微生物学实验指导-湖南农大

1、微生物学实验指导生物秀专心做生物!易生物-领先的生物医药商务平台生物秀论坛-学术交流,资源共享,互助社区湖南农业大学植物科学实验教学中心2006年8月目录实验一细菌染色技术 (2实验二细菌的芽孢染色和鞭毛染色 (6实验三植物病源真菌的形态观察 (7实验四植物病原细菌及其所致病害症状观察 (13实验五接合菌门真菌基本形态及所致病害观察 (17实验六担子菌门真菌的基本形态及所致病害的观察 (22实验七有丝分裂孢子真菌的基本形态及所致病害的观察 (27实验八病原物的分离培养与接种 (28实验九植物的抗病性和病原菌的生理分化 (29实验一细菌染色技术细菌个体微小,普通光学显微镜下不易直接观察,故常用染

2、色技术使细菌细胞着色。包括细菌单染技术、细菌的革兰氏染色技术、细菌的芽孢染色技术、细菌的荚膜染色技术和细菌的鞭毛染色技术、细菌的单染技术简单染色通常只用一种染色剂,使细菌整个细胞染上颜色。但看不清结构。所以只便于检查细菌的形态、大小和排列方式等。【实验目的】1、掌握单染色的操作技术2、观察细菌的基本形态【实验原理】单染色即用单纯的种染料进行染色,多数采用美蓝、结晶紫或石碳酸复红等碱性染料。此法仅能显示细胞的外部形态,而不能辨别其内部结构。染色前必须将细胞固定,其目的是杀死细菌,并使它粘附在载玻片上。此外,还可以增加菌体对染料的亲和力。常用的有加热和化学固定两种方法。无论用哪种方法都应尽量使细菌

3、维持原有的形态,防止细胞膨胀或收缩。【实验材料、药品及器具】1、菌种大肠杆菌(Escherichia col i枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis2、染色液石炭酸品红染色或结晶紫染色液(Stining Solutions3、无菌水4、洗瓶装蒸馏水5、洗净的载玻片(Slicle5片6、显微镜、香柏油、接种环、酒精灯、擦镜纸、吸水纸、二甲苯【实验步骤】1、涂片:取一片干净无油载玻片,在其中央滴一滴无菌水,然后用接种环以无菌操作方法取少许培养好的大肠杆菌,放在载玻片的水滴中涂匀,注意菌量不宜过多,否则,不易看清单个菌体。2、固定:将涂好的玻片在空气中风干或火焰上通过34次,使水份蒸发,

4、此时细菌菌体紧贴在玻片上。3、染色:用石炭酸品红或结晶紫染色剂3060S,然后用洗瓶轻轻冲洗染色剂(注意不要直接冲洗染色部位,直至无多余的染液,晾干或用吸水纸从旁吸干或用微火烘干。4、用同样方法将枯草芽孢杆菌制作一张涂片。5、镜检:首先在低倍镜下找到物像,然后在涂膜中央滴一滴香柏油,换成油浸镜观察两个菌种的形态和排列。6、去除油镜上的香柏油:先用干净的擦镜纸擦2-3次,再换另一张擦镜纸蘸取少许二甲苯以除去残留的香柏油,最后用擦镜纸擦干。擦镜头时应顺着镜头直径方向擦,不要沿着圆周方向擦。【实验结果】1、绘制观察到大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的形态图,并注明放大倍数。2、用文字描述两菌株的细胞形态。【思

5、考题】1、涂片在染色前为什么要先进行固定?固定时应注意什么问题?2、制片为什么要完全干燥后才能用油镜观察?3、制片时应注意哪些事项?为什么?、细菌的革兰氏染色革兰氏染色是细菌鉴定上一个最重要和广泛应用的方法。根据此法染色结果可将细菌分成两大类。一类细菌能够保留初染色剂(结晶等于细胞中,不受脱色剂(酒精的影响,而最后细菌被染成紫色或深蓝色者称为革兰氏阳性(Gram-positive;另一类细菌可因脱色剂的作用而洗出结晶紫,然后被另一染色剂(藏红花染成红色,称为革兰氏阴性(Gram-negative。也有一些菌种革兰氏染色是可变的。【实验目的】了解革兰氏染色的原理,并掌握革兰氏染色法的操作技术。【

6、实验原理】革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种重要的鉴别染色法。1884年由丹麦医师Gram创立。细菌先经碱性染料结晶紫染色,再经碘液媒染(以增加染料与细胞的亲和力后,用酒精或丙酮脱色,再用复染色剂染色。不被脱色而保持原颜色者为革兰纸阳性菌(G+;被脱色后又被染上复染剂的颜色者为革兰氏阳性菌(G-。此法可将细菌分为两大类。革兰氏染色的机理主要是利用两类细菌的细胞壁成分和结构不同。革兰氏阴性菌的细胞壁中含有较多的类脂质,而肽聚糖的含量较少。当用乙醇或丙酮脱色时,类脂质被溶解,增加了细胞壁的通透性,使初染后的结晶紫和碘的复合物易于渗出,结果细胞被脱色,经复染后,又染上复染液的颜色;而革兰氏阳性菌细

7、胞壁中肽聚糖的含量多且交联度大,类脂质含量少,经乙醇或丙酮洗脱后,肽聚糖层的孔径变小,通透性降低,因此,细胞仍保留初染时的颜色。【实验材料、药品及器具】1、菌种大肠杆菌(Escherichia coli枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis金黄色葡萄球菌(Staphylococeus auresu2、染液草酸铵结晶紫液革兰氏碘液95%的酒精藏花红液3、器皿洗净的载玻片6片、显微镜、酒精灯、接种环、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、镊子、玻璃缸、瓶装蒸馏水【实验步骤】1、取培养12-24h的大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌分别涂片、固定。2、加草酸铵结晶紫染色剂一滴,染色1分钟。3

