生物化学笔记(王镜岩)

1、讲一生物大分子：糖、脂、蛋白质（酶）、核酸、维生素、激素生物化学之父：费舍尔讲二地球上数量最多的一类有机化合物：糖类核糖赤藓糖甘油醛半乳糖(Gal)（Gal）二羟基丙酮葡萄糖甘露糖核酮糖果糖和吡喃葡萄糖（羟基在下为型，在上为型）糖原高度分支的生理意义：第三章、蛋白质20种氨基酸 英文名等电点掌握氨基酸的用途、现象DNFB法PITCCys半胱氨酸 Ellman反应，DTNB，二硫硝基苯甲酸Ellman反应（二硫硝基苯甲酸，DTNB） Cys与二硫硝基苯甲酸 (DTNB) 或称 Ellman 试剂发生硫醇-二硫化物交换反应。 反应中 1 分子的Cys引起1分子的硫硝基苯甲酸的释放。它在 pH 8.

2、0 时, 在 412nm 波长处有强烈的光吸收, 因此可利用分光光度法定量测定-SH。肽平面（酰胺平面） 由肽键周围的6个原子组成的刚性平面3.6蛋白质的纯化注：用尽可能少的步骤、尽可能短的时间。1. 前处理阶段物理法冻融法，超声波法，均浆法，研磨法等。酶裂解法就是利用水解酶将细胞壁和细胞膜消化的方法，常用的水解酶有溶菌酶、葡聚糖酶、蛋白酶、糖苷酶、壳多糖酶、细胞壁溶解酶等。其中溶菌酶主要对细菌类有作用，其他酶对酵母作用显著。2. 粗分级/粗分离根据蛋白质的溶解性质、大小不同、带电状态不同/电荷多少净化方法根据与其他化合物相互作用的蛋白质（部分蛋白质对.有特定的.）：凝胶过滤层析常用凝胶过滤介

3、质Sephadex：交联葡聚糖，是采用环氧氯丙烷作交联剂将右旋葡聚糖交联而成。干粉容易膨胀，在水、盐溶液、有机溶液、碱和弱酸中化学性质稳定，可高压灭菌。高交联度的Sephadex，其颗粒坚硬，适于高流速下操作。Sephacryl : 烯丙基葡聚糖同N、N甲叉双丙烯酰胺共价交联而成。颗粒坚硬，性质比Sephadex更为稳定，可高压灭菌，在pH311条件下稳定，可用有机溶剂洗脱，也可用SDS、尿素及盐酸胍洗脱。Sepharose：琼脂糖凝胶，是将琼脂糖溶液冷却，多糖链形成双螺旋，凝集成束，自发的形成稳定的珠状颗粒。琼脂糖由氢键维系，在pH49条件下稳定，超过40熔化，冷冻出现珠状。 可分为Seph

4、arose 2B、4B、6B（即含琼脂2%、4%、6%）。 Sepharose CL 又称交联琼脂糖，是Sepharose 同 2，3-二溴丙醇在强碱下交联而成。在pH311条件下稳定。 Sepharose Fast Flow 是经过高度交联的琼脂糖珠体，大大增加了其机械强度，以流速快为特征。由于流速快，所以工业规模使用。有极高的物理化学稳定性，可用多种有机溶剂清洗，还可用1-2mol/L的NaOH进行“原位清洗”。 一些注意事项1) 为了提高分辨率，柱高应为柱直径的2040倍；2) 上样量应小于柱床体积的5%，最大不应超过柱床体积的10%，上样的蛋白质样品浓度以不超过4%为宜，浑浊样品需离心

5、后上样。3) 洗脱时，流速要恒定。缓冲液的pH值、离子强度等必须都有利于蛋白质稳定；中等离子强度的缓冲液有助于消除蛋白质与凝胶可能产生的相互作用；4) Sephadex在使用前需要溶胀，一份凝胶加10份水；在摇床上或手动混合，避免使用电力搅拌器；待凝胶颗粒沉降后，去除上清，重复几次，直到液相不再混浊为止；自然溶胀需24h或几天，加热可促进溶胀，12h即可完成；：离子交换层析离子交换层析类型 强酸型：磺乙基、磺丙基阳离子交换树脂 中酸型：磷酸基 弱酸型：羧甲基 强碱型：三乙基氨基乙基、阴离子交换树脂 二乙基（2羟丙基）氨基乙基 中强碱型：二乙基氨基乙基 弱碱型：氨基乙基、对氨基苯甲基蛋白质纯化常

6、用的离子交换剂蛋白质纯化常用亲水性离子交换剂。因为亲水性离子交换剂对生物大分子物质的吸附和洗脱均较温和，被分离纯化的物质不易被破坏。 纤维素类：纤维素离子交换剂是最早用于生物大分子分离的介质，它具有松散的亲水网络，大孔隙、表面积大等优点。但因以无定型为主，故很难用于层析柱操作。DEAE-Sephacel 是经特殊交联处理制成的珠状离子交换纤维素。葡聚糖系离子交换介质：主要以Sephadex系的产品为主，它是在Sephadex G25及G50两种凝胶过滤介质上引入功能基后，产生的多种离子交换介质。该类介质容量大，价格较低，但由于流速、体积受外界影响较大，逐渐被新一代的BioProcess凝胶所代

7、替。琼脂糖系（agarose)：琼脂糖凝胶介质上引入功能基得到的多种离子交换剂。其中，新一代BioProcess系列凝胶，具有流速高，载量大，理化稳定性好，可就地清洗，并可反复使用，是目前使用最多的离子交换介质。3. 细分离3.7 Amino Acid Composition of Proteins氨基酸组成的蛋白质 朗伯比尔（Lambert-Beer）定律 在特定波长下，溶液中物质的光吸收与其浓度C（以mmol-1为单位）和溶液中光径长l（以cm为单位）成正比。 A=Cl 紫外吸收: Trp, =280nm; Tyr, =275nm; Phe, =257nm;3.8测蛋白质的C末端§

