40）相比，其长度约为后者的5.7×105倍。相对来讲，RNA分子比DNA分子要小得多

17、。由于RNA的功能是多样性的，RNA的种类、大小和结构都较DNA多样化。DNA与RNA性质上的差异决定了两者的最适分离与纯化的条件是不一样的。一、 材料与方法的选择（二）选择的原则核酸分离与纯化的方法很多，无论采取何种方法，都应遵循总的原则：一是保证核酸一级结构的完整性，因为完整的一级结构是核酸结构和功能研究的最基本的要求；二是尽量排除其它分子的污染，保证核酸样品的纯度，这是本章讨论的主要内容。（三）核酸完整性的保持为了保证核酸的完整性，在操作过程中，首先应尽量避免各种有害因素对核酸的破坏。影响核酸完整性的因素很多，包括物理、化学与生物学的因素，其中有些是可以避免的。如过酸或过碱，对核酸链中的

18、磷酸二酯键有破坏作用，在核酸的提取过程中，采用适宜的缓冲液，始终控制pH在410之间，就可以很好地避免其危害；另外如高温加热，除高温本身对核酸分子中的化学键的破坏作用外，还可能因煮沸带来液体剪切力，因此核酸提取常常在04的条件下进行。其次对无法避免的有害因素，应采取多种措施，尽量减轻各种有害因素对核酸的破坏。应尽量简化分离纯化的步骤，缩短提取的时间，减轻各种有害因素对核酸完整性的破坏； DNA酶（DNase或DNAase）的激活需要Mg2+、Ca2+等二价金属离子，若使用EDTA、柠檬酸盐并在低温条件下操作，基本上就可以抑制DNA酶的活性。RNA酶（RNase或RNAase）的广泛存在与不易失

19、活的特点，决定了生物降解是RNA提取过程中的主要危害因素。二、 技术路线的设计（一）核酸的释放正常情况下，无论是DNA还是RNA均位于细胞内，因此核酸分离与纯化的第一步就是破碎细胞、释放核酸。细胞的破碎方法非常多，包括机械法与非机械法两大类。机械法又可分为液体剪切法与固体剪切法。机械剪切作用的主要危害对象是高分子量的线性DNA分子，因此该类方法不适合于染色体DNA的分离与纯化。非机械法可分为干燥法与溶胞法，目前，大多采用溶胞法。其中采用适宜的化学试剂与酶裂解细胞的溶胞法因裂解效率高，方法温和，能保证较高的得率与较好地保持核酸的完整性而得到了广泛的应用。（二）核酸的分离与纯化细胞裂解物是含核酸分

20、子的复杂混合物，核酸分子本身可能仍与蛋白质结合在一起。在保证核酸分子完整性的前提下，要从中分离出一定量的、符合纯度要求的核酸分子，并不是一件很容易的事情，这需要我们在对核酸分子有关性质的充分认识的基础上，利用核酸与其它物质在一个或多个性质上的差异而设计有效方案加以分离。这种差异是多方面的，包括细胞定位与组织分布上的差异、物理化学性质上的不同以及各自独特的生物学特性。应该去除的污染物主要包括三个部分：即非核酸的大分子污染物，非需要的核酸分子和在核酸的分离纯化过程中加入的对后继实验与应用有影响的溶液与试剂。非核酸大分子污染物主要包括蛋白质、多糖和脂类物质等；非需要的核酸分子，是指制备DNA时，RN

21、A为污染物，制备RNA时，DNA为污染物，制备某一特定核酸分子时，其它的核酸分子均为污染物；至于在核酸分离纯化过程中加入的有机溶剂和某些金属离子，由于对后继实验有影响，往往需要很好地去除。（三）核酸质量与提取步骤的关系一般地，分离纯化步骤越多，核酸的纯度也越高，但得率会逐渐下降，完整性也愈难以保证。相反，通过分离纯化步骤少的实验方案，我们可以得到比较多的完整性较好的核酸分子，但纯度不一定很高。这需要结合核酸的用途而加以选择。（四）核酸的浓缩、沉淀与洗涤随着核酸提取试剂的逐步加入，以及去除污染物过程中核酸分子不可避免的丢失，样品中核酸的浓度会逐渐下降，及至影响到后面的实验操作或不能满足后继研究与