8、、倾去染液并用洗瓶装水轻轻冲洗。4、加碘液染1分钟,水洗,然后用吸水纸吸干。5、将载玻片略倾斜,滴加95%酒精脱色(洗至流下的酒精中无紫色时为止,然后水洗。6、加藏花红复染,染色30分钟,水洗,用吸水纸吸干或烘干。7、用油镜镜检观察。【实验结果】1、显微镜下观察,确定每个菌种的革兰氏染色反应。2、绘制每一细菌的菌体形态图,注明菌种名称,放大倍数、颜色。【思考题】1、革兰氏染色反应的机制什么?2、你认为操作中有哪些因素影响结果的正确性?实验二细菌的芽孢染色和鞭毛染色细菌芽孢染色某些细菌在其发育的一定阶段可以形成一个内生孢子,即为芽孢。芽孢形成后并不脱离原细菌菌体,它的形状、大小和在菌体的位置都是

9、一定的。老熟的芽孢可自菌体中脱落出来。芽孢结构上的特点是壁厚和细胞质浓厚,所以不易着色,通常多采用着色力强的染色剂和用加热等手段促使芽孢着色,并利用复染的方法对比原细菌菌体和芽孢,才易于在显微镜下看到它们。但是,若用简单染色法使菌体着色而芽孢无色也可以衬托出芽孢的形状、大小和位置。【实验目的】掌握细菌芽孢染色的方法。【实验原理】细菌的芽孢含水量少,脂肪含量高,芽孢壁较厚,对染料的透性差,不易着色,但是一旦着色又难以脱色。通常,芽孢染色采用弱碱性染料孔雀绿在加热的条件下进行。染色完毕,用蒸馏水冲洗。因孔雀绿是弱碱性染料,与菌体结合力较差,因此易被水冲洗掉,而进入芽孢的孔雀绿却难于溶出。水洗后,再

10、用一种呈红色的碱性染料复染,使菌体和芽孢呈现不同颜色。【实验材料、药品及器具】1、菌种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium2、染液孔雀绿染液藏花红染液3、器皿显微镜、酒精灯、镊子、洗净的载玻片4片、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、玻璃红、洗瓶装蒸馏水、接种环。【实验步骤】1、取培养24h左右的枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌分别涂片、干燥、固定。2、在涂片部分用吸水纸条盖住,然后向纸条滴加孔雀绿液至饱和。3、将涂片逐渐加热至微冒蒸汽并不时添加染液以防止吸水纸条干燥。染色2-8分钟。4、除去吸水纸条,用蒸馏水轻轻冲洗掉多余染液。5、用藏花

11、红染液复染3060S。6、水洗,风干或烘干后镜检。【实验结果】1、首先用低倍镜,再用油浸镜检查制片,注意芽孢的颜色和菌体的颜色。2、绘制芽孢图。注意芽孢在菌体内的位置、大小和形状并绘制游离芽孢形态图。【思考题】1、为什么经孔雀绿染色后,水洗再复染红色染液只能染上菌体?2、用革兰氏染色能否看到芽孢,为什么?细菌鞭毛染色许多细菌自细胞内长出一至许多根细丝状附属物称为鞭毛。鞭毛是细菌的运动器官,有鞭毛的细菌均可运动。鞭毛细长透明,其宽度在普通光学显微镜波长检验范围之外,所以不易观察。但是在不染色情况下可以检测到细菌的运动推断鞭毛的存在。【实验目的】学习并掌握鞭毛染色的原理和方法。【实验原理】细菌的鞭

12、毛非常纤细,直径一般在20nm左右,用电镜才能观察。本实验采用特殊染色法,即在染色前先经媒染剂处理,媒染剂吸附在鞭毛上,使鞭毛加粗,便可达到普通光学显微镜的辨析范围以内。染色后,即可利用普通光学显微镜进行观察。【实验材料、药品及器具】1、菌种培养18-24h的菌种大肠杆菌(Escherichia coli普通变形杆菌(Proteus Vulgaris荧光极毛杆菌(Pseudomonas fluorescens2、染色液鞭毛染色液甲鞭毛染色液乙(实验前配好的新鲜染液3、器皿显微镜、酒精灯、洗瓶装蒸馏水、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、干净载玻片、玻璃缸、无菌水三管、灭菌长滴管三支。【实验步骤】1

13、、用长滴管取无菌水轻轻移入长好菌种的试管内,培育20-30min使细菌自己慢慢游入水中并充分舒展其鞭毛,使水呈轻度混浊。2、取一滴菌悬液滴于玻片的1/3位置上,然后轻轻抬起此端,使悬液缓慢流至玻片另一端,平放使其在空气中自然干燥固定。切忌用火焰烘干。3、在涂片部位滴甲液,染色35min。4、用蒸馏水轻轻冲洗。5、加乙液染3060s,可在酒精灯上稍稍加热。冲洗多余的染液。6、制片干后检查。【实验结果】1、显微镜下检查鞭毛染成什么颜色和形状。2、比较菌种鞭毛着生的位置、数目并绘图。【思考题】1、菌种的培养时间与鞭毛染色有什么关系?2、你在显微镜下看到的鞭毛是否为原来的大小和形状?3、鞭毛涂片与芽孢