8、;1.切割位点（四种酶的酶切位点）羧肽酶:(1)羧肽酶劈开所有除了P,R、K(可以不做第二AA Pro);(2)羧肽酶B劈开只有R和K(可以不做第二AA Pro);(3)羧肽酶C劈开C末端AA,只有第二个AA是专业;(4)羧肽酶Y劈开;【 Carboxypeptidase： (1)Carboxypeptidase A cleaves all except for P, R, K (It can not done if second AA is Pro); (2)Carboxypeptidase B cleaves only R and K (It can not done if second

9、AA is Pro); (3)Carboxypeptidase C cleaves the C terminal AA that only second AA is Pro; (4)Carboxypeptidase Y cleaves all;】§3. Cleave each chain into smaller fragments by site- specific proteases or chemicals（1）胰蛋白酶（胰酶）Chymotrypsin： C-terminal of Phe, Trp, Tyr.糜蛋白酶：C末端 Phe Trp Tyr（2） 化学试剂CNBR：切

10、割C端的甲硫氨酸第4章 、蛋白质的空间结构4.1蛋白质的构象二面角4.7肌红蛋白的结构和功能4.8血红蛋白肌红蛋白和血红蛋白属于同源蛋白质。（序列、功能相似相同）肌红蛋白Mb血红蛋白Hb4.10 Measurement of protein（蛋白质含量的测定）1 凯氏定氮法（Kjeldahl） 蛋白质含量6.25×蛋白N含量消化：蛋白质 + H2SO4 强热和CuSO4 （NH4）2SO4 + SO2+ CO2+ H2O 蒸馏：（NH4）2SO4 + 2NaOH Na2SO4 + 2 H2O + 2NH3 2NH3 + 4H3BO3（NH4）2B4O7 + 5H2O滴定：（NH4）2

11、B4O7 + 2HCl + 5H2O2NH4Cl + 4 H3BO3 2 双缩脲法（biuret） （相对灵敏度不高）540nm3 Follin酚法（Lowry） Folin-酚试剂由试剂A和试剂B两部分组成。蛋白质中的肽键首先在碱性条件下与酒石酸钾钠-铜盐溶液（试剂A）起作用生成紫色络合物（类似双缩脲反应）。由于蛋白质中酪氨酸、色氨酸的存在，该络合物在碱性条件下进而与试剂B（磷钼酸和磷钨酸、硫酸、溴等组成）形成蓝色复合物，其呈色反应颜色深浅与蛋白质含量成正比（660nm）。可测定蛋白质含量的范围：25250g/mL。干扰因素：溶液或样品中含有带“-CO-NH2”、“-CH2-NH2” 、“-

12、CS-NH2”基团的化合物，Tris、核酸、蔗糖、硫酸铵、巯基及酚类等化合物时。4 染料结合法（Bradford） Coomassie Brilliant Blue G-250(考马斯亮蓝g - 250)5 BCA法(bicinchonininc acid)6 紫外吸收法 （最大光吸收280nm）核酸干扰较大。纯蛋白质：OD280/OD260 > 1.75，纯核酸：OD280/OD260 < 0.5。OD280=cL，需已知；蛋白质浓度（mg/mL）=OD280×F；用OD280/ OD260查表知F因子蛋白质浓度（mg/mL）=1.45×OD2800.74&#

13、215;OD260；第5章 、酶1、 酶通论不是所有的酶都是蛋白质，一些RNA分子（核酶）也是酶。酶：全酶（holoenzyme）：脱辅酶与辅因子结合后所形成的复合物称为全酶。即全酶=脱辅酶+辅因子酶的分类：1. 氧化还原酶2. 转移酶3. 水解酶4. 裂合酶5. 异构酶6. 连接酶酶的命名：1. 习惯命名法1 根据酶作用的底物命名，如淀粉酶、蛋白酶，有时还加上来源以区分不停来源的同一类酶，如胃蛋白酶、胰蛋白酶2 根据酶催化反应的性质及类型命名，如水解酶、转移酶、氧化酶等。有的酶结合上述两个原则命名，如琥珀酸脱氢酶是催化琥珀酸脱氢反应的酶。2. 国际系统命名法以酶所催化的整体反应为基础，规定每

14、种酶的名称应当明确标明酶的底物及催化反应的性质。如果一种酶催化两个底物起反应，应在他们的系统名称中包括两种底物的名称，并以“：”将他们隔开。若底物之一是水时，可将水略去不写。酶作为生物催化剂的特点1. 酶易失活2. 酶具有很高的催化效率3. 酶具有高度专一性4. 酶活性收到调节和控制许多酶需要帮助催化的非蛋白辅助因子1. 辅因子包括金属离子及有机化合物。2. 一些辅助因子结合酶蛋白紧密(非共价或共价),他们因此被称为辅基（prosthetic groups）。3. 只有脱辅酶和它的辅因子的同时存在才起作用(称为全酶)。4. 辅酶在酶催化中通常是起着电子、原子或某些化学基团的传递作用。（Coen

15、zymes usually function as transient carriers of specific function groups.）5. 维生素通常作为辅酶的前体。热力学define反应速率和平衡酶影响反应速率，不影响平衡结合能导致特异性和催化反应Binding energy can be used to overcome these barriers:1) Entropy, the relative motion of two molecules in solution;(entropy reduction )2) The solvated shell of hydrogen