22、应用的需要时，需要对核酸进行浓缩。沉淀是核酸浓缩最常用的方法，其优点在于核酸沉淀后，可以很容易地改变溶解缓冲液和调整核酸溶液至所需浓度；另外，核酸沉淀还能去除部分杂质与某些盐离子，有一定的纯化作用。加入一定浓度的盐类后，用有机溶剂沉淀核酸。其中常用的盐类有醋酸钠、醋酸钾、醋酸铵、氯化钠、氯化钾及氯化镁等，常用的有机溶剂则有乙醇、异丙醇和聚乙二醇。核酸沉淀往往含有少量共沉淀的盐，需用70%75%的乙醇洗涤去除。对于浓度低并且体积较大的核酸样品，可在有机溶剂沉淀前，采用固体的聚乙二醇或丁醇对其进行浓缩处理。 三、 鉴定、保存与应用（一）核酸的鉴定1浓度鉴定 核酸浓度的定量鉴定可通过紫外分光光度法与

23、荧光光度法进行。（1）紫外分光光度法：紫外分光光度法是基于核酸分子成分中的碱基均具有一定的紫外线吸收特性，最大吸收波长在250nm270nm之间。这些碱基与戊糖、磷酸形成核苷酸后，其最大吸收波长不变。由核苷酸组成核酸后，其最大吸收波长为260nm，该物理特性为测定溶液中核酸的浓度奠定了基础。在波长260nm的紫外线下，1个OD值的光密度大约相当于50µg/ml的双链DNA，38µg/ml的单链DNA或单链RNA，33µg/ml的单链寡聚核苷酸。如果要精确定量已知序列的单链寡核苷酸分子的浓度，就必须结合其实际分子量与摩尔吸光系数，根据朗伯-比尔定律进行计算。若DNA

24、样品中含有盐，则会使A260的读数偏高，尚需测定A310以扣除背景，并以A260与A310的差值作为定量计算的依据。紫外分光光度法只用于测定浓度大于0.25µg/ml的核酸溶液。（2）荧光光度法：荧光光度法以核酸的荧光染料溴化乙锭（ethidium bromide，EB）嵌入碱基平面后，使本身无荧光的核酸在紫外线激发下发出橙红色的荧光，且荧光强度积分与核酸含量呈正比。该法灵敏度可达1ng5ng，适合低浓度核酸溶液的定量分析。另外，SYBR Gold作为一种新的超灵敏荧光染料，可以从琼脂糖凝胶中检出低于20pg的双链DNA。2纯度鉴定 紫外分光光度法还是荧光光度法，均可用于核酸的纯度鉴

25、定。（1）紫外分光光度法：紫外分光光度法主要通过A260与A280的比值来判定有无蛋白质的污染。在TE缓冲液中，纯DNA的A260/A280比值为1.8，纯RNA的A260/A280比值为2.0。比值升高与降低均表示不纯。其中蛋白质与在核酸提取中加入的酚均使比值下降。蛋白质的紫外吸收峰在280nm与酚在270nm的高吸收峰可以鉴别主要是蛋白质的污染还是酚的污染。RNA的污染可致DNA制品的比值高于1.8，故比值为1.8的DNA溶液不一定为纯的DNA溶液，可能兼有蛋白质、酚与RNA的污染，需结合其它方法加以鉴定。A260/A280的比值是衡量蛋白质污染程度的一个良好指标，2.0是高质量RNA的标

26、志。但要注意，由于受RNA二级结构不同的影响，其读数可能会有一些波动，一般在1.82.1之间都是可以接受的。另外，鉴定RNA纯度所用溶液的pH值会影响A260/A280的读数。如RNA在水溶液中的A260/A280比值就比其在Tris缓冲液（pH 7.5）中的读数低0.20.3。（2）荧光光度法：用溴化乙锭等荧光染料示踪的核酸电泳结果可用于判定核酸的纯度。由于DNA分子较RNA大许多，电泳迁移率低；而RNA中以rRNA最多，占到80%85%，tRNA及核内小分子RNA占15%20%，mRNA占1%5%。故总RNA电泳后可呈现特征性的三条带。在原核生物为明显可见的23S、16S的rRNA条带及由

