第七章 微生物的遗传与变异

1、第七章 微生物的遗传与变异一、目的要求 掌握和了解微生物遗传变异的基本规律，为培育优良品种打下良好的基础。二、教学内容 1遗传变异的物质基础2基因突变3诱变育种4基因重组5基因工程6菌种退化、复壮和保藏三、重点内容1基因突变的特点和机制2诱变育种3原核微生物的基因生组与真核微生物的准性生殖4菌种的保藏四、教学方法应用多媒体进行课堂教学遗传和变异是生物体的最本质的属性之一。遗传就是指子代和亲代相似的现象；变异就是子代与亲代间的差异。遗传保证了种的存在和延续；而变异则推动了种的进化和发展。遗传型又称基因型，指某一生物个体所含有全部遗传因子即基因的总和。它是一种内在潜力，只有在适当的环境条件下，通过

2、自身的发代谢和发育，才能将它具体化，即产生表型。表型是指某一生物体所具有的一切外表特征及内在特性的总和，是遗传型在合适环境下的具体体现。变异是指生物体在某种外因或内因的作用下所引起的遗传物质结构或数量的改变。特点：几率低（10-5-10-10）；性状的幅度大；新性状具稳定和遗传性。饰变是指不涉及遗传物质结构改变而只发生在转录、转译水平上的表型变化。特点：个体变化相同；性状变化的幅度小；新性状不具遗传性。如粘质沙雷氏菌，在25培养时，可产生深红色的灵杆菌素，这是一种饰变，但当在37培养时，则不产生色素，再在25下培养时，又恢复产生色素的能力。由于微生物有一系列非常独特的生物学特性，因而在研究现代

3、遗传学和其他许多重要的生物学基本理论问题中，微生物成为最热衷的研究对象。如：个体微小，结构简单；营养体一般都是单倍体；繁殖快；易于累积不同的中间代谢物；菌落形态可见性与多样性等。对微生物遗传规律的深入研究，不仅促进了现代分子生物学和生物工程学的发展，而且还为育种工作提提供了丰富的理论基础，促使育种工作向着不自觉到自觉，从低效到高效，从随机到定向，从近缘杂交到远缘杂交等方向发展。第一节 遗传变异的物质基础遗传变异有无物质基础以及何种物质可承担遗传变异功能的问题，是生物学中的一个重大理论问题。只到1944年后，利用微生物这一实验对象进行了三个著名的实验，才以确凿的事实证实了核酸尤其是DNA才是遗传

4、变异的真正物质基础。一、三个经典实验（一）转化实验创立人：英国人Griffith于1928年首次发现这一现象。研究对象：肺炎链球菌S型和R型过程：动物实验；细菌培养试验；S型菌的无细胞抽提液试验；1944年Avery等人从热死的S型中提纯了可能作为转化因子的各种成分，并在离体条件下进行了转化实验。（二）噬菌体感染实验创立人：美国人Hershey AND Chase于1952年研究对象：噬菌体过程：将大肠杆菌培养在以放射性32PO43-或35SO42-作为磷源或硫源的组合培养基中。结果，可以获得含32P-DNA（噬菌体核心）的噬菌体或含35S-蛋白质（噬菌体外壳）的两种实验用噬菌体。用标记的T2

5、噬菌体侵染没有标记的大肠杆菌H，结果表明，T2噬菌体外壳蛋白中有35S放射性并与细菌的胞壁连接，而DNA部分则有32P放射性并进入细胞的细胞质中。这一事实说明，在噬菌体侵染细菌过程中蛋白质外壳留在细菌细胞外，只有DNA进入了细胞，又一次证明遗传物质是DNA，而不是蛋白质。（三）植物病毒的重建实验创立人：Conrat AND Singer于1956年创立研究对象：TMV AND HRV过程：将两病毒的RNA和蛋白质外壳分别抽取出来并重新进行组合。随后去感染花叶，发现病斑由各自的RNA决定，而不是由蛋白质决定。这充分说明了，在RNA病毒中，遗传的物质基础也是核酸，只不过是RNA罢了。由此，可得出：

6、只有核酸才是负荷遗传信息的真正物质基础。（四）朊病毒的发现和思考无论是DNA还是RNA作为遗传物质的基础已是无可辨驳的事实。但朊病毒的发现对“蛋白质不是遗传物质的定论也带来一些疑云。PrP是具有传染性的蛋白质致病因子，迄今未发现蛋白内有核酸，但已知的传染性疾病的传播必须有核酸组成的遗传物质，才能感染宿主并在宿主体内自然繁殖。那么这是生命界的又一特例呢？还是因为目前人们的认识和技术所限而尚未揭示的生命之谜呢？还有待于生命科学家去认识和探索。二、遗传物质在细胞内的存在形式除部分病毒的遗传物质是RNA外，其余病毒及全部具有典型细胞结构的生物体的遗传物质都是DNA。按其在细胞中存在形式可分成染色体DN

7、A和染色体外DNA。原核细胞和真核细胞中的DNA存在形式不完全相同。 1DNA在原核细胞中的存在方式 原核细胞最大的细胞学特点就是无核膜与核仁的分化，只有一个核区称拟核。其染色体DNA处于拟核区，无组蛋白，近年来发现与非组蛋白结合。结构上为双链环状DNA。几种微生物染色体的物理特性见表。原核细胞的染色体外DNA主要指质粒（如F因子、R 因子、Col因子）。微生物核酸种类形状大肠杆菌dsDNA环状T2噬菌体dsDNA线状噬菌体dsDNA线状或环状X174ssDNA环状TMVssRNA线状 2DNA在真核细胞中的存在方式 真核细胞DNA分为核DNA和核外DNA。核DNA即染色体DNA，它与组蛋白结