16、-bonded water that surrounds and helps to stabilize most biomolecules in aqueous solution;(desolvation)3) The electronic or structural distortion of substrates that must occur in many reactions; (Electron redistribution) 4) The need to achieve proper alignment of appropriate catalytic functional gro

17、ups on the enzyme. (Induced enzyme conformation change) 1) 降低熵值，使分子间作用时更稳定。2) 去溶剂化，使底物暴露在无水且相对稳定的环境。3) 电子在酶的催化下结构更容易变形，易进行再分配。4) 催化剂诱导酶产生形变，重排。2、 酶动力学米氏方程及其推导和应用(推导P357)米氏方程：S：底物浓度Vmax：酶完全被底物饱和时的最大反应速率Km：米氏常数 （）根据米氏方程式可以说明以下关系：1) 当S<<Km时，反应速率与底物浓度称正比，v与S的关系符合一级动力学。这时由于底物浓度低，酶没有全部被底物所饱和，因此在底物浓度

18、低的条件下是不能正确测得酶活力的。2) 当S>>Km时，反应速率已达到最大速率，这时酶全部被底物所饱和，v与S无关，符合零级动力学，只有在此条件下才能正确测得酶活力。3) 当S=Km时，反应速率为最大速率的一半。因此Km值就代表反应速率达到最大反应速率一半时的底物浓度，单位是mol/L。LineweaverBurk双例数作图法将米氏方程式两侧取倒数，得到下面方程式:以作图，得出一直线。横轴截距为，纵轴截距为。该作图缺点是：实验点过分集中在直线的左下方，而低浓度S的实验点又因倒数后误差较大，往往偏离直线较远，从而影响Km和Vmax的准确测定。稳态：指反应进行一段时间后，系统的复合物E

19、S浓度，由零逐渐增加到一定数值，在一定时间内，尽管底物浓度和产物浓度不断地变化，复合物ES也在不断地生成和分解，但是当反应系统中ES的生成速率和ES的分解速率相等时，络合物ES浓度保持不变的这种反应状态称为稳态，即酶的抑制作用通常所谓抑制率是指抑制分数或抑制百分数。抑制作用的类型根据抑制剂与酶的作用方式及抑制作用是否可逆，可把抑制作用分为两大类1. 不可逆的抑制作用抑制剂与酶的必需基团以共价键结合而引起酶活力丧失，不能用透析、超滤等物理方法除去抑制剂而使酶复活，称为不可逆抑制。由于被抑制的酶分子受到不同程度的化学修饰，故不可逆抑制也就是酶的修饰抑制。2. 可逆的抑制作用抑制剂与酶以非共价键结合

20、而引起酶活力降低或丧失，能用物理方法抑制剂而使酶复活，这种抑制作用是可逆的，称为可逆抑制。根据可逆抑制剂与底物的关系，可逆抑制作用分为三种类型（P368-369）1) 竞争性抑制2) 非竞争性抑制3) 反竞争性抑制酶的抑制剂竞争型抑制、非竞争型抑制、混合型抑制酶的不可逆抑制剂底物类似物、自杀抑制剂三酶的作用机制和酶的调节酶的活性部位(P384)少数参与底物结合及催化作用的特异的氨基酸残基比较集中的区域，即与酶活力直接相关的区域称为酶的活性部位或活性中心。活性部位通常又被分为结合部位和催化部位，前者负责与底物的结合，决定酶的专一性；后者负责催化底物键的断裂形成新键，决定酶的催化能力。酶的活性部位

21、并不是和底物的形状正好互补的，而是在酶和底物结合的过程中，底物分子和酶分子，有时是两者的构象同时发生了一定的变化后才互补的，这时催化基团的位置也正好在所催化底物键断裂和即将生成键的适当位置。这个动态的辨认过程称为诱导契合。酶的活性部位的特点（ppt）(催化活性特点6个)P3841 酶的活性部位是一个三维实体。2 活性部位位于酶分子表面的一个裂缝内，裂缝内是相当疏水的区域。3 活性部位在酶分子的总体中只占相当小的部分。4 底物通过多种弱的作用力结合到酶上。（氢键、盐键、范德华力、疏水相互作用）酶的活性部位与酶蛋白的空间构象的完整性之间，是辩证统一的关系。Specific catalytic gr

22、oups contribute to catalysis （特定催化组有助于催化t93）金属离子催化（P393）1 通过静电稳定或屏蔽负电荷。（通过电荷的屏蔽促进反应）2 和质子的作用相似（和酸的催化作用相似），但有些金属离子不止带一个正电荷，作用比质子要强，并且可以在中性pH溶液中维持一定浓度。3 通过水的离子化促进亲核催化。4 通过结合底物为反应定向。5 通过可逆地改变金属离子的氧化态调节氧化还原反应。酶活性的调节控制1. 别构调控（allosteric regulation)酶分子的非催化部位与某些化合物可逆地非共价结合后发生构象的改变，进而改变酶活性状态，称为酶的别构调节（allost

23、eric regulation)。2. 可逆的共价修饰调控（Covalent modifications (reversible)）3. 通过专一性的蛋白水解作用来活化酶和蛋白质（酶原的激活)（Proteolytic cleavage (irreversible)）4. (基因调控:改变特定的酶的数量。）比活力第六章、代谢代谢总论和生物学能新陈代谢是生命最基本的特征之一，泛指生物与周围环境进行物质交换、能量交换和信息交换的过程。包括合成代谢（属同化作用）、分解代谢（属异化作用）新陈代谢：营养物质在生物体内所经历的一切化学变化总称为新陈代谢。氧化作用所放出的能量与氧化途径无关，只要最后产物相同，