27、5S的rRNA与tRNA组成的相对有些扩散的快迁移条带。在真核生物为28S、18S的rRNA及由5S、5.8S的rRNA和tRNA构成的条带（图6-1）。mRNA因量少且分子大小不一，一般是看不见的。通过分析以溴化乙锭为示踪染料的核酸凝胶电泳结果，我们可以鉴定DNA制品中有无RNA的干扰，亦可鉴定在RNA制品中有无DNA的污染。3完整性鉴定 常规使用凝胶电泳法。（1）凝胶电泳法：以溴化乙锭为示踪染料的核酸凝胶电泳结果可用于判定核酸的完整性。基因组DNA的分子量很大，在电场中泳动很慢，如果有降解的小分子DNA片段，在电泳图上可以显著地表现出来。而完整的无降解或降解很少的总RNA电泳图，除具特征性

28、的三条带外，三条带的荧光强度积分应为一特定的比值。沉降系数大的核酸条带，分子量大，电泳迁移率低，荧光强度积分高；反之，分子量小，电泳迁移率高，荧光强度积分低。一般28S（或23S）RNA的荧光强度约为18S（或16S）RNA的2倍，否则提示有RNA的降解。如果在加样槽附近有着色条带，则说明有DNA的污染。（2）其它方法：必要时，还可以通过一些特殊的试验来分析RNA的完整性，如小规模的第一链cDNA合成反应、以放射性标记的寡脱氧胸苷酸oligo(dT)为探针的Northern杂交以及对已知大小的mRNA的Northern杂交。另外，随着毛细管电泳与生物芯片技术的飞速发展，有关核酸的分离、纯化、鉴

29、定与回收的手段日益丰富。（二）核酸的保存核酸的结构与性质相对稳定，无需每次制备新鲜的核酸样品，且一次性制备的核酸样品往往可以满足多次实验研究的需要，因此有必要探讨核酸的贮存环境与条件。与分离纯化一样，DNA与RNA的保存条件也因性质不同而相异。1DNA的保存 对于DNA来讲，溶于TE缓冲液在-70可以储存数年。其中TE的pH值为8，可以减少DNA 的脱氨反应而pH低于7.0时DNA容易变性；EDTA作为二价金属离子的螯合剂，通过螯合Mg2+、Ca2+等二价金属离子以抑制DNA酶的活性；低温条件则有利于减少DNA分子的各种反应；双链DNA因结构上的特点而具有很大的惰性，常规4亦可保存较长时间；在

30、DNA样品中加入少量氯仿，可以有效避免细菌与核酸的污染。2RNA的保存 RNA可溶于0.3mol/L的醋酸钠溶液或双蒸消毒水中，-70至-80保存。若以焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）水溶解RNA或者在RNA溶液中加入RNA酶阻抑蛋白（RNasin）或氧钒核糖核苷复合物（vanadyl-ribonucleoside complex，VRC），则可通过抑制RNA酶对RNA的降解而延长保存时间。另外，RNA沉淀溶于70%的乙醇溶液或去离子的甲酰胺溶液中，可于-20长期保存。其中，甲酰胺溶液能避免RNase对RNA的降解，而且RNA极易溶于甲酰胺溶液，其浓度可高达

31、4mg/ml。需要注意的是，这些所谓RNA酶抑制剂或有机溶剂的加入，只是一种暂时保存的需要，如果它们对后继的实验研究与应用有影响，则必须予以去除。由于反复冻融产生的机械剪切力对DNA与RNA核酸样品均有破坏作用，在实际操作中，核酸的小量分装是十分必要的。（三）核酸的应用分离纯化的核酸样品，既可用于核酸本身功能与性质的研究，亦可利用其功能与性质进行广泛的应用，如基因工程与蛋白质工程均以核酸分子作为原始材料。可以说，目前包括聚合酶链反应，核酸的分子杂交与DNA重组与表达技术在内的绝大多数分子生物学技术，都是以核酸分子为处理对象，利用核酸分子的碱基配对原理与核酸的一种或多种酶修饰性进行的。绝大多数分