14、涂片有何区别?为什么?实验三植物病源真菌的形态观察植物病害分为细菌病害、真菌病害和病毒病害三大类,其中真菌病害占到植物病害的95%左右。病源微生物侵染植物后,导致寄主植物细胞和组织的正常生理功能受到严重的影响,并引起病变症状。即植物在外形上、生理上和生长上的不正常变化,这种变化可以导致植物局部的损伤或全株死亡,造成植物产品品质和产量的损失。真菌分布广泛,种类繁多,已报导的将近45000多种,是植物病原生物中最主要的一大类群,它所引起的病害占植物病害的80%以上,尽管真菌形态差异很大,但基本结构相似,大多数真菌有营养体和繁殖体之分,营养体是指吸收养分的器官,繁殖体是指从营养体上产生的各种类型的孢

15、子。真菌产生孢子的机构,无论是有形性的还是无性的,统称为子实体。真菌的孢子分为无性孢子和有性孢子两类。无性孢子有游动孢子、孢囊孢子、分生孢子和厚垣孢子;有性孢子有休眠孢子囊、卵孢子、接合孢子、子囊孢子和担子孢子。真菌孢子的形态特征是鉴定和分类学上的重要依据,其营养体及其变态和菌组织体则是真菌分类的重要参考依据,有的还是重要的鉴别特征和分类依据。【实验目的】通过本次实验熟悉真菌的营养体和繁殖体的基本形态,为以后真菌病害的病原物鉴定和真菌分类奠定初步基础。【实验原理】霉菌的营养体是分枝的丝状体。其个体比细菌和放线菌大得多,分为基内菌丝和气生菌丝。气生菌丝中又可分化出繁殖丝。不同霉菌的繁殖菌丝可以形

16、成不同的孢子。霉菌菌丝较粗大,细胞易收缩变形,且孢子容易飞散,所以制标本时常用乳酸石炭酸棉蓝染色液。此染色液制成的霉菌标本片的特点是:细胞不变形,具有杀菌防腐作用,且不易干燥,能保持较长时间,溶液本身呈蓝色,有一定染色效果。利用培养在玻璃纸上的霉菌作为观察材料,可以得到清晰、完整、保持自然状态的霉菌形态;也可以直接挑取生长在平板中的霉菌菌体制水浸片观察。【内容、材料和方法】(一真菌的营养体1、菌丝和菌丝体除少数原始的类群以外,真菌典型的营养体是极为细小的丝状体,这种丝状体称为菌丝,生长成丛的菌丝称为菌丝体,低等真菌的菌丝是无隔的,大多数真菌是有隔的。(1挑取马铃薯晚疫病菌(Phytophtho

17、ra infestans或瓜果腐霉病菌(Pythium aphanidermatum制片,镜检无隔菌丝。(2挑取立枯丝核菌(Rhizoctonia solani制片镜检有隔菌丝。(3观察各种病原真菌在平面和斜面培养基上形成的菌落,注意菌落大小、形状、厚薄、质地、颜色等形态特点。2、菌丝组织体有些真菌的菌丝体,在一定的条件下或一定的发育阶段,可形成特殊的组织体,常见有菌核、子座和根状菌索。(1菌核:菌核是由拟薄壁组织和疏丝组织形成的一种休眠体,既是真菌贮藏养分的器官,又是真菌用以度过不良环境的休眠机构,菌核大小不一,色泽和形状也各不相同。菌核中的菌丝组织已有分化现象,外皮组织细胞排列紧密,色深壁

18、厚,具有保护作用,为拟薄壁组织;内层细胞壁薄色淡,排列疏松,仍可维持营养作用,为疏丝组织。肉眼观察麦角病、油菜菌核病、黄瓜菌核病和大葱菌核病标本,比较菌核形状、大小、颜色;镜检细辛菌核病的菌核制片,注意比较表皮与内部组织细胞的排列特点。(2子座:子座是由拟薄壁组织和疏丝组织形成的容纳子实体的座垫状结构,或由菌丝体与部分寄主组织结合而成的称为假子座。子座是真菌从营养体到繁殖体的过渡机构,除可在其上或其内形成子实体外,也有度过不良环境的作用。肉眼观察稻曲病菌(Ustilaginoidea virens的分生孢子座;镜检苹果树腐烂病菌(Valsa mali和稻香柱菌(Epichloe typhina

19、所形成的子座制片,注意子座形状,着生部位及内部繁殖体类别。(3根状菌索:少数高等真菌的菌丝体还可纠结成绳索状的组织体,形如高等植物的根,故称根状菌索,其作用是帮助菌体蔓延和抵抗不良环境,根状菌萦组织也有表皮和内部组织的分化。肉眼观察林木上根状菌索的外部形状,注意和菌核比较,找出二者区别。3 菌丝体上分化出的吸收养分组织(1吸器:是寄生在细胞间的真菌,特别是一些专性寄生菌在菌丝体上形成的吸收养分的器官,形状有球状、丝状、掌状、裂片状等。镜检小麦白粉病菌(Blumeria graminis吸器制备片,注意吸器的形状及其形成的部位。 (2假根:为伸入基物内的菌丝体,形如高等植物的根系,故称假根。假根

20、除用其吸收养分外,还有固着菌体的作用。 挑取培养基中培养的甘薯软腐病菌(Rhizopus nigricans的菌丝(注意针尖要插入培养基内制片镜检或镜检根足霉(Rhizopus sp.制备片,注意假根与普通营养菌丝的区别。(3附着胞:从幻灯片或照片观察病菌侵染寄主植物形成附着胞的形态。(4菌环和菌网:捕食性真菌常由菌丝分化成菌环和菌网组织来捕捉线虫等小动物,然后再由菌丝侵入线虫体内吸取营养。( (二真菌的繁殖体孢子真菌的繁殖方式分无性和有性两种,分别产生无性孢子和有性孢子两大类型。真菌的无性繁殖包括断裂、出芽和产生孢子等,真菌的有性生殖包括质配、核配和减数分裂三个阶段。1 无性孢子:不经过性细