24、释放出的总能量就相同。最重要的两类调控反应：反馈抑制、前馈激活细胞中的主要代谢途径：ATP是能量代谢的中心物质辅酶的作用参与电子的传递、基团的转移等，决定了酶所催化反应的性质。 维生素B3是NAD和NADPQ的组成成分 辅酶I： NAD+/NADH，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（氧化/还原）辅酶II：NADP+/NADPH，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（氧化/还原）。 泛酸：维生素B5是CoA的组成成分，CoA是生物体内转酰基酶的辅酶。新陈代谢的功能概括为5个方面：1) 从周围环境中获得营养物质。2) 将外界引入的营养物质转变为自身需要的结构元件，即大分子的组成前体。3) 将结构元件装配成自身的大分子4)

25、 合成或降解执行生物体特殊功能所需的生物分子。5) 提供生命活动所需的一切能量。 热学第一定律 能量守恒定律：热力学第一定律是对能量守恒和转换定律的一种表述方式。热力学第一定律指出，热能可以从一个物体传递给另一个物体，也可以与机械能或其他能量相互转换，在传递和转换过程中，能量的总值不变。热学第二定律热的传导只能由高温物体传至低温物体。热的自发地逆向传导是不可能的。这表明：热力学体系的运动有一定的方向性，即自高温流向低温。自由能（free energy）物理意义：* (体系中能对环境作功的能量) 自由能的变化能预示某一过程能否自发进行，即： G<0，反应能自发进行 G>0，反应不能自

26、发进行 G=0，反应处于平衡状态。标准条件：反应的温度为25，大气压为101,325 Pa（1atm），反应物和产物的浓度都是1mol/L。偶联化学反应标准自由能变化的可加性及其意义该规则表明一个在热力学上不利的反应，可以与热力学有利的反应偶联进行，即可以被热力学有利的反应所驱动而进行。这在生物化学反应中是很多的。高能磷酸化合物机体内有许多含磷酸的化合物，当其磷酰基水解时，释放出大量的自由能，这类含磷酸的化合物称为高能磷酸化合物。当这些磷酰基水解时，能释放出20.92kj/mol（5 kcal/mol）以上的能量，因此将这些磷酸基团与其它基团之间的键称为“高能键”（high-energy bo

27、nd），并用符号 表示。 磷酸肌酸当细胞处于静息状态时，ATP的浓度较高，反应向合成磷酸肌酸的方向进行。当细胞处于活动状态时，ATP的浓度下降，反应即转向合成ATP的方向进行，因此磷酸肌酸有“ATP缓冲剂”之称。本章小结1.新陈代谢是生命最基本的特征之一，泛指生物与周围环境进行物质交换、能量交换和信息交换的过程，包括合成代谢和分解代谢。2.新陈代谢的共同特点：由酶催化，反应条件温和；诸多反应有严格的顺序，彼此协调；具有中间代谢。3.辅酶和辅酶,FMN和FAD和辅酶A在能量代谢中的作用.4.热力学第一定律：能量守恒定律 DU=Q-W5.热力学第二定律：热的传导只能由高温物体传至低温物体。热的自发

28、地逆向传导是不可能的。这表明：热力学体系的运动有一定的方向性，即自高温流向低温。6.标准自由能变化中涉及的计算问题。 7.偶联化学反应标准自由能变化的可加性及其意义：在互相联系或称为偶联的化学反应中，这些相互联系的化学反应的总的自由能变化等于各步反应自由能变化的总和。当其中一个反应的自由能变化为正值时，只要总反应的自由能变化为负值，这个反应也是能够进行的。8.高能磷酸化合物的概念和种类。9. ATP的特点和作用： ATP中酸酐键不稳定容易水解，从而释放大量能量，是能量的中间传递体。多糖和寡聚糖只有分解成小分子后才能被吸收利用，称为糖化。 淀粉的磷酸解 以磷酸代替水使淀粉分解形成1-磷酸葡萄糖的

29、过程称淀粉的磷酸解，它是细胞内多糖的主要降解方式。葡萄糖的主要代谢途径糖酵解（Glycolysis)糖酵解是将葡萄糖降解为丙酮酸并伴随着ATP生成的一系列反应，是生物体内普遍存在的葡萄糖降解的途径。该途径也称作Embden-Meyethof途径，以纪念Embden和Mayerholf 。糖酵解是葡萄糖通过一系列的生化反应，逐步氧化成小分子化合物，并释放出能量合成ATP的过程。糖酵解途径从葡萄糖开始，到生成2分子丙酮酸为止，在途径的前期消耗2分子ATP，后期合成4分子ATP，所以途径运行的结果，1分子葡萄糖可以产生2分子ATP。 把糖酵解途径加上丙酮酸转变成乙醇或乳酸称为无氧呼吸。把糖酵解途径、

30、柠檬酸循环加上呼吸电子传递链合称为有氧呼吸途径。由葡萄糖经历丙酮酸最后生成乳酸，称为酵解过程。由葡萄糖经历丙酮酸最后生成乙醇，称为发酵过程糖酵解途径中磷酸化中间产物的意义带有负电荷的磷酸基团使中间产物具有极性，从而使这些产物不易透过脂膜而失散；磷酸基团在各反应步骤中，对酶来说，起到信号基团的作用，有利于与酶结合而被催化；磷酸基团经酵解作用后，最终形成ATP的末端磷酸基团，因此具有保存能量的作用。 激酶：能够在ATP和任何一种底物之间起催化作用，转移磷酸基团的一类酶。X-晶体衍射研究表明，在己糖激酶催化反应时有构象变化，其变化大致是，酶与葡萄糖结合时，结合裂缝两侧的酶叶关紧，糖被酶蛋白环绕造成非