8、合构成具有复杂结构的染色体。核外DNA是指线粒体和叶绿体等DNA，其结构与原核细胞的DNA相似，亦能编码结构蛋白。 三、基因和性状 (一)基因的概念 基因是由丹麦生物学家WJohansen于1909年提出来的，他用“基因”这个述语来代替孟德尔的“遗传因子”。直到本纪世50年代以后，“基因”才有一个较明确的概念。概括地说：“基因”是一个具有遗传因子效应的DNA片段，它是遗传物质的最小功能单位。 (二)性状的决定基因表达性状是构成一个生物个体的有关结构、形态、物质和功能等各方面特征的总称。基因表达是遗传信息表现为生物性状的过程，这一过程是通过基因产物的生物学功能来完成的。基因决定性状，而性状则是基

9、因表达的最终结果。基因依其功能的差别可分成调节基因、操纵基因和结构基因3大类。结构基因是为细胞结构、组成(如细胞生化反应所需的酶)及完成细胞功能所需的蛋白质等进行编码的基因。调节基因：用于编码组成型调节蛋白的基因。操纵基因：是位于启动基因和结构基因之间的一段碱基顺序，能与调节蛋白相结合，以此来决定结构基因的转录是否能进行。蛋白的表达不仅受结构基因控制，同时也受调节基因和操纵基因的调控。生物体的遗传信息通过 “中心法则”(少数生物以“逆转录”方式)来完成世代间的传递，从而保证世世代代性状的相似性。第二节 基因突变突变是生物的基本属性，在广义上，突变是指染色体数量、结构及组成等遗传物质发生多种变化

10、，包括基因突变和染色体畸变。一个基因内部遗传结构或DNA序列的任何改变，而导致的遗传变化称为基因突变。其发生变化的范围很小，所以又称点突变。染色体的畸变是指由染色体的大段损伤引起的。包括大段染色体的缺失、重复、倒位等。基因突变是重要的生物学现象，它是一切生物变化的根源。连同基因转移、重组一起提供了推动生物进化的遗传多变性。一、基因突变的类型1碱基变化与遗传信息的改变不同的碱基变化对遗传信息的改变是不同的，可分为四种类型：同义突变：指某个碱基的变化没有改变产物氨基酸序列的密码子变化。错义突变：指碱基序列的改变引起了产物氨基酸的改变。有些错义突变严重影响蛋白质活性甚至使之完全无活性，从而影响了表型

11、。如果该基因是必需基因，则该突变为致死突变。无义突变：指某个碱基的改变，使代表某种氨基酸的密码子变为蛋白质合成的终止密码子（UAA，UAG，UGA）。蛋白质的合成提前终止，产生截短的蛋白质。移码突变：由于DNA序列中发生1-2个核苷酸的缺失或插入，使翻译的阅读框发生改变，从而导致从改变位置以后的氨基酸序列的完全变化。2表型变化 (1)营养缺陷型 某一野生型菌株由于发生基因突变而丧失合成一种或几种生长因子的能力，因而无法在基本培养基上正常生长繁殖的变异类型，称为营养缺陷型。 (2)抗性突变型 由于基因突变而使原始菌株产生了对某种化学药物或致死物理因子抗性的变异类型。抗性突变型普遍存在，例如对各种

12、抗生素的抗药性菌株等。 (3)条件致死突变型 指在某一条件下具有致死效应，而在另一条件下没有致死效应的突变型。Ts突变株（温度敏感突变株）是一类典型的条件致死突变株。例如，大肠杆菌的某些菌株可在37下正常生长，却不能在42下生长等。又如，某些T4噬菌体突变株在25下可感染其宿主，而在37却不能感染等。 (4)形态突变型 指造成形态改变的突变型。包括影响细胞个体形态和菌落形态及影响噬菌体的噬菌斑形态的突变型。 另外还有抗原突变型、产量突变型等。 二、突变率和基因符号每一细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率，称突变率。例如，突变率为10-8的，即指该细胞在一亿次细胞分裂中，会发生一次突变。突变率

13、也可以用每一单位群体在每一世代中产生突变株的数目来表示。例如，一个含108个细胞的群体，当其分裂为2×108个细胞时，即可平均发生一次突变的突变率也是10-8。常用的基因突变符号：每个基因座位用其英文单词的头3个英文字母的小写来表示，如组氨酸：his；其座位上的不同基因突变则在3个英文小写字母后加一个大写字母表示，如hisA、hisB代表组氨酸的A基因和B基因；在3个字母的右上方可用不同符号表示微生物的突变型，如his+、his-分别表示组氨酸原养型和缺陷型， gal+、gal-分别表示能发酵半乳糖和不能发酵半乳糖，strs、strr分别表示对链霉素敏感和具抗性。 三、突变

14、的特点 整个生物界，由于它们遗传物质的本质都是相同的，所以显示在遗传变异的特点上也都遵循着同样的规律，这在基因突变的水平上尤为明显。下面以细菌的抗药性为例，来说明基因突变的一般规律。 细菌产生抗药性可通过三条途径，即基因突变、抗药性质粒(R因子)的转移和生理上的适应性。这里要讨论的只是基因突变，它有以下7个特点。 (1)不对应性 指突变的性状与引起突变的原因间无直接的对应关系。这是突变的一个重要特点，也是容易引起争论的问题。 (2)自发性 各种性状的突变，可以在没有人为的诱变因素处理下自发地产生。 (3)稀有性 自发突变虽可随时发生，但其突变率却是极低和稳定的，一般在10-6-10-9之间。