32、子生物学技术，实质上是对DNA和RNA的分析。没有核酸的分离与纯化，分子生物学技术就没有研究与应用的基础。第二节 质粒DNA的提取与纯化大多数质粒都是双链的共价闭合环状质粒（CCC plasmid）DNA，简称闭环质粒（closed circular plasmid，CC plasmid）。作为携带外源基因在细菌中扩增或表达的重要载体（vector），质粒在基因工程中应用十分广泛。有关质粒的提取与纯化是必须掌握的基本技术。一、 提取与纯化的方法质粒DNA的提取与纯化的方法很多，经典的方法包括碱裂解法、煮沸裂解法、SDS裂解法等。这些方法主要由细菌的培养（质粒DNA的扩增）、细菌的裂解（质粒DN

33、A的释放）及质粒DNA的分离与纯化等三个步骤组成。按制备量的不同，质粒DNA提取与纯化的方法可分为质粒DNA的小量（1ml2ml）制备、质粒DNA的中量（20ml50ml）制备及质粒DNA的大量（500ml）制备。（一）碱裂解法碱裂解法简单、重复性好而且成本低，是使用最广泛的方法。在NaOH提供的高pH（12.012.6）条件下，用强阳离子去垢剂SDS破坏细胞壁，裂解细胞，与NaOH共同使宿主细胞的蛋白质与染色体DNA发生变性，释放出质粒DNA。尽管碱液能破坏核酸的碱基配对，但CCC质粒DNA因缠结紧密而不会解链。只要不在碱性条件下变性太久，当pH调至中性时，CCC质粒DNA就可重新恢复其天然

34、状态。裂解后，细胞壁碎片与变性的蛋白质和染色体DNA形成大的复合物，这些复合物在高钾盐条件下，可有效沉淀，而质粒DNA保留于上清中。直接通过无水乙醇沉淀质粒DNA，并用70%的乙醇洗涤，其纯度可满足DNA测序与PCR等实验的要求。碱裂解法是一种适用范围很广的方法，能从所有的大肠杆菌（E.coli）菌株中分离出质粒DNA，制备量可大可小。（二）煮沸裂解法煮沸裂解法是将细菌悬浮于含Triton X-100和溶菌酶的缓冲液中，Triton X-100和溶菌酶破坏细胞壁后，沸水浴裂解细胞的同时可破坏DNA链的碱基配对，并使宿主细胞的蛋白质与染色体DNA变性，但CCC质粒DNA因结构紧密不会解链。当温度

35、下降后，CCC质粒DNA可重新恢复其超螺旋结构。通过离心去除变性的蛋白质和染色体DNA，然后回收上清中的质粒DNA。煮沸裂解法是一种条件比较剧烈的方法，对于大质粒（>15kb）有明显的剪切作用，故只能用于小质粒DNA（<15kb）的制备。该法能用于小质粒DNA的小量与大量制备，并且适用于大多数的E.coli菌株。由于糖类很难去除，而且糖抑制限制性酶和聚合酶的活性，故该法不适用于在去污剂、溶菌酶和加热情况下可释放大量糖类的E.coli菌株，如HB101及其衍生菌株（TG1）。另外，煮沸不能完全灭活核酸内切酶A（endonuclease A，endA）的活性，故表达endA的菌株亦不适

36、用于本法。在细菌培养过程中，加入氯霉素可抑制细菌的蛋白合成和细菌分裂，有利于质粒DNA的选择性扩增。（三）SDS裂解法大于15kb的质粒DNA容易因细胞裂解和后继操作而遭到破坏，因此需要温和的裂解方法。SDS裂解法是将细菌悬浮于等渗的蔗糖溶液中，用溶菌酶和EDTA处理以破坏细胞壁，去壁细菌再用SDS裂解，从而温和地释放质粒DNA到等渗液中，然后用酚/氯仿抽提。由于条件温和，SDS裂解法有利于大质粒DNA的提取。但该法在处理过程中，有一部分质粒DNA因缠结在细胞碎片上而丢失，故产率不高。（四）其它方法其它方法如小量一步提取法、牙签少量制备法及Triton-溶菌酶法等，各有特点与适用范围。小量一步