31、极性环境，从而促使ATP的磷酰基转移，防止水作为底物攻击ATP。这种底物诱导的裂缝关闭现象是激酶的共同特性。肝脏中存在一种专一性强的葡萄糖激酶，对于维持血糖的恒定起作用。酵解第一阶段的反应葡萄糖的磷酸化酵解过程中的第一个调节酶：己糖激酶（是别构酶）（第一步反应在肝脏中）己糖激酶以六碳糖为底物，其专一性不强，不仅可以作用于葡萄糖，还可以作用于D-果糖和D-甘露糖。葡萄糖激酶：存在于肝细胞中。它对D-葡萄糖有特异活性。葡萄糖6磷酸的异构化这个同分异构化反应由（磷酸）葡萄糖异构酶催化。葡萄糖C1上的羰基，不像C6上羟基那样容易磷酸化，将羰基从C1转移到C2，是葡萄糖分子由醛式变为酮式，C1形成了自由

32、羟基,更容易在下一个反应中磷酸化。由于此反应标准自由能变化很小，反应是可逆的。反应方向由底物和产物的量来控制。磷酸葡萄糖异构酶有绝对的专一性和立体专一性，6-磷酸葡糖酸等都是它的抑制剂。果糖6磷酸的磷酸化糖降解过程中的第二个磷酸化反应。磷酸果糖激酶-1（PFK-1）重要的调控关键酶糖酵解过程的第二个调节酶也是酵解中的限速酶这一步反应是酵解中的关键反应步骤，反应是放能的，在体内是不可逆的。磷酸果糖激酶是酵解限速酶。磷酸果糖激酶是一个别构酶，ATP，柠檬酸，脂肪酸对此酶有抑制效应。AMP，ADP或无机磷可消除抑制，增加酶的活性。磷酸果糖激酶是一种变构酶，受很多因素的控制：如：肝中的磷酸果糖激酶受高

33、浓度ATP的抑制，ATP可降低该酶对F-6-P的亲和力，是由于ATP结合到酶的一个特殊的调控部位上，调节部位不同于催化部位。抑制作用可被AMP解除，因此ATP/AMP的比例对该酶有明显的调节作用；H+浓度对酶活性的影响，当pH下降时， H+对该酶有抑制作用，在生物体内有重要的生物学意义，因为通过它阻止整个酵解途径的继续进行，从而防止乳酸的急剧形成；这又可以防止血液pH的下降，有利于避免酸中毒。磷酸果糖激酶有三种同工酶：同工酶A存在于心肌和骨骼中，同工酶B存在于肝和红细胞中，同工酶C存在于脑中。植物在这一步利用的是Pi，不是ATP。第四步反应醛缩酶凡是连接两个羰基化合物，例如一个醛和一个酮化合物

34、形成一个醛醇化合物就是醛缩反应。第五步反应磷酸三碳糖中只有3-磷酸甘油醛能继续进入酵解途径。磷酸二羟丙酮可在磷酸丙糖异构酶的催化下迅速转化成3-磷酸甘油醛。酵解第二阶段的反应第六步反应糖酵解中唯一的脱氢反应第七步底物水平磷酸化是指物质在生物氧化过程中生成的一些含有高能键的化合物，它们可以不经电子传递链，而直接偶联ATP或GTP的合成，这种反应称为底物水平磷酸化。糖酵解中第一次底物水平磷酸化反应这步反应为磷酸甘油酸激酶将甘油酸-1,3-二磷酸的磷酸基团转移至ATP，形成甘油酸-3-磷酸和一份子ATP，在这一步，糖酵解过程达到了能量收支平衡：2分子ATP在先前的反应中被消耗，而在这步反应中有两分子

35、ATP被合成。这步反应作为两步底物水平磷酸化中的一步，以ADP作为底物，所以当细胞ATP水平较高时，该步反应被抑制；第八步凡是催化分子内化学功能基团的位置移动的酶都称为变位酶。第九步烯醇化酶催化的脱水反应是一个可逆反应，反应的自由能变化很小，但是分子内能重新分布的变化很大。2-磷酸甘油酸中的磷酸键是一个低能键，其水解的标准自由能变化是-17.6kJ/mol。磷酸烯醇式丙酮酸中的磷酰烯醇键是高能键，其水解的标准自由能的变化为-62.1kJ/mol，因此这一步反应显著地提高了磷酰基的转移势能。磷酸烯醇丙酮酸在热力学上很不稳定。第十步丙酮酸激酶PK糖酵解过程的第三个调节酶，也是第二次底物水平磷酸化反

36、应。丙酮酸激酶反应是一个代谢调节位点。酶活力受高浓度ATP抑制，受1，6-二磷酸果糖激活。在肝中这个酶的合成受饮食中糖的控制。肝中丙酮酸激酶活力也受酶蛋白的磷酸化和脱磷酸化调节。脱磷酸化的丙酮酸激酶活力较高。糖酵解中的不可逆反应1. 葡萄糖经已糖激酶催化生成6-磷酸葡萄糖 G= -33.5 kJ/mol2. 6-磷酸果糖经磷酸果糖激酶催化生成1，6二磷酸果糖 G= -22.2 kJ/mol3. 磷酸烯醇式丙酮酸经丙酮酸激酶生成丙酮酸 G= -16.7 kJ/mol小结1. 糖酵解的第一步磷酸化反应，消耗一分子的ATP水解所产生的能量来驱动该反应的进行催化反应的酶：己糖激酶（在肝脏中存在一种特异