15、(4)独立性 突变的发生一般是独立的，即在某一群体中，既可发生抗青霉素的突变型，也可发生抗链霉素或任何其他药物的突变型，而且还可发生其他任何性状的突变型。某一基因的突变，既不提高也不降低其他任何基因的突变率。 (5)诱变性 通过诱变剂的作用，可以提高上述自发突变的几率，一般可提高10-105倍。不论是通过自发突变或诱发突变(诱变)所获得的突变株，其间并无本质上的差别，这是因为，诱变剂仅起着提高诱变率的作用。 (6)稳定性 由于突变的根源是遗传物质结构上发生了稳定的变化，所以产生的新的变异性状也是稳定的、可遗传的。 、 (7)可逆性 由原始的野生型基因变异为突变型基因的过程，称为正向突变，相反的

16、过程则称为回复突变或回变实验证明，任何性状都可发生正向突变，也都可发生回复突变。 四、基因突变的自发性和不对应性的证明 在各种基因突变中，抗性突变最为常见。但在过去很长一段时间中对这种抗性产生的原因争论十分激烈。一种观点认为，突变是通过适应而发生的，即各种抗性是由其环境(指其中所含的抵抗对象)诱发出来的，突变的原因和突变的性状间是相对应的，并认为这就是“定向变异”。另一种看法则认为，基因突变是自发的，且与环境是不相对应的。从1943年起，经过几个严密而巧妙的实验设计，终于解决了这场纷争。 1变量试验 又称波动试验或彷徨试验。1943年Luria和Delbruck根据统计学的原理，设计了如下实验

17、实验要点是：取敏感于噬菌体T1的大肠杆菌对数期肉汤培养物，用新鲜培养液稀释成浓度为103m1的细菌悬液，然后在甲、乙两试管内各装10m1。接着把甲管中的菌液先分装在50支小试管中(每管装0.2m1)，保温2436小时后，即把各支小管的菌液分别倒在50个预先涂有T1的平板上，经培养后分别计算各皿上所产生的抗噬菌体的菌落数；乙管中的10ml菌液不经分装先整管保温2436小时，然后才分成50份加到同样涂有Tl的平板上，经适当培养后，同样分别计算各皿上产生的抗性菌落数。 结果发现，来自甲管的50皿中，各皿间抗性菌落数相差极大，而来自乙管的则各皿数目基本相同。这就说明大肠杆菌抗噬菌体性状的突变，不是由所

18、抗的环境因素噬菌体诱导出来的，而是在它接触到噬菌体前，在某一次细胞分裂过程中随机地自发产生的。这一自发突变发生得越早，则抗性菌落出现得越多，反之则越少。噬菌体这里仅起着淘汰原始的未突变的敏感菌和甄别抗噬菌体突变型的作用。利用这一方法，还可计算出突变率。 2涂布试验 1949年，Newcombe设计了一种与变量试验相似，方法更为简便的证实同一观点的实验，这就是涂布试验。与变量试验不同，他用的是固体平板培养法。先在12只培养皿平板上各涂以数目相等(5×104)的敏感于噬菌体Tl的大肠杆菌细胞，经过5小时的培养，它们约繁殖了12.3代，于是在平板上长出大量的微菌落(这时每个菌落约含5100

19、个细菌)。取其中的6皿直接喷上Tl噬菌体，另6皿则先用灭菌玻棒把平板的微菌落重新均匀涂布一遍，然后同样喷上相应的T1。经培养过夜后，计算这两组培养皿板上所形成的抗噬菌体菌落数。结果发现，在涂布过的一组中。共长出抗性菌落353个，要比未经涂布过的(仅28个菌落)高得多。这也意味着该抗性突变发生在未接触噬菌体之前。噬菌体的加入只起甄别这类自发突变是否发生的作用，而根本不是诱导突变的因素。3平板影印培养试验 1952年Lederberg夫妇证明了微生物的抗药性是在未接触药物前自发地产生的，这一突变与相应的药物环境毫不相干。所谓平板影印培养法，实质是一种能达到在一系列培养皿的相同位置上出现相同遗传型菌

20、落的接种培养方法。其基本过程是：把长有许多菌落(可多达数百个)的母种培养皿倒置于包有灭菌丝绒布的木质圆柱上，使其上沾满来自培养皿平板上的菌落。然后可把这一“印章”的菌落一一接种到不同的选择性培养基平板上。待这些平板培养后，对各平板相同位置上菌落作对比后，就可选出适当的突变型菌株。五、基因突变的机制1诱变机制 自发突变的频率是很低的，一般为10-6-10-10，许多理化学、物理和生物因子能提高其突变的频率。凡能提高突变率的任何理化因子，都可称为诱变剂。所谓诱变剂并非是用诱变剂产生新的突变，而是通过不同的方式提高突变率。（1）碱基的置换 即一对碱基被另一对碱基所置换。置换可分为两个亚类：一类叫转换

21、，即DNA链中的个嘌呤被另一个嘌呤或一个嘧啶被另一个嘧啶所置换；另一类叫颠换，即个嘌呤被另一个嘧啶或一个嘧啶被另一个嘌呤所置换。对于一个具体诱变剂来说，既可同时引起转换与颠换，也可只具其中的一种功能。根据化学诱变剂是直接还是间接地引起置换，可把置换的机制分成直接和间接两种。直接引起置换的诱变剂：它们是一类可直接与核酸的碱基发生化学反应的诱变剂，不论在体内或是在离体条件下均有作用。主要有亚硝酸、羟胺和各种烷化剂。在这些诱变剂中除羟胺只引起G：C A：T外，其余都是可使G：C A：T发生互变的。能引起颠换的诱变剂很少，只是部分烷化剂才有。现以亚硝酸为例加以说明碱基转换的分子机制。亚硝酸可使碱基发生

