基因工程常规技术-核酸提取纯化

1、第4章 基因工程常规技术由于提取由于提取DNA的目的、种类、所用的生物、组织材的目的、种类、所用的生物、组织材料、实验条件等不同，料、实验条件等不同，DNA的提纯有很多方法。其的提纯有很多方法。其中最常用的是中最常用的是碱抽提法碱抽提法DNA的提取与纯化的提取与纯化2一、质粒一、质粒DNA的提取的提取3较为常用的有碱抽提法、煮沸法和去污剂裂解法。前较为常用的有碱抽提法、煮沸法和去污剂裂解法。前两种方法比较剧烈，适用于较小的质粒（两种方法比较剧烈，适用于较小的质粒（8）下有活性。）下有活性。 葡萄糖葡萄糖增加溶液的增加溶液的粘度粘度，维持，维持渗透压渗透压，防止，防止DNA受受机械力（震荡）的作

2、用而降解。机械力（震荡）的作用而降解。11EDTAMg2+、Ca2+的螯合剂，可抑制的螯合剂，可抑制DNA酶酶的活性，防止的活性，防止DNA被酶降解。被酶降解。NaOH-SDSNaOH：强碱，提供：强碱，提供pH12的碱性条件，使的碱性条件，使DNA双链双链变性变性。 SDS：溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白，并结合成：溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白，并结合成“蛋蛋白白-SDS”复合物复合物，使蛋白质（包括，使蛋白质（包括DNA酶）变性沉淀。酶）变性沉淀。 12冰醋酸把醋酸钾溶液的冰醋酸把醋酸钾溶液的pH调到调到4.8。 用来用来中和中和NaOH变性液，使变性液，使DNA复性。复性。高浓度的高浓度的Na

3、Ac有利于变性的大分子（蛋白质、有利于变性的大分子（蛋白质、DNA、RNA等）沉淀。等）沉淀。用于用于沉淀沉淀DNA。 乙醇乙醇DNA分子以水合状态分子以水合状态“溶于溶于”水里，乙醇能夺去水里，乙醇能夺去DNA分子的水环境。分子的水环境。 KAc-HAc缓冲液缓冲液13 RNase A降解降解RNA渣滓。渣滓。 以免提取后的以免提取后的DNA中含有小分子的中含有小分子的RNA。 TE缓冲液缓冲液DNA保存保存液。液。 由由Tris-HCl和和EDTA配制。配制。 Tris-HCl不含金属离子（不同于磷酸缓冲液或硼不含金属离子（不同于磷酸缓冲液或硼酸缓冲液），有利于以后操作；酸缓冲液），有利于

4、以后操作； EDTA抑制抑制DNA酶，防止酶，防止DNA被酶降解。被酶降解。14蛋白变性剂蛋白变性剂，进一步抽提，进一步抽提DNA溶液中的蛋白质，溶液中的蛋白质，使蛋白质沉淀。使蛋白质沉淀。 但苯酚会残留在但苯酚会残留在DNA溶液中。溶液中。 （现多用各种商品化的（现多用各种商品化的层析柱层析柱纯化纯化DNA)。 酚酚-氯仿氯仿选用选用以上试剂有商业试剂盒；也以上试剂有商业试剂盒；也可以自己配制。可以自己配制。15碱抽提法提取质粒碱抽提法提取质粒DNA的步骤的步骤 Solution I 的配制：的配制：使用使用“溶液溶液”溶解细菌细胞壁。溶解细菌细胞壁。第一步：溶菌第一步：溶菌50mM葡萄糖，

5、葡萄糖， 25mM Tris-HCl (pH8.0)， 10mM EDTA， 4-5mg/ml溶菌酶溶菌酶， RNase A一次配置一次配置100ml，灭菌后，灭菌后4度保存。度保存。16溶液溶液II 破坏细胞膜，蛋白质和破坏细胞膜，蛋白质和DNA变性。变性。第二步：破膜，蛋白质和第二步：破膜，蛋白质和DNA变性变性Solution II 的配制的配制(现用现配，室温使用现用现配，室温使用)：第三步：中和第三步：中和溶液溶液III使使DNA复性、并促使蛋白质复性、并促使蛋白质-SDS复合物复合物和染色体和染色体DNA、RNA沉淀。沉淀。Solution III的配制：的配制：0.2N NaOH