37、性高的葡萄糖激酶），也是第一个调节酶，受产物G-6-P的别构抑制在激酶与底物结合时，会发生酶叶关闭现象。2. 异构化反应，反应的意义是为了活化第一个C原子3. 糖酵解的第二步磷酸化反应，催化反应的酶：磷酸果糖激酶（PFK-1）第二个调节酶，同时是反应的关键酶（概念），受很多因素的限制，ATP对其抑制机理，AMP能解除这种抑制作用，柠檬酸和脂肪酸都有抑制作用，还有H+的抑制的生理学意义。4.由醛缩酶（概念）催化的断裂反应，自由能>0,由于3-P-甘油醛不断被消耗，反应向着产物进行的方向。在这步由一分子六碳糖生成两分子三碳糖。5. 只有3-P-甘油醛能够进入后续的反应，所以需要一个异构化酶。

38、6.甘油醛-3-磷酸脱氢酶催化的糖酵解中唯一一个脱氢反应，第一个氧化还原反应，酶的活性集团是具有亲核作用的SH，能够与醛基形成中间物，将氢转移给NAD+生成NADH。两个抑制剂分别为：砷酸盐和碘乙酸，但机理不同。7.第一步底物水平磷酸化，底物水平磷酸化是指物质在生物氧化过程中生成的一些含有高能键的化合物，它们可以不经电子传递链，而直接偶联ATP或GTP的合成，这种反应称为底物水平磷酸化。在这一步，糖酵解过程达到了能量收支平衡：2分子ATP在先前的反应中被消耗，而在这步反应中有两分子ATP被合成8.由磷酸甘油酸变位酶（概念）催化的磷酸基团变位反应，催化基团是组氨酸，通过磷酸化活化生成2,3-二磷

39、酸甘油酸9.烯醇化酶催化的一个脱水反应，生成了酵解途径中的第二个高能磷酸化合物，磷酸烯醇式丙酮酸。氟化物是其抑制剂。10.丙酮酸激酶催化的第二个底物水平磷酸化，也是反应体系的第三个调节酶。受高浓度ATP抑制，受1，6-二磷酸果糖激活。丙酮酸的缺失会造成2,3-二磷酸甘油酸的积累，影响血红蛋白的氧亲和力，造成氧运输问题。由葡萄糖转变为两分子丙酮酸能量转变的估算总反应式为：葡萄糖 + 2Pi + 2ADP + 2NAD+ 2丙酮酸 + 2ATP + 2NADH + 2H+ + 2H2O C6H12O6+2NAD+2ADP+2Pi Þ 2C3H4O3+2NADH+2H+2ATP+2H2O能

40、量计算：氧化一分子葡萄糖净生成 2ATP2NADH5ATP 或 3ATP 糖酵解过程中ATP的生成：（1，3，7，10）途径化学计量和生物学意义葡萄糖在分解代谢过程中产生的能量有两种形式：直接产生ATP；生成高能分子NADH或FADH2，后者在线粒体呼吸链氧化并产生ATP。糖酵解：1分子葡萄糖 2分子丙酮酸，共消耗了2个ATP，产生了4 个ATP，实际上净生成了2个ATP，同时产生2个NADH。生物学意义 是葡萄糖在生物体内进行有氧或无氧分解的共同途径,通过糖酵解，生物体获得生命活动所需要的能量； 形成多种重要的中间产物，为氨基酸、脂类合成提供碳骨架 为糖异生提供基本途径。丙酮酸的去路生成乳酸

41、生成乙醇糖酵解作用的调节 在代谢途径中，催化不可逆反应的酶所处的部位是控制代谢反应的有力部位。在糖酵解途径中，由己糖激酶、磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶催化的反应实际上都是不可逆反应，因此，这三种酶都具有调节糖酵解途径的作用。 糖酵解过程的限速/调节酶：磷酸果糖激酶是关键酶磷酸果糖激酶受高浓度ATP的抑制，ATP是磷酸果糖激酶的别构抑制剂。 柠檬酸抑制磷酸果糖激酶：糖酵解除了为生命活动提供能量外，还有为合成各种物质提供碳骨架的作用。柠檬酸含量高时，意味着有丰富的生物合成前体存在。柠檬酸通过加强ATP的抑制效应来抑制磷酸果糖激酶的活性，从而使糖酵解过程减慢。果糖-2,6-二磷酸对酵解的调节作用：果糖-

42、2,6-二磷酸是磷酸果糖激酶强有力的变构激活剂。在肝脏中，果糖-2,6-二磷酸提高磷酸果糖激酶与果糖-6-磷酸的亲和力，并降低ATP的抑制效应。 己糖激酶对糖酵解的调节作用 己糖激酶受葡萄糖-6-磷酸的抑制。当磷酸果糖激酶受抑制时，果糖-6-磷酸积累，使得葡萄糖-6-磷酸也积累，从而抑制己糖激酶的活性。但有的时候情况并不完全如此，因为葡萄糖-6-磷酸还可以转变成糖原，或经五碳糖磷酸途径氧化。当磷酸果糖激酶受抑制时，葡萄糖-6-磷酸不一定积累，己糖激酶也就不一定受抑制，所以己糖激酶不是糖酵解途径的限制酶。 糖酵解小结糖酵解过程的11个酶糖酵解过程的12步反应： 葡萄糖 6-磷酸葡萄糖 6-磷酸葡