22、氧化脱氨作用，故它能使A变为H，以及C变为U，从而发生转换。 转换过程的环节：腺嘌呤经氧化脱氨后变成烯醇式次黄嘌呤(He)；由He通过自发产生的互变异构效应而形成酮式次黄嘌呤(Hk)；DNA双链第一次复制，结果Hk因其在6位上含有酮基，故只能与6位上含有氨基的胞嘧啶(C)配对；DNA双链的第二次复制，这时其中的C按常规与G配对，因而最终实现了转换。间接引起置换的诱变剂：引起这类变异的诱变剂都是一些碱基类似物，如（5-BU、（5-AU）等。它们的作用是通过活细胞的代谢活动掺入到DNA分子中后而引起的，故是间接的。现以5-BU为例加以说明。5-BU是T的代谢类似物。当把某一微生物培养在含5-Bu的

23、培养液中时，细胞中有部分新合成的DNA的T就被5-Bu所取代。5-Bu一般以酮式状态存在于DNA中，因而仍可正常地与A配对，这时并未发生碱基对的转换。有时5-Bu会以烯醇式状态出在DNA中，于是当DNA进行复制时，在其相对位置上出现的就是G，而不是原来的A，因而引起了碱基对从原来的A：T变至G：C的转换。（2）移码突变 指诱变剂使DNA分子中的一个或少数几个核苷酸的增添（插入）或缺失，从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的一类突变。主要的诱变剂是：吖啶类染料（原黄素、吖啶橙等）以及一系列称ICR类的化合物（ Institute for Cancer Research）。其诱变机制还

24、不清楚，有人认为是由于它们是一种平面型三环分子，结构与一个嘌呤-嘧啶对十分相似，故能嵌入两个相邻DNA碱基对之间，造成螺旋的部分解开，从而在DNA复制过程中，会使链上增添或缺失一个碱基。结果引起了移码突变。（3）染色体畸变 某些理化因子，引起DNA的大损伤-染色体畸变，它即包括染色体结构上的缺失、重复、插入、易位和倒位，也包括染色体数目的变化。 缺失 是指染色体丢掉了某一区段。因而会失去某些基因，并直接影响到基因的排列顺序、基因间的相互关系。 重复 是指染色体上个别区段的增加。 倒位 是指正常染色体的某区段断裂后，断裂的片段倒转180度又重新连接愈合。易位是染色体上一区段断裂后再顺向或逆向地插

25、入到同一条染色体的其他部位上。对于染色体间畸变，则指非同源染色体间的易位。40年代美国遗传学家Barbara Meclintock首先在玉米中发现了染色体易位。他于1983年度获诺贝尔奖。广泛存在于原核和真核细胞中。研究发现这些DNA片断不但可在染色体上移动，而且还可从一个染色体跳到另一个染色体，从一个质粒到另一个质粒或染色体，甚至还可从一个细胞转移到另一个细胞。在这些DNA顺序的跳跃过程中，往往导致DNA链的断裂或重接，从而产生重组交换或某些基因启动和关闭，结果导致突变。现在把细胞中能改变自身位置的一段DNA序列称为转座因子。原核生物中的转座因子有三种类型：插入顺序（IS）、转座子（Tn）和

26、某些病毒（如Mu、D108）。 2自发突变机制 自发突变是指在没有人工参与下生物体自然发生的突变。但决不意味着这种突变是没有原因的，通过对诱变机制的研究，自发突变的可能机制有以下几种： (1)背景辐射和环境因素的诱变 不少“自发突变”实质上是由于一些原因不详的低剂量诱变因素的长期综合诱变效应。例如，充满宇宙空间的各种短波辐射或高温诱变效应，以及自然界中普遍存在的一些低浓度的诱变物质的作用等。 (2)微生物自身有害代谢产物的诱变效应 通过对环境诱变原的研究发现，通常存在细胞内的天然物质中也有表现诱变原性的物质。如微生物细胞内的咖啡碱、硫氰化合物、重氮丝氨酸、过氧化氢等。(3)互变异构效应 （4）

27、环出效应 六、DNA损伤的修复 嘧啶对紫外线的敏感性要比嘌呤强得多。嘧啶的光化产物主要是二聚体。其中了解较清楚的是胸腺嘧啶二聚体的形成和消除。 紫外线的主要作用是使同链DNA的相邻嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体。二聚体的出现会减弱双链间氢键的作用，并引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而有可能引起突变或死亡。在互补双链间形成嘧啶二聚体的机会较少。但一旦形成，就会妨碍双链的解开，因而影响DNA的复制和转录，并使细胞死亡。微生物能以多种方式去修复损伤后的DNA，主要有以下两种： (1)光复活作用 把经紫外线照射后的微生物立即暴露于可见光下时，可明显降低其死亡率的现象，称为光复活作用。

28、光复活由phr基因编码的光解酶PHr进行。PHr在黑暗是专一性地识别嘧啶二聚体，并与之结合，形成酶-DNA复合物，当给予光照时，酶利用光能（PHr本身无发色基团，与损伤的DNA结合后才能吸收光，起光解作用）将二聚体拆开，恢复原状，酶再释放出来。由于在一般的微生物中都存在着光复活作用，所以在进行紫外线诱变育种时，只能在红光下进行照射及处理照射后的菌液。(2)暗修复作用 又称切除修复。该修复系统除了碱基错误配对和单核苷酸插入不能修复外，几乎所有其他DNA损伤均可修复，是细胞内的主要修复系统，涉及到UvrA、UvrB、UvrC和UvrD四种蛋白质的联合作用。修复过程：UvrA以二聚体形式结合DNA，