37、提取法，直接将酚/氯仿与细菌培养物混合，同时完成细胞裂解与蛋白质变性两个过程，然后离心去除大部分胞核DNA与蛋白质，最后从上清中回收质粒DNA。该法简单快速、经济可行，可用于内切酶图谱分析。（五）质粒DNA的纯化目前，关于纯化的方法与方案非常多，都利用了质粒相对较小和共价闭环的结构特点。其中，纯化效果好而且适用范围广的方法主要有氯化铯-溴化乙锭等密度梯度超速离心法（简称CsCl-EB法）、聚乙二醇沉淀法和柱层析法。1聚乙二醇沉淀法 聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）沉淀法是一种分级沉淀法。质粒DNA的粗制品首先用LiCl沉淀大分子RNA，并用RNase消化小分子RNA；

38、然后在高盐条件下，用PEG选择性地沉淀大的质粒DNA；沉淀的质粒DNA进一步用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀。该法简单、经济、适用广，尤其对碱裂解法提取的质粒纯化效果好，适用于分子克隆中所有常规的酶学反应，也能用于高效的哺乳动物细胞的转染。但PEG法不能有效分离带切口的环状质粒DNA与闭环质粒DNA。2柱层析法 柱层析法纯化质粒DNA的关键是其填充的树脂。大体上，树脂可分为两类：一类是利用疏水的相互作用来纯化质粒DNA样品；一类则通过离子交换与吸附的相互作用进行纯化。以硅基质作为填充材料的柱层析，其作用原理是在多盐条件下，依靠DNA与硅基质的可逆性结合来进行纯化。多盐造成磷酸二酯骨架的脱水，通过暴露的

39、磷酸盐残基，DNA吸附到硅基质上，以50%的乙醇溶液洗去RNA和糖类等生物大分子，然后加入TE或水溶液使DNA分子重新水合，并通过离心洗脱出来。DNA与硅基质的吸附作用与DNA的碱基组成和拓扑结构无关，因此可用于环型质粒DNA和线性DNA的纯化。小于100bp200bp的DNA分子由于与硅基质的吸附力很弱，不能用于小分子DNA片段的纯化。但在纯化大分子DNA时，可有效去除小分子DNA的污染。多糖的提取和纯化摘 要   本文较详细地介绍了多糖的提取和纯化方法，为多糖的研究和生产提供参考依据。关键词   多糖；提取；纯化；活性炭多糖（polysacharid

40、es，PS），又称多聚糖，是由10个以上的单糖通过苷键连接而成的，具有广泛生物活性的天然大分子化合物。它广泛分布于自然界高等植物、藻类、微生物（细菌和真菌）与动物体内。20世纪60年代以来，人们逐渐发现多糖具有复杂的、多方面的生物活性和功能1：(1)多糖可作为广谱免疫促进剂，具有免疫调节功能，能治疗风湿病、慢性病毒性肝炎、癌症等免疫系统疾病，甚至能抗AIDS病毒2。如甘草多糖具有明显的抗病毒和抗肿瘤作用10，黑木耳多糖、银杏外种皮多糖和芦荟多糖可抗肿瘤和增强人体免疫功能3-5。(2)多糖具有抗感染、抗放射、抗凝血、降血糖、降血脂、促进核酸与蛋白质的生物合成作用。如柴胡多糖具有抗辐射，增强免疫功

41、能等生物学作用6，麦冬多糖具有降血糖及免疫增强作用7-8，动物黏多糖具有抗凝血、降血脂等功能9。(3)多糖能控制细胞分裂和分化，调节细胞的生长与衰老。如爬山虎多糖具有抗病毒和抗衰老作用10，银杏外种皮粗多糖具有抗衰老、抗过敏、降血脂、止咳祛痰、减肥等功能11。另外，多糖作为药物，其毒性极小，因而多糖的研究已引起人们极大的兴趣。由于多糖具有的生物活性与其结构紧密相关，而多糖的结构又是相当复杂的，所以在这一领域的研究相对缓慢。但人们在多糖的分离提取与纯化方面已做出了不少工作。1. 多糖的提取121.1 热水浸提法：1.1.1多糖提取条件的优选根据文献报道13：影响热水浸提多糖的因素主要有提取时间、