21、胞或性器官的结合便能产生孢子,称为无性孢子。真菌产生的无性孢子类型很多,主要的有游动孢子、孢囊孢子、分生孢子和厚垣孢子。(1游动孢子:游动孢子为鞭毛菌亚门真菌特有的无性孢子,产生在由菌丝顶端细胞或由菌丝分化成的孢子囊梗的顶端细胞膨大形成的孢子囊内、具鞭毛,能游动。制片镜检用线麻粒诱发的绵霉和水霉的游动孢子囊和游动孢子,镜检番茄晚疫病菌(Phytophthora infestans的游动孢囊梗、游动孢子囊和游动孢子。(2孢囊孢子:孢囊孢子为接合菌亚门真菌特有的无性孢子,生成方式和游动孢子相似,也是内生的,但无鞭毛,不能游动。挑取黑根霉(Rhizopus sp.制片(或取制备片镜检孢子囊梗,孢子囊

22、和孢囊孢子,注意观察孢子囊的形态及其着生位置及孢囊孢子的形态,颜色和产生的数目。(3分生孢子:子囊菌亚门真菌和大部分半知菌亚门真菌都产生分生孢子,分生孢子外生在分生孢子梗上,形状、大小、颜色不一,单生,链生或集生,分生孢子梗有的散生,有的束生,有的产生在分生孢子盘上或分生孢子器内,产生在分生孢子器内的分生孢子也叫器孢子。取玉米大斑病(Exserohilum turcicum的病叶,用刀片轻轻刮取病斑上的霉状物制片镜检分生孢子梗和分生孢子或挑取斜面培养基上培养的小麦根腐病菌(Bipolaris sativum制片镜检分生孢子梗和分生孢子,另取苹果灰斑病(Phyllosticta pirina制片

23、镜检分生孢子器和器孢子,注意分生孢子的形状,色泽,细胞数目及着生情况。(4厚垣孢子:镜检厚垣孢子制备片,菌丝中或孢子中个别细胞膨大、细胞壁加厚的孢子即厚垣孢子。2 有性孢子:由两个不同的性细胞或性器官相结合而产生的孢子叫有性孢子,有性孢子主要有以下4种。(1卵孢子:部分鞭毛菌亚门真菌的有性孢子,由菌丝上产生的两种异形配子囊交配产生。 制片镜检谷子白发病菌(Sclerospora graminicola的卵孢子或镜检大豆霜霉病菌(Peronospora manshurica卵孢子制备片,注意卵孢子形状、大小、颜色,孢壁形态。(2接合孢子:为接合菌亚门真菌的有性孢子,由两个同形配子囊交配而成。镜检

24、毛霉(Mucor接合孢子制片,注意接合孢子的大小,形状,颜色及表现特点。(3子囊孢子:为子囊菌亚门真菌产生的有性孢子,由两个异形配子囊交配生成,子囊孢子产生在子囊内,多为8个,子囊除极少数子囊菌裸生外,多数子囊菌生于子囊果中。 取山楂白粉病(Podosphaera oxyacanthae病叶,用解剖针将白粉上的小黑点(闭囊壳仔细拨至载玻片上的水滴中,加盖片并轻轻压破闭囊壳,镜检闭囊壳,子囊、子囊孢子和附属丝的形态,特别注意子囊的数目和附属丝的特点,另取油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotium132制备片,镜检子囊盘、子囊和子囊孢子。(4担孢子:为担子菌亚门真菌的有性孢子,由菌

25、丝结合后减数分裂而成,外生于担子或先菌丝上。 挑取萌发的玉米丝黑穗病菌(Sphacelotheca reiliana制片镜检冬孢子、先菌丝及担孢子的形态,另取小麦腥黑穗病菌(Tilletia caries冬孢子萌发的制备片,镜检冬孢子、先菌丝及担孢子的形态,比较两种黑粉病菌的区别。另外还有一种有性孢子为休眠孢子囊,由两个游动配子结合而成,为二倍体,萌发时减数分裂释放出单倍体的游动孢子。如壶菌、根肿菌可产生休眠孢子囊,根肿菌产生的休眠孢子囊萌发时通常只释放出一个游动孢子,有时也称为休眠孢子。【实验结果】1、绘有隔菌丝,无隔菌丝和菌核剖面图。2、绘分生孢子、孢囊孢子、卵孢子及子囊孢子的形态图。【思

26、考题】1、菌丝有无隔膜是否反应一定的进化关系?2、菌核和子座在形态和功能上有何不同?3、真菌吸器的有无与寄生性的强弱是否有一定关系?4、分生孢子和孢囊孢子的生成过程,形成数量(与产孢细胞比较及着生部位等方面有何不同?5、卵孢子、接合孢子、子囊孢子和担子孢子在有性生殖过程中形成的时期有何不同?实验四植物病原细菌及其所致病害症状观察【实验目的】细菌是引起植物病害的又一类重要的病原生物,虽不象植物病原真菌种类那样繁多,但因其个体微小,形态差异不够明显,所致病害症状复杂,都给细菌病害的研究带来一定的困难,病原细菌的形态观察和分类鉴定需要特有的实验技术,通过本次实验,掌握植物细菌病害的分类鉴定需要特有的