29、并且吸引UvrB结合成为UvrA2B复合体，UvrA2B凭借其解旋酶活性和ATP提供的能量沿DNA巡视。在前进过程中遇到DNA损伤，解旋不能继续进行，而且UvrA2B结合损伤DNA的能力高于非损伤DNA的能力约千倍，所以能把UvrB定位在损伤位点。抵达损伤位点后，释放出单体UvrA。接着是UvrC和UvrB结合，由UvrB的内切核酸酶活性先在损伤位点3端3-5个核苷酸处切断，然后由UvrC的内切核酸酶活性在损伤位点5端7-8个核苷酸处切断。UvrD则把长约11-13个核苷酸、带有损伤位点的单链DNA片断和UvrBC释放出。最后由DNA聚合酶I和连接酶修复单链缺口。另外还有重组修复、SOS修复等

30、方式。第三节 突变与育种一、自发突变与育种 1从生产中选育 在日常的大生产过程中，微生物也会以一定频率发生自发突变。富于实际经验和善于细致观察的人们就可以及时抓住这类良机来选育优良的生产菌种。例如，从污染噬菌体的发酵液中有可能分离到抗噬菌体的自发突变株。2定向培育优良品种 是指在某一特定条件下，长期培养某一微生物菌群，通过不断转接传代以积累其自发突变，并最终获得优良菌株的过程。由于自发突变的频率较低，变异程度较轻微，故用此法育种十分缓慢。例如，当今世界上应用最广的预防结核病制剂卡介苗(BCG vaccine)的获得，便是定向育种的结果。这是法国科学家Calmette和CGuerin经历了l3年

31、时间，把牛型结核分支杆菌接在牛胆汁、甘油、马铃薯培养基上，连续转接了230代，才在1923年成功地获得了这种减毒的活菌苗-卡介苗。二、诱变育种 诱变育种是通过人工方法处理微生物，使之发生突变，并运用合理的筛选程序和方法，把适合人类需要的优良菌株选育出来的过程。人工诱变与自发突变相比可大大提高微生物的突变率，使人们可以简便、快速地筛选出各种类型的突变株，作生产和研究之用。（一）诱变育种的基本环节诱变育种的具体操作环节很多，且常因工作目的、育种对象和操作者的安排而有所差异，但其中最基本的环节却是相同的。 (二)一般性原则 1挑选优良的出发菌株出发菌株是指用于育种的起始菌株。有利性状：高产、生长速度

32、快、营养要求粗放、产孢子早而多的菌株等。 2选择简便有效的诱变剂在选用理化因子作诱变剂时，在同样效果下，应选用最方便的因素；而在同样方便的情况下，则应选择最高效的因素。在物理诱变剂中，尤以紫外线为最方便，而化学诱变剂中，以NTG最为有效。3处理单孢子（细胞）菌悬液 在诱变育种中，所处理的细胞必须是单孢子或单细胞悬液状态。其目的是：一方面分散状态的细胞可以均匀接触诱变剂；另一方面又可避免长出不纯菌落。在某些微生物中，即使用这种单细胞悬液来处理，还是很容易出现不纯菌落，这是由于在许多微生物的细胞内同时含有几个核的原故。 4选用最适剂量各种诱变剂有不同的剂量表示方式。剂量一般指强度与作用时间的乘积。

33、化学诱变剂常以一定温度下诱变剂的浓度和处理时间来表示。由于诱变剂是用来提高突变率、扩大产量变异的幅度和使产量变异向正突变的方向移动，因此，凡在提高诱变率的基础上，既能扩大变异幅度，又能促使变异移向正变范围的剂量，就是合适的剂量。5充分利用复合处理的协同效应6设计或采用高效筛选方案或方法筛选方案：在实际工作中，一般认为应采用把筛选过程分为初筛与复筛两个阶段的筛选方案为好。前者以量（选留菌株的数量）为主，后者以质（测定数据的精确度）为主。筛选方法：初筛可在平板上进行，也可在摇瓶中进行，两者各有利弊，复筛必须在摇瓶中进行，并作精确测定。 (三)营养缺陷型的筛选 1营养缺陷型营养缺陷型(auxotro

34、ph) 某一野生型菌株由于发生基因突变而丧失合成一种或几种生长因子的能力，因而无法在基本培养基上正常生长繁殖的变异类型。野生型（wild type）：从自然界分离到的任何微生物在其发生营养缺陷型突变前的原始菌株。原养型(prototroph)：一般指营养缺陷型突变株经回变或重组后产生的菌株，其营养要求在表型上与野生型相同。 基本培养基(MM) 能够满足野生型菌株生长最低限度需要的培养基。 补充培养基(SM) 凡能满足相应的营养缺陷型生长需要的培养基。在MM中加蛋白胨（多种氨基酸)便可以用来培养各种氨基酸的缺陷型；加入酵母浸膏(其中含有多种B族维生素和核苷酸)便可以培养不同的维生素、嘌呤和嘧啶缺

35、陷型。完全培养基(CM) 凡能满足一切营养缺陷型生长需要的培养基。2筛选过程 筛选营养缺陷型突变株一般经过诱变处理、淘汰野生型、检出营养缺陷型、营养缺陷型鉴定等步骤，最终筛选出营养缺陷型。 淘汰野生型 即浓缩缺陷型。中间培养后的细胞中除营养缺陷型菌株外，仍含有大量野生型菌株，为便于筛选，须将野生型细胞大量淘汰以浓缩营养缺陷型细胞，常用抗生素法和过滤法。前者的基本原理是野生型细胞能在基本培养基上生长繁殖，可选用某种抗生素将生长状态的细胞杀死，而留下不能生长的缺陷型细胞。过滤法是使能在基本培养基上生长形成菌丝体的野生型留在滤膜上，不能生长的营养缺陷型孢子则能透过滤膜。由此可见，缺陷型能否被浓缩，关