42、提取次数、溶剂体积、浸提温度、pH值、醇析浓度和植物颗粒大小等。在试验前对上述多种因素利用正交实验法做出优选，才能选出最佳提取方案。1.1.2其步骤为：原料粉碎脱脂粗提（23次）吸滤或离心沉淀洗涤干燥首先除去表面脂肪。原料经粉碎后加入甲醇、乙醚、乙醇、丙酮或1：1的乙醇乙醚混合液，水浴加热搅拌或回流13小时，脱脂后过滤得到的残渣一般用水作溶剂（也有用氢氧化钾碱性水液、氯化钠水液、1醋酸和1苯酚或0.11M氢氧化钠作为提取溶剂）提取多糖。温度控制在90100，搅拌46小时，反复提取23次。得到的多糖提取液大多较粘稠，可进行吸滤。也可用离心法将不溶性杂质除去，将滤液或上清液混合（得到的多糖若为碱性

43、则需要中和）。然后浓缩，再加入25倍低级醇（甲醇或乙醇）沉淀多糖；也可加入费林氏溶液或硫酸铵或溴化十六烷基三甲基铵等，与多糖物质结合生成不溶性络合物或盐类沉淀。然后依次用乙醇、丙酮和乙醚洗涤。将洗干后疏松的多糖迅速转入装有五氧化二磷和氢氧化钠的真空干燥器中减压干燥（若沉淀的多糖为胶状或具粘着性时，可直接冷冻干燥）。干燥后可得粉末状的粗多糖。1.2 微波辅助提取法：其原理为利用不同极性的介质对微波能的不同吸收程度，使基体物质中的某些区域和萃取体系中的某些组分被选择性加热，从而使萃取物质从基体或体系中分离出来，进入到介电常数小，微波吸收能力较差的萃取剂中14。由于微波能极大加速细胞壁的破裂，因而应

44、用于中草药中有效成分的提取能极大加快提取速度，增加提取产率。而且由于其选择性好，提取后基体能保持良好的性状，提取液也较一般的提取方法澄清15。聂金源等在柴胡多糖和黄酮化合物的提取18中对微波辅助提取法、超声辅助法和索氏提取法进行比较，发现微波辅助提取法所需时间最短（10min），多糖的提取率最高（28.46）。1.3 超声辅助法：其原理是利用超声波的空化作用加速植物有效成分的浸出提取，另外超声波的次级效应，如机械振动、乳化、扩散、击碎、化学效应等也能加速欲提取成分的扩散释放并充分与溶剂混合，利于提取16。超声波辅助法与常规提取法相比，具有提取时间短、产率高、无需加热等优点17。1.4 索氏提取

45、法：    将植物粉末置于索氏提取器中，加入石油醚，60-90条件下提取至无色（一般为6小时）。过滤，滤渣挥发干燥完溶媒后加入80%乙醇，再提取6小时，过滤，滤渣乙醇挥发干燥后加蒸馏水。回流提取2次，趁热过滤，滤液减压浓缩，再除蛋白，醇沉，除色素。60干燥，称重。1.5 醇提法：先后将90%和50%乙醇加入植物粉末中，振荡充分再抽滤。滤液中加入足量无水乙醇，至于4冰箱中过夜。减压抽滤，再除去色素，得多糖粗品，在60通风干燥箱中干燥，再置干燥皿中恒重保存。醇提法方法简单，易于操作，但提取率较低，乙醇使用量大，不宜大规模提取使用。1.6 其它方法：多糖的提取方法还有稀

46、碱液浸提法、稀酸液浸提法、酶法等。但由于稀酸、稀碱条件下，易使多糖发生糖苷键的断裂，部分多糖发生水解而使多糖的提取率减少，因而很多试验中避免采用稀碱液浸提法和稀酸液浸提法。2. 多糖的纯化2.1 多糖中杂质除去方法  粗多糖中往往混杂着蛋白质、色素、低聚糖等杂质，必须分别除去。2.1.1 除蛋白质采用醇沉或其它溶剂沉淀所获得的多糖，常混有较多的蛋白质，脱去蛋白质的方法有多种：如选择能使蛋白质沉淀而不使多糖沉淀的酚、三氯甲烷、鞣质等试剂来处理，但用酸性试剂宜短，温度宜低，以免多糖降解。常用的方法有19：2.1.1.1 沙维积法（Sevag法）20：根据蛋白质在氯仿等有机溶剂变性而不溶与