27、实验技术,熟悉植物细菌病害症状类型和病原细菌的基本形态,学习植物细菌病害简易诊断方法及病原细菌初步鉴定的程序和技术,为以后植物细菌病害的正确诊断和病原细菌的分类鉴定打下良好的基础。【内容、材料和方法】(一植物细菌病害的症状观察植物细菌病害的症状常作为鉴定属的一种辅助性状,即症状类型和病原属之间有一定的相关性,如棒杆菌属的细菌主要引起萎蔫症状;假单胞杆菌属主要引起叶斑,腐烂和萎蔫症状;黄单胞杆菌属主要引起叶斑和叶枯症状;野杆菌属引起瘤肿等增生性症状;欧氏菌属一般引起软腐,有时也引起萎蔫。此外,多数细菌病害在发病初期,特别在潮湿的自然条件下常呈水浸状或油渍状;在饱和湿度下病斑上常有菌脓形成,干后成

28、为菌痂,掌握症状类型(附1及其形成的生态条件,对细菌病害的正确诊断是十分重要的。 观察下列病害标本,区分症状类型。水稻白叶枯病(Xanthomonas oryzae马铃薯环腐病(Clavibacter sepedonicum白菜软腐病(Erwinia carotovora黄瓜细菌角斑病(Pseudomonas lachrymans苹果根癌病(Agrobacterium tumefaciens(二植物细菌病害的简易诊断植物细菌病害的诊断和病原鉴定是比较复杂的,初步诊断是根据症状特点和显微镜检查病组织中的细菌来完成的,细菌病害,除少数(如苹果根癌病外,绝大多数能在受害部位的维管束或薄壁细胞组织中产

29、生大量的细菌,并且吸水后形成菌溢,因此,镜检病组织中有无细菌的大量存在(菌溢的出现是诊断细菌病害简单易行的方法。取水稻白叶枯病新病叶,在病斑病健交界处剪取2×2 mm的小块病组织,放在载玻片上,滴加一滴蒸馏水,盖好盖玻片后,立即在显微镜下观察,注意叶组织维管束剪断处是否有大量的细菌,呈云雾状溢出,如将视野调暗观察更易见到,按同样方法用健康组织作镜检反证。(三植物病原细菌形态观察和种类鉴定细菌个体很小,无论形态观察还是种类鉴定,都须经染色后才能在显微镜下观察清楚,植物病原细菌目前发现的只有五个属:属的鉴定主要根据革兰氏染色反应,鞭毛数目和着生位置,菌落颜色及所致病害症状等进行。1、培养

30、性状观察取培养皿中培养的水稻白叶枯病菌(X.oyzae、马铃薯环腐病菌(C.sepedonicum,茄青枯病菌(Burkholderia solanacearum和白菜软腐病菌(E.carotovora等,注意观察菌落颜色、大小、质地,是否产生荧光色素等,和植物病原真菌培养菌落有什么根本性的不同?2、染色反应观察(1革兰氏染色反应供试菌种:马铃薯环腐病菌(C.sepedonicum和白菜软腐病菌(E.carotovora。操作步骤:A涂片方法a、取洁净的载波片,加一滴无菌水;用移菌环按无菌操作要求取一环菌苔,在水滴中制成菌悬液;b、另取一洁净载玻片,在中央加滴无菌水,取一环上述配制的菌悬液至水

31、滴中,均匀涂布成薄层后,自然晾干;c、将涂片在灯焰上缓慢通过23次进行固定。B 染色步骤a、滴草酸铵结晶紫液于涂片上,染色1分钟;b、倾去染液,水洗(亦可不用水洗;c、加碘液处理1分钟;d、倾去碘液、水洗、吸水纸吸干;e、用95%酒精洗脱染液,时间约30秒钟;f、吸干后,滴加复染剂藏红复染1030秒钟;g、水洗、吸干镜检。阳性反应的细菌染成紫色,阴性反应的染成红色,注意涂片菌液不能太浓,其次褪色要彻底。否则是红是紫不易区分。(2鞭毛染色细菌鞭毛很细(只有0.020.03微米。不做特殊处理,一般光学显微镜是看不见的,鞭毛上沉积了染剂或银盐后才能看到,这是所有鞭毛染色的根据。但是染剂也可以在载玻片

32、上沉积,如果载玻上沉积染剂太多,就会影响鞭毛染色效果。为此所用载玻片一定要用特殊方法严格洗涤(方法这里从略,此外染剂处理时间一定要严格掌握处理时间,处理时间太短,鞭毛上没有足够的沉积物看不清楚;处理时间太长,玻片上沉积物太多,也看不清楚。第三,菌龄十分重要,培养时间不足,或培养时间太长都不易染色成功,不同种类的细菌培养时间差异较大,白菜软腐病菌以在2628恒温箱中培养1618小时为宜,总之,鞭毛染色比较困难,必须严格掌握每个操作环节。操作步骤:A、载玻片准备用新的载玻片,经过系列清洁处理(方法从略后,进行检验,合格者用于实验。B、细菌悬液的配制供染色用的菌种,用前每隔12天转移一次,连续转移几

33、次进行活化,增强细菌的活性。在已活化并在1628恒温箱中培养1618小时的白菜软腐病菌斜面上加35毫升先在恒温箱中经予热的无菌水,静置1020分钟,使细菌游出配成稀薄的菌悬液,注意静置的时间不能太长,因为时间长了鞭毛可能脱落、染色固定前可在镜下观察其游动性。C、涂片用移置环取配好的菌悬液23环于洁净的载玻片上,立即将玻片直立,使菌液流下展开,在玻片上遗留并形成菌悬液膜,在空气中自然干燥固定,勿用火焰固定。D、染色鞭毛染色的方法很多,大致可分为两类,第一类是碱性品红染色法;第二类是银盐沉积法,本次实验用银盐沉积法或碱性品红染色法。银盐沉积法:滴甲液35分钟,用蒸馏水轻轻冲洗甲液,再加乙液,处理3