36、键是细胞在MM中能否生长。为了准确地表现性状，必须使细胞在浓缩前耗尽体内或体表的营养，故需用MM洗涤，然后再用MM加抗生素培养。 营养缺陷型的检出 浓缩后得到的营养缺陷型比例虽加大，但不是每株都是营养缺陷型，还需进一步分离，常用的方法有： 、 逐个检出法 把浓缩的菌液(细胞或孢子)在完全培养基上进行分离培养，然后将平板上出现的菌落逐个地点种到基本培养基和完全培养基上，经过一定时间培养后，凡是在基本培养基上不能生长，而在完全培养基上能生长的菌落，经重新复证后仍然如此，则这样的菌落便是营养缺陷型。 夹层检出法 在培养皿底层倒入一层基本培养基，待凝后，在其上倒入一层稀释菌液与基本培养基的混合物，凝后

37、再倒人一层基本培养基，培养后长出的菌落为野生型，其上再加上一层完全培养基，经过培养后新出现的菌落则多数是营养缺陷型。这种方法一般适用于细菌。 限量补充培养基检出法 将经过浓缩的菌液接种在含有微量(0.6或更少)蛋白陈的MM培养基上培养，野生型迅速生长成较大的菌落，而营养缺陷型生长较慢，故长成小菌落而得以检出。 影印法 将已灭菌的丝绒布，包在直径小于培养皿的小圆柱体上，这样便制成了一个印章，它可使菌落位置不变地从一个培养皿移至另一个培养皿。具体操作方法是：把印章放在已长出菌落的平皿(完全培养基)上轻轻压一下(注意不要沾上培养基)，然后轻轻地分别印在基本培养基和完全培养基上，培养后，在完全培养基上

38、生长，而在基本培养基上不生长的菌落便是营养缺陷型。因霉菌孢子容易飞散，故常引起误差。影印法是在细菌抗药性变异研究中发展起来的技术，目前已在放线菌、酵母菌等形成小菌落的微生物育种中广泛应用。 营养缺陷型鉴定 营养缺陷型的种类很多，选出后需要鉴定。常用生长谱法，即是在基本培养基中加入某种物质时，能生长的菌便是某种物质的缺陷型。其步骤是，首先鉴定需要那一类生长因子，可用天然产物的混合物检测，其次鉴定具体因子。 缺陷营养类别的确定 常用于确定营养缺陷型类别的天然混合物有：不含维生素的酪素水解物、氨基酸混合物或蛋白陈；水溶性维生素混合物；O.1碱水解酵母核酸液等。检测方法可用滤纸法。取0.5cm直径的滤

39、纸片沾取以上溶液，放在已接菌的平皿上培养，只要在此滤片周围能长出菌，即可说明此营养缺陷型的类别。 缺陷营养因子的确定 缺陷盼营养因子可能是一种，有时会是二、三种或更多。检测可用上述滤纸法，亦可用营养组分分组法，例如，在分析l 5种可能的营养因子时，可按表的组合配成5种溶液。将组合营养因子的纸片放置于MM培养基上，观察生长情况，便可根据表的营养因子缺陷示意表查出其营养缺陷因子，通过单一因子复证以确定。营养因子的组合及其缺陷示意表营养因子的组合营养因子缺陷示意溶液组合编号组合的营养因子生长组合营养因子缺陷生长组合营养因子缺陷A1 2 3 4 5A1AE5B2 6 7 8 9B6BC7C3 7 10

40、 11 12C10BD8D4 8 11 13 14DE1315BECD911E5 9 12 14 15ABAC23CEDE1214AD4第四节 基因重组凡把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子间的重新重组合，形成新遗传型个体的方式，称为基因重组。重组可使生物体在未发生突变的情况下，也能产生新遗传型的个体。基因重组是杂交育种的理论基础。由于杂交育种选用已知性状的供体菌和受体菌作为亲本。因此比诱变育种前进了一大步。同时也可消除某一菌株长期诱变导致产量上升缓慢现象。因此它是一种重要的育种手段。一、原核微生物的基因重组（一）转化(transformation) 转化是细菌中最早被发现的

41、遗传物质转移形式。l928年Griffith用肺炎链球菌对小鼠的感染实验以及10多年后Avery等体外转化过程的实现，转化因子DNA的证实，是现代生命科学发展的重要起点。 1几个概念 转化 受体菌直接吸收了来自供体菌的DNA片段，通过交换把它整合到自己的基因组中，从而获得了新的遗传特性的现象。 转化子（transformant） 受体细胞经复制分裂后出现了供体性状的子代。 感受态(competence) 细菌能够从周围环境中吸收DNA分子进行转化的生理状态。2转化的条件 包括受体菌与外源DNA的条件。受体菌 只有处于感受态的细菌才能吸收外源DNA实现转化。细菌的感受态是一种生理状态，它可以通过

42、感受态因子（细菌生长到一定阶段分泌一种小分子的蛋白质）在细胞间的转移而获得。这种感受态因子与细胞表面受体相互作用，诱导一些感受态-特异蛋白表达，其中一种是自溶素，它的表达使细胞表面的DNA结合蛋白及核酸酶裸露出来，使其具有与DNA结合的活性。现在可用人工的方法提高受体菌感受态的水平，通过以CaCl2、cAMP等处理，后者可使感受态水平提高10000倍。外源DNA 必须具备两个基本条件，即具有高相对分子质量和同源性：转化DNA的相对分子质量通常在1×107以下，约占细菌染色体组的0.3，否则活性丧失；多数研究中，基因转移使用的是双链线性DNA，某些单链、共价闭合环状DNA也可用于转化；