43、萄糖 6-磷酸果糖 6-磷酸果糖 1,6-二磷酸果糖 1,6-二磷酸果糖 磷酸二羟丙酮+3-磷酸甘油醛 磷酸二羟丙酮 3-磷酸甘油醛 3-磷酸甘油醛 1,3-二磷酸甘油酸 1,3-二磷酸甘油酸 3-磷酸甘油酸 3-磷酸甘油酸 2-磷酸甘油酸 2-磷酸甘油酸 磷酸烯醇式丙酮酸 磷酸烯醇式丙酮酸 烯醇式丙酮酸 烯醇式丙酮酸 丙酮酸 丙酮酸 乳酸糖酵解意义：l 在无氧条件下迅速提供能量,供机体需要。如:剧烈运动、人到高原l 是某些细胞在不缺氧条件下的能量来源。l 是某些病理情况下机体获得能量的方式。l 是糖的有氧氧化的前过程，亦是糖异生作用，大部分逆过程。l 糖酵解是糖、脂肪和氨基酸代谢相联系的途径

44、l 若糖酵解过度，可因乳酸生成过多而导致乳酸中毒。糖酵解作用发生的部位是细胞质的可溶性部位。柠檬酸循环 (The Citric Acid Cycle)有氧氧化是指体内组织在有氧条件下，葡萄糖彻底氧化分解生成CO2和H2O的过程。1、 丙酮酸进入柠檬酸循环的准备阶段形成乙酰CoA（具体反应P93-95）催化这些反应的酶是包括丙酮酸脱氢酶在内的多酶复合体，由3种酶高度组合在一起形成的，统称为丙酮酸脱氢酶复合体或丙酮酸脱氢酶系，有时也笼统地称为丙酮酸脱氢酶。反应的辅助因子不止有辅酶A和NAD+，还有硫胺素焦磷酸（TPP）、硫辛酰胺、黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）等三种酶：丙酮酸脱氢酶组分、二氢硫辛酰转

45、乙酰基酶、二氢硫辛酸脱氢酶。丙酮酸脱氢酶系催化酶： （PPT)这一多酶复合体位于线粒体内膜上，原核细胞则在胞液中。由丙酮酸脱氢酶，二氢硫辛酰胺转乙酰酶和二氢硫辛酰胺脱氢酸三种酶按一定比例组合成多酶复合体。丙酮酸转化为乙酰辅酶A丙酮酸脱氢酶复合体的调控 丙酮酸脱氢酶复合体催化的这个反应是哺乳动物体内使丙酮酸转变为乙酰CoA的唯一途径。乙酰CoA既是柠檬酸循环的入口，又是脂类生物合成的起始物质。1产物控制 产物NADH抑制E3，乙酰CoA抑制E2。如果NADH和乙酰CoA处于高浓度，则E2处于与乙酰基结合的形式，不再接受羟乙基基团，E1上的TPP停留在结合状态，抑制丙酮酸脱羧。2磷酸化和去磷酸化的

46、调控 E2分子上结合着两种特殊的酶，一种称为激酶，另一种称为磷酸酶，它们分别使E1磷酸化和去磷酸化，去磷酸化形式是E1的活性形式。Ca2+通过激活磷酸酶的作用，也能使E1活化。2、 柠檬酸循环概貌柠檬酸循环也叫三羧酸循环(tricarboxylic acid cycle)，又叫做TCA循环，也将此途径称为Krebs循环。乙酰辅酶A与草酰乙酸缩合成六碳三羧酸即柠檬酸，经过一系列代谢反应，乙酰基被彻底氧化，草酰乙酸得以再生的过程称为三羧酸循环。按顺序参与催化的酶：1 柠檬酸合酶2 乌头酸酶3 乌头酸酶4 异柠檬酸脱氢酶5 -酮戊二酸脱氢酶复合体6 琥珀酰-CoA合成酶7 琥珀酸脱氢酶8 延胡索酸酶

47、9 苹果酸脱氢酶3、 柠檬酸循环的反应机制Step 1. 乙酰CoA与草酰乙酸缩合成柠檬酸柠檬酸的形成：乙酰辅酶与草酰乙酸缩合成柠檬酸。反应由柠檬酸合酶催化，此酶是一个调控酶。草酰乙酸先与酶结合，导致酶的结构发生变化，暴露出与乙酰辅酶的结合部位，属于“诱导契合”模型。反应的能量由乙酰CoA的高能硫酯键提供，所以使反应不可逆。此为醇醛缩合反应，先缩合成柠檬酰CoA，然后水解。第一个调控酶调节酶：柠檬酸合酶Step 2.柠檬酸异构化形成异柠檬酸异柠檬酸的形成：柠檬酸由顺乌头酸酶催化，脱水，然后加水，从而改变分子内OH和H的位置，使原来在C3上的羟基转到C2上，生成异柠檬酸。催化这两步反应是同一酶，

48、其中间产物为顺乌头酸与酶结合在一起以复合物形式存在。Step 3.异柠檬酸氧化形成酮戊二酸 是第一个氧化还原反应异柠檬酸脱氢酶：第二个调节酶这阶段放出了1分子CO2，由 C6 C5 ；产生1分子NADH异柠檬酸氧化脱羧生成-酮戊二酸：异柠檬酸在异柠檬酸脱氢酶作用下反应中间物是草酰琥珀酸，它是一个不稳定的-酮酸，当与酶结合则脱羧形成-酮戊二酸，脱下的氢由NAD接受，生成NADH和H。异柠檬酸脱氢酶是三羧酶循环中第二个调节酶。 （记：发生的变化、能量的产生、体系的调节）Step 4.酮戊二酸氧化脱羧形成琥珀酰CoA 这阶段又放出了1分子CO2，由 C5 C4 ；又产生1分子NADH；形成1个高能硫