34、060秒钟,立即用蒸馏水轻轻冲洗乙液,空气中自然干燥后,镜检(有人在加乙液后,在灯焰上微加热,再用水洗菌体染成深褐色,鞭毛染成褐色,注意鞭毛数目及着生方式。碱性品红染色法(Leifson赖夫生染色法:在洁净载玻片上用尖蜡笔划4个1.3×2.0cm的长方形小格,将载玻片斜放,用移植环在每小格顶端加一滴菌悬液,流下的菌悬液用纸吸去,干燥后,在第一个小格加5滴染剂,经过5s,10s,15s 后,分别在第二、三、四3个格中加滴染剂,仔细观察染剂中有很细的沉淀物(铁锈色云雾状物产生,当第一、第二小格已产生沉淀时,立即用水洗去染剂,室温下使载玻片干燥,然后直接在油镜下镜检。【实验结果】将提供的细

35、菌病害标本的症状填入下表病害名称病原菌学名症状描述备注【思考题】1、植物细菌病害的在症状鉴定方法和防治方面与植物真菌病害有什么不同?为什么?2、细菌鞭毛染色理论根据是什么?3、鞭毛染色时无菌水倾入斜面菌种后,为什么通过静置法配制菌悬液? 涂片时,为什么用移置环从试管上层挑取菌悬液?4、试分析鞭毛染色成功与失败的主要技术环节。实验五接合菌门真菌基本形态及所致病害观察【实验目的】接合菌亚门的真菌叫接合菌,也是真菌中比较低等的一类,这类真菌的营养体为无隔菌丝体,无性繁殖产生孢囊孢子,有性繁殖产生接合孢子,接合菌分两个纲:接合菌纲(Zygomtcetes和毛菌纲(Trichomycetes。与农业病害

36、关系较大的是接合菌纲中的毛霉目(Mucorales真菌,重要的有两个属:根霉属(Rhizopus和毛霉属(Mucor。本实验的目的是熟悉与植病关系密切的接合菌的形态及其所致病害的症状特点,同时观察真菌的异宗配合现象。【内容、材料和方法】毛霉目(Mucorales真菌大多是腐生菌,引起植物花、果实、块根和块茎的腐烂。1根足霉属(Rhizopus(1根霉属(Rhizopus菌丝发达,有分枝,分布在基物表面或其内,有匍匐丝和假根。孢囊梗2-3根丛生,在假根相反方向从菌丝上产生,一般不分枝,顶生孢子囊,产生大量孢囊孢子,有囊轴,锣锤形,孢囊孢子单胞,表面有饰纹,接合孢子色深,表面有瘤状突起。取甘薯软腐

37、病(R.nigricans标本,观察症状特点,注意受害甘薯表面是否有白色毛状物生出?在白色毛状物中是否有黑点?挑取培养皿中培养的根足霉(带少许培养基制片,镜检小黑点是什么器官?注意匍匐枝和假根的形态,孢囊梗着生的位置,能否见到囊轴?什么形状?2、毛霉属(Mucor无匍匐丝与假根,孢囊梗单生,直立,其它形态同根霉,挑取培养皿中培养的毛霉制片(或取制备片020,镜检孢囊梗,孢子囊和孢囊孢子,注意和根霉的区别。 3、笄霉属(Choanephora形成的大小两种类型的孢子囊,条件不适时,产生大型孢子囊,大型孢子囊产生在顶端弯曲的孢囊梗上,其内产生多数孢囊孢子,孢子顶端有数根细毛。通常形成小型孢子囊,小

38、型孢子囊聚生在孢子囊梗顶端膨大的头状体的小梗上,其中形成一个孢子,故也称这种小型孢子囊为分生孢子。该菌为害花和果实,引起花腐和果腐,取制备片024,镜检笄霉的孢囊梗和孢子囊形态,注意观察该属与根霉、毛霉的区别。4、犁头霉属(Absidia产生匍匐丝和假根,孢囊梗自假根间的弓形匍匐丝上长出,配囊柄上长出附属丝包围接合孢子。取制备片023镜检犁头霉的假根,匍匐丝及配囊柄上长出附属丝包围接合孢子的形态,注意孢囊梗着生的位置和根霉有何不同。5、毛霉目真菌异宗配合现象观察毛霉目真菌多具异宗配合现象,即当两个不同交配型的菌株(“+”菌株和“-”菌株相遇时,则从各自菌丝上产生称作原配子囊的分枝,两个原配子囊

39、接触后,各自产生一个隔膜,将原配子囊分成两个细胞,顶端的细胞称作配子囊,基部的细胞称配囊柄,“+”和“-”两个配子囊接触点的细胞壁消解,融合成一个细胞,以后发育成黑色,厚壁的接合孢子。每组取三个灭菌培养皿,分别将熔化的马铃薯洋菜培养基10毫升,在无菌操作下倒入培养皿中,凝固后翻转培养皿,用玻璃笔在皿底外面划一直径,第一皿直径两侧底内接种“+”菌株,第二皿两侧都接种“-”菌株,第三皿,一侧接种“+”菌株,另一侧接种“-”菌株,接种后,在25温箱中培养一周,观察两个菌落生长的交界处,有无黑色粒点,即接合孢子的形成,挑取菌落少许制片镜检。观察接合孢子的形态,注意接合孢子形成的过程,三个培养皿中那个处