43、亲缘关系越近，DNA的纯度越高，则转化率越高。3转化过程主要通过3个步骤完成。感受态细胞的建立 可用人工方法提高受体菌的感受态水平，通常以CaCl2、cAMP等处理菌体，后者可使感受态水平提日l0 000倍。DNA的结合和摄取 首先是供体双链DNA与受体细胞壁上的接受位点相结合。此反应的最初是可逆的，但随着与细胞膜蛋白的进一步作用，其与细胞壁的结合则变得十分稳定而不可逆。随后其中一条链被细胞表面上的核酸酶降解，降解产生的能量协助把另一条链推进受体细胞。亦发现有完整的双链被摄取的情况，如革兰氏阴性菌嗜血杆菌。转化因子与染色体重组 当单链进入受体细胞后，便与双链结构的受体染色体DNA同源片段发生交

44、换重组。即与受体菌DNA整合，形成供体DNA-受体DNA复合物，再通过DNA复制和细胞分裂而表现出转化性状，形成转化子。能够发生转化的微生物有：肺炎链球菌、嗜血杆菌属、芽孢杆菌属、假单胞杆菌属、奈瑟氏球菌属、葡萄球菌属和根瘤菌属等20多种菌。转化性状也多样：如形态变化、荚膜物质、糖发酵、耐药性、抗原性、致病力、代谢产物、营养需要等的变化。一般转化率为0.1一1。 如果把噬菌体或其他病毒的DNA（或RNA）抽提出，用它去感染感受态的宿主细胞，并进而产生正常的噬菌体或病毒后代，这种特殊的转化称为转染。 (三)转导 (transduction)1952年Zinder和Lederberg在验证鼠伤寒沙

45、门氏菌是否也存在接合现象时发现了转导现象。通过完全缺陷或部分缺陷噬菌体为媒介，把供体细胞的DNA片段携带到受体细胞中，通过交换与整合，从而使后者获得前者部分遗传性状的现象，称为转导。获得新性状的受体细胞，称为转导子(transductant)。携带供体部分遗传物质(DNA片段)的噬菌体称为转导噬菌体。在噬菌体内仅含有供体菌DNA的称为完全缺陷噬茵体；在噬菌体内同时含有供体DNA和噬菌体DNA的称为部分缺陷噬菌体(部分噬菌体DNA被供体DNA所替换)。根据噬菌体和转导DNA产生途径的不同，可将转导分为普遍性转导和局限性转导。 1普遍性转导(general transduction) 通过完全缺陷

46、噬菌体对供体菌任何DNA小片断的“误包”，而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象，称为普遍性转导。 普遍性转导的机制“包裹选择模型”，当噬菌体侵染敏感细菌并在细菌内大量复制增殖时，亦把寄主DNA降解为许多小的片段，在装配时，少数噬菌体(10-6一10-8)错误地包装了宿主的DNA片段并能形成“噬菌体”，这种噬菌体称普遍性转导噬菌体(为完全缺陷噬菌体)。随着细菌的裂解，转导噬菌体也被大量释放。当这些转导噬菌体再次侵染受体菌时，其中的供体DNA片段被注入受体菌。如果该DNA片段能与受体菌DNA同源区段配对，通过遗传物质的双交换而进行基因重组并形成稳定的转导子，称完全普遍性转导。如鼠伤寒沙门氏菌的P

47、22噬菌体、大肠杆菌的P1噬菌体和枯草芽孢杆菌的PBS1和SP10等噬菌体中都能进行完全转导。如果该DNA片断不能与受体菌DNA进行交换、整合和复制，只以游离和稳定的状态存在，而仅进行转录、转译和性状表达，称流产转异。发生流产转导的细胞在其进行分裂后，只能将这段外源DNA分配给一个子细胞，而另一子细胞仅获得供体基因转录、转译而形成的少量产物-酶，因此在表型上仍可出现轻微的供体菌特征，每经分裂一次，就受到一次“稀释”。所以能在选择培养基上形成微小菌落就成了流成转导子的特点。 2局限性转导(specialized transduction) 通过部分缺陷噬的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受

48、体菌中，并获得表达的转导现象）。转导后获得了供体部分遗传特性的重组受体细胞称为局限转导子。 (1)局限性转导的机制“杂种形成模型” 噬菌体的线状双链DNA分子的两端为12个核苷酸单链（粘性未端cos位点），在溶源状态下，以前噬菌体状态存在于细胞染色体上。被诱导后，在裂解细菌时，其以粘性末端形成的环状分子通过滚环复制形成一个含多个基因组的DNA多联体，以2个cos位点之间的距离决定其包装片段的大小而进行切割、包装，最终形成转导噬菌体。在极少数情况下(约10-5)，在前噬菌体两端邻近位点上与细菌染色体发生错误的切割，使其重新形成的环状DNA中，同时失去前噬菌体的一部分DNA和增加了一段相应长度的细

49、菌宿主染色体DNA，这样形成的杂合DNA可正常被包装、复制。形成的新转导噬菌体称为部分缺陷噬体。因为前噬菌体位点两端是细菌染色体的gal+(发酵半乳糖基因)和bio+(利用生物素基因)，故形成的转导噬菌体通常带有gal+或bi0+基因，故这些部分缺陷噬菌体表示为dga1(缺陷型半乳糖转导噬菌体)或dbio(缺陷性生物素转导噬菌体)。这些转导噬菌体可重新侵入受体菌，侵入后，噬菌体DNA与受体菌的DNA同源区段配对，通过双交换而整合到受体菌的染色体组上，使受体菌获得了供体的这部分遗传特性。 （2）局限性转导中的低频转导与高频转导 低频转导(LFT)：由于宿主染色体上进行不正常切离的频率极低，因而在