49、酯键。 这是三羧酸循环中第二个氧化脱羧反应，是由-酮戊二酸脱氢酶系所催化的。此脱氢酶系与丙酮酸脱氢酶系相似，由三个酶即-酮戊二酸脱氢酶，琥珀酰转移酶和二氢硫辛酰脱氢酶组成。也需要TPP，硫辛酸，辅酶A，FAD和NAD5种辅助因子。 -酮戊二酸脱氢酶，由-酮戊二酸脱氢酶（E1)、二氢硫辛酰转琥珀酰酶（E2)、二氢硫辛酰脱氢酶（E3）组成。需要TPP、硫辛酸、CoA、FAD、NAD+、Mg2+六种辅助因子。（书） Step 5 琥珀酰CoA转化成琥珀酸 琥珀酰CoA转化成琥珀酸，并产生GTP：这是三羧酸循环中唯一底物水平磷酸化直接产生高能磷酸键的步骤。Step 6 琥珀酸脱氢形成延胡索酸

50、这是三羧酸循环中第三步氧化还原反应，由琥珀酸脱氢酶催化，氢的受体是酶的辅基FAD，生成延胡索酸和FADH2。该酶是三羧酸循环中唯一掺入线粒体内膜的酶，并且直接与呼吸链联系。丙二酸是琥珀酸脱氢酶的强抑制剂。Step 7 延胡索酸水合形成L-苹果酸 Step 8 L-苹果酸脱氢形成草酰乙酸三羧酸循环中第4次氧化还原反应，也是最后一步。小结：1. 由柠檬酸合酶催化的从C4和C2缩合成C6的反应，是TCA的第一个调节酶，属于“诱导契合”反应。2. 顺乌头酸酶催化，脱水，然后加水，从而改变分子内OH和H的位置，使原来在C3上的羟基转到C2上，生成异柠檬酸。顺乌头酸是反应的中间物。3. 柠檬酸脱氢酶催化的

51、第一个氧化还原反应，生成了一个a-酮酸，这阶段放出了1分子CO2，由 C6 C5，产生1分子NADH，该酶是体系的第二个调节酶。4. 由-酮戊二酸脱氢酶系所催化的第二个氧化脱羧反应，此脱氢酶系与丙酮酸脱氢酶系相似，由三个酶即-酮戊二酸脱氢酶，琥珀酰转移酶和二氢硫辛酰脱氢酶组成。也需要TPP，硫辛酸，辅酶A，FAD和NAD5种辅助因子。这阶段又放出了1分子CO2，由 C5 C4 ；又产生1分子NADH；形成1个高能硫酯键。该酶是体系的第三个调节酶。5. 琥珀酰CoA合成酶催化的三羧酸循环中唯一底物水平磷酸化，生成一分子GTP。6. 琥珀酸脱氢酶催化的三羧酸循环中第三步氧化还原反应，该酶嵌合在线粒

52、体内膜上，是线粒体内膜的重要组成成分，其他的酶大多存在于线粒体的基质中。这步反应生成一分子FADH2。丙二酸是该酶的抑制剂。7. 延胡索酸酶催化的加水反应，具有立体专一性，只能催化反式和L-异构体。8. 苹果酸脱氢酶催化的三羧酸循环中第4次氧化还原反应，又产生1分子NADH。4、 柠檬酸循环的化学总结算产物NADH和FADH2的去路:由TCA循环产生的NADH和FADH2必须经呼吸链将电子交给O2，才能回复成氧化态，再去接受TCA循环脱下的氢。所以，TCA循环需要在有氧的条件下进行。否则NADH和FADH2携带的H无法交给氧，即呼吸链氧化磷酸化无法进行，NAD+及FAD不能被再生，使TCA循环

53、中的脱氢反应因缺乏氢的受体而无法进行。葡萄糖彻底氧化经由的途径：EMP途径、丙酮酸氧化脱羧、TCA循环、呼吸链氧化磷酸化。5、 柠檬酸循环的调控在柠檬酸循环中，虽然有8种酶参加反应，但在调节循环速度中起关键作用的有3种酶：柠檬酸合酶、异柠檬酸脱氢酶和酮戊二酸脱氢酶复合体。其调控可以分为两个方面： 柠檬酸循环本身各种物质对酶活性的调控； ADP、ATP和Ca2+的调控。 柠檬酸循环本身制约系统的调节 1乙酰CoA和草酰乙酸的供应情况。乙酰CoA来源于丙酮酸，受到丙酮酸脱氢酶复合体活性的控制；草酰乙酸的供应取决于循环是否运行畅通，以及中间产物离开循环的速率和补充的速率。2. NADH/NAD+的比

54、值。柠檬酸合酶和异柠檬酸脱氢酶都受到NADH的抑制，但异柠檬酸脱氢酶对NADH更为敏感。酮戊二酸脱氢酶复合体也受NADH的抑制。3产物的反馈抑制。柠檬酸合酶受高浓度柠檬酸的抑制；酮戊二酸脱氢酶复合体受琥珀酰CoA的抑制。 ATP、ADP和Ca2+对柠檬酸循环的调节 1ATP/ADP的比值。 ATP/ADP的比值对柠檬酸循环中的酶有调节作用，ADP是异柠檬酸脱氢酶的别构促进剂，可降低该酶的Km值，促进酶与底物的结合；而ATP抑制该酶。2Ca2+浓度。 Ca2+可激活丙酮酸脱氢酶的磷酸酶，使丙酮酸脱氢酶去磷酸化而活化，从而增加乙酰CoA的供应。同时Ca2+也能激活异柠檬酸脱氢酶和酮戊二酸脱氢酶。 六、柠檬酸循环的双重作用柠檬酸循环