40、理能产生接合孢子?为什么?【实验结果】绘根足霉形态图【思考题】1、接合菌和鞭毛菌在形态上有哪些异同点?2、毛霉和根霉有什么不同?3、试谈异宗配合的概念。实验六担子菌门真菌的基本形态及所致病害的观察【实验目的】担子菌亚门的真菌称为担子菌,是真菌中最高等的一类真菌,其特点是有性生殖产生担子和担孢子,担孢子是一种外生孢子。由于多数担子菌没有明显的单倍体营养阶段,所以很少见到分生孢子繁殖,担子菌有两种类型的菌丝体,一种是由担孢子萌发形成的单倍体,每个细胞只有一个核的初生菌丝体,另一种是经过双核化而形成的每个细胞中有一对细胞核的次生菌丝体,常见的是后一种,担子菌菌丝体上锁状联合现象比较普遍。通过本次试验

41、掌握担子菌的形态特征及担子菌所致病害的症状特点,为担子菌的分类和病害鉴定打下初步基础。【内容、材料和方法】根据担子菌是否形成担子果,以及担子果是裸果型还是被果型等性状特点,将担子菌亚门分为冬孢菌纲(Teliomycotes,层菌纲(Hymenomycetes和腹菌纲(Gasteromycetes三个纲。其中寄生性较强,与植物病害关系密切的是冬孢菌纲的锈菌目的黑粉菌目,冬孢菌纲真菌一般认为是低等担子菌,没有担子果,形成分散或成堆的冬孢子。(一 锈菌目锈菌的特征是冬孢子从双核菌丝的顶端细胞形成,担子(上担子或后担子是由外生型的冬孢子(下担子或原担子萌发而成的,担子多产生三个横隔分为四个细胞,每个细

42、胞上产生一个担孢子,锈菌的生活史可以产生几种形态学和细胞学性状不同的孢子器,并有转主寄生现象,锈菌目根据冬孢子有柄或无柄分为两个科:无柄的层锈菌科(Melampsoraceae和有柄的柄锈菌科(Pucciniaceae。锈菌都是专性寄生的。1层锈菌科(Melampsoraceae(1 栅锈菌属(无柄锈菌属Melampsora冬孢子无柄,单细胞,侧面密结成整齐的单层,多生在表皮下,取亚麻锈病(M.lini标本观察症状特点,并镜检亚麻锈病菌制备片,注意以上形态特点。 (2层锈菌属(Phakopsora冬孢子无柄,单细胞,彼此上下侧面互相密结成多层、垫状,埋生在寄主表皮下,取枣锈病(P.ziziph

43、i-vulgaris标本观察症状将点,并镜检该菌制备片225,注意上述形态特点,及与无柄锈菌的区别。 2柄锈菌科(Pucciniaceae(1单胞锈菌属(Uromyces冬孢子有柄,单细胞,顶壁较厚,突破寄主表皮生于体外,取菜豆锈病(U.appendiculatus病叶和病荚标本观察夏孢子堆和冬孢子堆的大小、颜色,是否穿破表皮?用解剖针挑取病叶上的冬孢子制片镜检,注意该属锈菌的形态特征。 (2 柄锈菌属(双胞锈菌属Puccinia冬孢子有短柄,双细胞,壁厚,遇水不胶化,取麦类秆锈病(P.graminis、叶锈病(P.recondita和条锈病(P.srriiformis的标本,注意观察症状特点

44、,比较三种锈病发生部位,夏孢子堆和冬孢子堆的大小、形状、颜色,排列及开裂情况等有何不同,然后用解剖针挑取小麦秆锈病菌的冬孢子堆制片镜检,注意该属真菌上述的形态特点。 (3胶锈菌属(Gymnosporangium冬孢子有长柄,双细胞,壁薄,遇水胶化,取苹果锈病(G.yamadai和梨锈病(G.haraeanum标本,观察症状特点,特别注意在转主寄主柏树上的症状,哪种孢子发生在柏树上?该菌是否有夏孢子阶段?取苹果锈病菌制备片或梨胶锈菌冬孢子制备片231,注意该属的上述特点。(4 胞锈菌属(Triphragmidium冬孢子有柄,3个细胞,排成倒品字形,褐色,有瘤,取落叶松锈病(T.laricinu

45、m标本观察症状特点,镜检落叶松锈病菌制备片,注意上述特点。 (5 胞锈菌属(Phragmidium冬孢子单生,具长柄,大而显著,柄的下部膨大,3至多细胞,壁游动孢子鞭毛厚,表面光滑或有瘤状突起、观察玫瑰锈病(P.rosaemultiflorae标本,镜检其制备片,注意该属菌上述特点。1、黑粉菌科(Ustilaginaceae(1黑粉菌属(Ustilago冬孢子堆粉状,彼此分离,孢子堆外没有由菌丝构成的假膜包围,冬孢子表面光滑或有纹饰。观察小麦散黑穗病(U.tritici、玉米瘤黑粉病(U.maydis和谷子粒黑穗病(U.crameri的标本,注意受害部位及症状特点:取小麦散黑穗病菌制备 片20

46、1镜检冬孢子及冬孢子萌发的形态。(2轴黑粉菌属(Sphacelotheca冬孢子堆粉状,彼此分离,孢子堆外有由菌丝构成的假膜包围:孢子堆中间有由寄主维管束残余组织形成的中柱,冬孢子表面光滑或有纹饰、观察玉米丝黑穗病(S.reillana、高粱丝黑穗病(S.reiliana、高粱散黑穗病(S.cruenta和高粱坚黑穗病(S.sorghi标本,注意症状特点,比较高粱三种黑穗病症状有何不同,挑取高粱或玉米丝黑穗病菌冬孢子制片,镜检其大小、形状、颜色及表面特征,另取高粱丝黑穗病菌冬孢子萌发制备片204,观察冬孢子萌发的特点。 (3团黑粉菌属(Sorosporium冬孢子堆多产生在花部,冬孢子集结成球