47、水的特点，将多糖水溶液、氯仿、戊醇（或正丁醇）之比调为25:5:1或25:4:1，混合物剧烈振摇20到30分钟，蛋白质与氯仿戊醇（或正丁醇）生成凝胶物而分离，然后离心，分去水层和溶剂层交界处的变性蛋白质。此种方法较温和，在避免降解上有较好效果，但效率不高，如五味子多糖的提取实验中要重复处理达三十几次。并且每次除去蛋白质变性胶状物时，不可避免的溶有少量多糖，另外少量多糖与蛋白质结合的蛋白聚糖和糖蛋白，在处理时会沉淀下来，造成多糖的损失。如能配合加入一些蛋白质水解酶，再用Sevage法效果更佳。2.1.1.2 三氟三氯乙烷法21：多糖溶液与三氟三氯乙烷等体积混合，低温下搅拌10min左右，离心得上

48、面水层，水层继续用上述方法处理几次，即得无蛋白质的多糖溶液，此法效率高，但溶剂沸点较低，易挥发，不宜大量应用。2.1.1.3 三氯醋酸法：在多糖水溶液中滴加530三氯醋酸，直至溶液不再继续混浊为止，在510放置过夜，离心除去沉淀即得无蛋白质的多糖溶液。此法会引起某些多糖的降解。    Sevag法、三氟三氯乙烷法和三氯醋酸法三种方法均不适合糖肽，因糖肽也会像蛋白质那样沉淀出来。对于对碱稳定的糖蛋白，在硼氢化钾存在下，用稀碱温和处理，可以把这种结合蛋白质分开1。2.1.1.4 酶解法22：在样品溶液中加入蛋白质水解酶，如胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、链霉蛋白酶等，

49、使样品中的蛋白质降解。通常将其与Sevag法综合使用除蛋白质效果较好。2.1.1.5 盐酸法23：取样品浓缩液，用2mol/L盐酸调节其PH至3，放置过夜，在3000r/min条件下离心，弃去沉淀，即脱去蛋白质。    另有李知敏23和叶将瑜25等人分别在植物多糖实验中证明：盐酸法、三氯乙酸法及Sevag法脱蛋白率分别为72.5、46.1和42.3，多糖的损失率分别为15.1%、6.1和14.3。盐酸法脱蛋白率高，但多糖的损失率也较高;三氯乙酸法较温和，但除蛋白效率不高；Sevag法的脱蛋白效果不及前两种。2.1.1.6 其它方法：可以加入5%ZnSO4溶液和饱和

50、Ba（OH）2溶液，振荡后离心去蛋白。此法除蛋白不够彻底，可结合Sevag法使用。还可在提取液中加入50%的TCA溶液至沉淀完全，在4000r/min的条件下离心10min，收集上清液，即为除蛋白液。还有人使用4:1的氯仿-乙醇溶液除蛋白，将混合液清摇，再静置，取上清液。此过程需重复多次方可除尽蛋白。除去蛋白质的样品用紫外分光光度计检验，观察在280mm处是否有吸收，如果无吸收则表明蛋白质已经除尽24。2.1.2 除色素2.1.2.1活性炭（activated carbon）除色素12：活性炭属于非极性吸附剂，有着较强的吸附能力，特别适合于水溶性物质的分离。它的来源充足，价格便宜，上柱量大，适