50、裂解物中所含的部分缺陷噬菌体的比例是极低（10-4-10-6）的，这种裂解物称为LFT裂解物。LFT裂解物在低情况下感染宿主，就可获得极少量的转导子。高频转导 (HFT)：形成转导子的频率很高，理论上可达50，故称之为高频转导。其原因是因为供体菌为双重溶源菌，它同时有两种噬菌体整合在细菌的染色体上。例如，大肠杆菌K12株，其双重溶源菌为E.coli K12(/dg),即其前噬体体有和dg为缺陷噬菌体，带有供体gal+基因，但丢失了部分噬菌体本身的DNA；而噬菌体为正常噬菌体，不带gal基因，但起辅助作用，称为辅助噬菌体，可弥补dg的不足，使dg也能成为“完整噬菌体”而释放。这样，一个细菌便可同

51、时等量地释放出dg和两种噬菌体，这时的裂解物称为HFT裂解物，当用低的HFT裂解物去感染另一个E.coligal-受体菌，是可高频率的把它转化为能发酵乳糖的E.coligal+转导子。这种方式称为高频转导。 当温和噬菌体感染其宿主而使之发生溶源化时，因噬菌体的基因整合到宿主的基因组，而使后者获得了除免疫以外的新性的现象，称为溶源转变。比较项目普通性转导局限性转导转导的发生自然发生人工诱导噬菌体形成错误的装配前噬菌体反常切除形成机制包裹选择模型杂种形成模型内含DNA只含宿主染色体DNA同时有噬菌体DNA和宿主DNA转导性状供体的任何性状多为前噬菌体邻近两端的DNA片断转导过程通过双交换使转导DN

52、A替换了受体DNA同源区转导DNA插入，使受体菌为部分二倍体转导子不能使受体菌溶源化转导特性稳定为缺陷溶源菌转导特性不稳定 (三)接合(conjugation) 指供体菌和受体菌完整细胞间的直接接触，而实现大段的DNA传递现象。Iederberg和Tatum于1946年设计了一个有名的实验，才证明了原核生物的接合现象。他们筛选出了两种不同营养缺陷型的大肠杆菌K12突变株，其中A菌株是met-、bio-，B菌株是thr-、Leu-，将它们在完全培养基上混合培养后，再涂布于基本培养基上。结果发现，在基本培养基上出现了met+、bi0+、thr+、1eu+的原养型菌落(约为10-7)，而分别涂布的两

53、种亲本菌株对照组都不出现任何菌落。进一步的实验证实，上述遗传重组的形成，是两个亲本细胞接合以后发生基因重组的结果。在细菌中，接合现象发研究最清楚的是E.coli，研究发现E.coli是有性别分化的，决定性别的是一种质粒，即F因子。现在根据E.coli细胞中是否存在F因子以及在细胞中的存在方式不同，可把大肠杆菌分成以下四种类型。F+菌株 F因子以游离状态存在，可独立于染色体进行自主复制。一般有1-4个，且细胞表面有相当数量的性菌毛。F-菌株 不含F因子，无相当数量的性菌毛。 Hfr菌株 F因子整合在宿主染色体的一定部位，并与宿主染色体同步复制。发现Hfr与F-菌重组的频率要比F+菌与F-菌重组的

54、频率高得多。 F菌株 因为F因子整合到染色体上是一种可逆过程，当F因子从Hfr菌染色体上脱落时，会出现一定概率的错误基因交换，从而使F因子带上宿主染色体的遗传因子，这时的F因子称为F因子。 几种接合的结果 F+×F- 接合 通过F+菌产生的性菌毛把两者连接在一起，并在细胞间形成胞质桥(或称接管)，F因子通过胞质桥进入受体细胞，使重组体从F-变成了F+菌。其主要过程是，F因子的一条DNA单链断裂(在特定位点上)、解链，并单向转移进入受体细胞，在此作为模板而形成新的F因子；另一条在供体细胞内的DNA链也成为模板并以滚环模型形式复制；最终供体菌及受体菌均成为F+菌。Hfr×F-接

55、合 当Hfr与F-菌株发生接合时，Hfr的染色体双链中的一条单链在F因子处发生断裂，由环状变为线状，F因子则位于线状单链DNA之末端。整段线状染色体也以5-末端引导，等速转移至F-细胞。在没有外界因素干扰的情况下，这一转移过程的全部完成约需100分钟。实际上由在转移过程中，使接合中断的因子很多，因此这么长的线状单链DNA常常在转移过程中发生断裂。所以处在Ffr染色体前端的基因，进入F-的几率就越高，这类性状出现在接合子中的就越早。由于F因子位于线状DNA的末端，进入F-细胞的机会最少，故引起F-变成F+的可能性也最小。因此Hfr与F-接合的结果其重组频率虽最高，但转性频率却最低。 F与F-接合

56、 通过F与F-的接合就可以使后者变成F。它既可使后者前者的F因子，同时双获得前者的部分遗传性状。（四）原生质体融合（protoplast fusion） 通过人为的方法，使遗传性状不同的两细胞的原生质体发生融合，并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的、遗传性稳定的融合子（fusant）的过程.能进行原生质体融合的细胞是极其广泛的，不仅包括原核生物，而且还包括各种真核细胞。原生质体融合的优越性在于：1它打破了微生物的种属界限，可以实现远缘菌株的基因重组。1981年Yamada有PEG诱导酵母原生质体与细菌细胞成功的融合，并使其固氮作用或光合作用实现了不稳定的表达。2原生质融合可使遗传物质传递更为完整、获得更多基因重组体的机会，有利于提高育种速度。此外原生质体融合技术还可用于研究细胞质遗传、核质关系等问题，因此原生质体融合技术在生产实践及理论研究上均有具有重要意义。原生质体