47、,外面往往有由菌丝构成的假膜包围着,成熟后呈粉状或颗粒状,观察高粱长粒黑穗病(S.enrenbergii标本,注意为害特点,是否有长形囊状物形成,取高粱长粒黑穗病菌冬孢子制备片,镜检由许多冬孢子组成的球形或卵圆形的孢子球,注意外面是否有膜包围。 2腥黑粉菌科(Tilletiaceae(1腥黑粉菌属(Tilletia冬孢子堆多生于子房内,成熟后呈粉状或带有胶性,大都具有腥味。冬孢子表面常有网状或瘤状纹饰,少数种光滑,冬孢子萌发时,产生无隔膜的先菌丝,顶端产生成束的担孢子,常成对作“H”形结合,观察小麦普通腥黑穗病(包括网腥T. caries和光腥T. foetida标本,注意为害部位和症状特点,

48、镜检腥黑穗病菌萌发 状态制备片,注意先菌丝和担孢子的形态,担孢子是否作“H”状结合?(2尾孢黑粉菌属(Neovossia冬孢子堆生于子房内,半黏结至粉末状。冬孢子产生在菌丝末端的细胞内,孢子形成后菌丝残余物在冬孢子外形成一柄状结构。冬孢子表面布满齿状突起, 担孢子的数目多,一般不作“H”形结合。观察水稻粒黑粉病(N.horrida异名T.horrida标本,注意为害部位和症状特点,镜检水稻稻粒黑粉病菌萌芽的制备片,意冬孢子大小和形态,冬孢子表面是否有柄状附属物。(3叶黑粉菌属(Entyloma冬孢子堆成熟后长期埋生在叶片、叶柄和茎组织内,不呈粉状。观察水稻秆黑粉病(E.oryzae标本,注意发

49、生部位,黑肿或黑粉状叶片,镜检水稻叶黑粉病菌制备片,注意堆生在叶组织中的冬孢子堆。(4 条黑粉菌属(秆黑粉菌属Urocystis冬孢子聚集成团,坚固而不易分离,冬孢子团外有无色不孕细胞包围褐色冬孢子,观察小麦秆黑粉病(U. tritici标本,注意症状特点,镜检小麦秆黑粉病菌 制备片,观察冬孢子团和不孕细胞。【实验结果】1、小麦秆锈病菌、菜豆锈病菌和玫瑰锈病菌冬孢子形态图。2、丝黑穗病菌,小麦腥黑穗病菌和水稻叶黑粉病菌冬孢子及担子形态图。3、实验所见几种黑粉病菌的形态特点,编制黑粉病菌分类检索表。【思考题】1、子菌亚门真菌划分为哪几个纲?是根据什么划分的?2、子菌在菌丝体,无性繁殖体和有性繁殖

50、体的形态和发生上与子囊菌相比较有何特点?3、3、较锈菌和黑粉菌的异同点。实验七有丝分裂孢子真菌的基本形态及所致病害的观察【实验目的】本实验的主要目的是熟悉有丝分裂孢子真菌的形态特征和分类概况,熟悉有丝分裂孢子真菌所致病害的基本症状,为有丝分裂孢子真菌的分类和病害鉴定打下良好的基础。【内容、材料和方法】认识有丝分裂孢子真菌的基本形态和分类依据。1、丝核菌属、小核菌属的病原菌形态和所致病害的症状观察。2、粉孢属、梨孢属、轮枝孢属、葡萄孢属、尾孢属、链格孢属、黑星孢属、内脐蠕孢属、离蠕孢属、突脐蠕孢属的病原菌形态和所致病害的症状观察。3、镰刀菌属的病原菌形态和所致病害的症状观察。4、拟棒束孢属的病原

51、菌形态和所致病害的症状观察。5、炭疽菌属、痂圆孢属、拟盘多毛孢属、盘二孢属的病原菌形态和所致病害的症状观察。6、叶点霉属、茎点霉属、大茎点霉属、壳针孢属、壳囊孢属、壳二孢属、色二孢属的病原菌形态和所致病害的症状观察。【实验结果】绘梨孢、链格孢、尾孢、青霉、镰孢、炭疽菌、茎点和壳二孢属等病原菌的形态特征图。【思考题】在显微镜下你能分辨出分生孢子器和子囊壳吗? 如何区别?实验八病原物的分离培养与接种【实验目的】通过本次实验学习植物病原菌分离培养的原理和常用方法,学习常用的接种方法,掌握根据柯赫氏法则鉴定植物病原物的方法。【内容、材料和方法】1、学习田间采样的方法。2、学习PDA培养基的制作方法、湿热灭菌方法、干热灭菌方法和无菌平皿的制作方法。3、学习病原物的组织分裂方法和稀释分离方法。4、学习喷雾、针刺、摩擦接种的方法并观察接种的结果。【实验结果】提交分离培养、接种试验报告一份。要求:以一种病害分离、接种结果为题材,试按试验的目的意义,试验材料和方法、试验结果及结果分析和讨论等格式来写。实验九植物的抗病性和病原菌的生理分化【实验目的】利用和培育抗病品种,是防治病害的根本性措施,要搞好抗病育种工作,必须熟练掌握植物抗病性和病原物致病性分化的测定方法,病害的性质不同,其寄主抗病性和