51、用于大量制备性分离。目前用于色谱分离的活性炭主要分为粉末状活性炭、颗粒状活性炭、锦纶活性炭三种。一般情况下，尽量避免用活性炭处理，因为活性炭会吸附多糖，造成多糖的损失。2.1.2.2对于植物来源的多糖，可能含有酚型化合物而颜色较深，这类色素大多呈负性离子，不能用活性炭吸收剂脱色，可用弱碱性树脂DEAE纤维素或DuoliteA7来吸附色素。2.1.2.3若糖和色素时结合的，易被DEAE纤维素吸附，不能被水洗脱，这类色素可进行氧化脱色：以浓氨水或NaOH液调至PH8.0左右，50以下滴加H2O2至浅黄色，保温2小时。2.1.2.4 依次用丙酮、无水乙醚和无水乙醇洗涤多糖，即可得到较为纯净的多糖。此

52、法较为简单，便于操作，多糖损失也较小。2.1.2.5 用4:1的氯仿-正丁醇除色素。操作简单，多糖有一定损失。2.1.2.6发酵来源的多糖颜色一般较浅，色素含量较少，一般可不除色素。2.1.2.7对于动物，微生物等提取得到的多糖也可根据不同情况按上述方法处理。2.1.3 除低聚糖等小分子杂质2.1.3.1采用逆向流水透析法。即准备好一桶蒸馏水，用一根导管将水通入透析袋的烧杯底部，另用一根导管将水引出，根据水量控制流速，使水缓慢流动48小时。这样得到的就是多糖的半精品。2.1.3.2利用溶液浓度扩散效应，将分子量小的物质如无机盐、低聚糖等从透析袋渗透到袋外的蒸馏水中，不断换水即可保持浓度差，从而

53、除尽小分子杂质。具体的做法是根据多糖溶液的体积截取相应长度的透析袋，用透析夹夹住一端，灌入多糖液，离液面23cm处夹紧透析袋，置于一大烧杯中，注入蒸馏水至完全浸没透析袋后，用磁力搅拌器慢速搅拌，每12小时换一次水，重复34次。2.2 多糖的纯化方法  纯化是将多糖混合物分离为单一多糖的过程，纯化的方法主要有以下几种：2.2.1 分部沉淀法 根据各种多糖在不同浓度的低级醇或丙酮中具有不同溶解度的性质，逐次按比例由小到大加入甲醇或乙醇或丙酮，收集不同浓度下析出的沉淀，经反复溶解与沉淀后，直到测得的物理常数恒定（最常用的是比旋光度测定或电泳检查）。这种方法适合于分离各种溶解度相差较大的多糖

54、。为了多糖的稳定，常在pH7进行，唯酸性多糖在pH7时COOH是以COO 离子形式存在的，需在pH24进行分离，为了防止苷键水解，操作宜迅速。此外也可将多糖制成各种衍生物如甲醚化物、乙酰化物等，然后将多糖衍生物溶于醇中，最后加入乙醚等极性更小的溶剂进行分级沉淀分离。2.2.2 盐析法 在天然产物的水提液中，加入无机盐，使其达到一定浓度或饱和，促使有效成分在水中溶解度降低沉淀析出，与其它水溶性较大的杂质分离。常做盐析的无机盐的有氯化钠、硫酸钠、硫酸镁、硫酸铵等。2.2.3 季铵盐沉淀法 季铵盐及其氢氧化物是一类乳化剂，可与酸性糖形成不溶性沉淀，常用于酸性多糖的分离。通常季胺盐及其氢氧化物并不与中

55、性多糖产生沉淀，但当溶液的PH增高或加入硼砂缓冲液使糖的酸度增高时，也会与中性多糖形成沉淀。常用的季铵盐有十六烷基三甲胺的溴化物（CTAB）及其氢氧化物（cetyl trimethyl ammonium hydroxide，CTAOH）和十六烷基吡啶（cetylpyridinm hydroride，CPOH）。CTAB或CPOH的浓度一般为110（W/V）的多糖溶液中，酸性多糖可从中性多糖中沉淀出来，所以控制季铵盐的浓度也能分离各种不同的酸性多糖。值得注意的是酸性多糖混合物溶液的PH要小于9，而且不能有硼砂存在，否则中性多糖将会被沉淀出来。2.2.4 柱层析：包括纤维素柱层析、纤维素阴离子交换柱层析、凝胶柱层析、亲和层析、高压液相层析和其它柱层析。如用活性炭及硅胶做载体的柱层来分离多糖；或用硼砂型的离子交