6、，1.0%SDS3M 乙酸钾（用冰乙酸调乙酸钾（用冰乙酸调pH至至4.8）17上清液中含有闭合质粒上清液中含有闭合质粒DNA。第四步：离心除去沉淀第四步：离心除去沉淀0.6倍体积的异丙醇或倍体积的异丙醇或2倍体倍体积的积的无水乙醇无水乙醇。第五步：纯化第五步：纯化DNA上清液上清液过柱过柱或酚或酚-氯仿抽提。氯仿抽提。第六步：沉淀第六步：沉淀DNA182.使用试剂盒提取质粒使用试剂盒提取质粒DNA19市售的质粒提取试剂盒大都采用碱抽提法，不市售的质粒提取试剂盒大都采用碱抽提法，不同之处在于纯化方式。目前比较常用的纯化系同之处在于纯化方式。目前比较常用的纯化系统是硅基质吸附材料。统是硅基质吸附材

7、料。原理：原理：在高盐环境下质粒在高盐环境下质粒DNA能够结合到硅基质上，然能够结合到硅基质上，然后用低盐缓冲液或水将质粒后用低盐缓冲液或水将质粒DNA从硅基质上洗脱从硅基质上洗脱下来。得到的质粒可以用于酶切、下来。得到的质粒可以用于酶切、PCR、测序、测序、转化转染等分子生物学下游实验。转化转染等分子生物学下游实验。20天根生化质粒提取试剂盒提取流程天根生化质粒提取试剂盒提取流程2122最重要的是：最重要的是：菌株的遗传背景，菌株的遗传背景， 质粒自身的拷贝数。质粒自身的拷贝数。一般要使用一般要使用endA基因发生突变的大肠杆菌菌株。基因发生突变的大肠杆菌菌株。如如DH5 、JM109、XL

8、1-Blue等。等。（1）受体菌株）受体菌株endA基因编码基因编码核酸内切酶核酸内切酶，在，在Mg2+的存在的存在下可将双链下可将双链DNA消化成消化成7bp的寡核苷酸片断。的寡核苷酸片断。影响质粒影响质粒DNA产量的因素产量的因素23这是直接决定这是直接决定DNA产量的重要因素之一。产量的重要因素之一。（3）质粒大小）质粒大小分子量大的质粒，拷贝数少。分子量大的质粒，拷贝数少。（2）质粒拷贝数）质粒拷贝数质粒本身的性质所决定。质粒本身的性质所决定。24若干常用质粒的理论产量若干常用质粒的理论产量质粒名质粒名分子大小分子大小bp拷贝数拷贝数质粒产量质粒产量 g/ml pGEM pUC pBR

9、322 ColE1 pACYC pSC1012700 2700 4400 4500 4000 9000300-700 500-700 25 15 10 61.8-4.1 2.9-4.1 0.32 0.15 0.09 0.1225 一般过程及原理：一般过程及原理： 1. 细菌基因组细菌基因组DNA的制备的制备（1）细胞裂解）细胞裂解物理方法：物理方法： 以机械力的方法打破细胞外的屏障以机械力的方法打破细胞外的屏障化学方法：化学方法： 将细胞暴露在能够对细胞整体结构产生影响的化学药物中，将细胞暴露在能够对细胞整体结构产生影响的化学药物中，包括一种能够攻击细胞壁的成分和一种能够除去细胞膜的成分包括一

10、种能够攻击细胞壁的成分和一种能够除去细胞膜的成分常用于大肠杆菌的裂解液成分：常用于大肠杆菌的裂解液成分：10%SDS、EDTA和溶菌酶和溶菌酶二、基因组二、基因组DNA的提取的提取26（2）DNA纯化纯化细菌提取物包含：细菌提取物包含： DNA; 大量的蛋白质和大量的蛋白质和RNA（属于多余成分）属于多余成分）去蛋白质的标准方法：去蛋白质的标准方法： 加入苯酚加入苯酚; 或或1:1的苯酚与氯仿的混合物。的苯酚与氯仿的混合物。原理：能沉淀出蛋白质但仍保留核酸原理：能沉淀出蛋白质但仍保留核酸(DNA和和RNA)在在水溶液中。水溶液中。27v结果：结果：v细胞提取物和有机溶剂逐渐混合并离心后，沉淀细

11、胞提取物和有机溶剂逐渐混合并离心后，沉淀出的蛋白质分子会聚集在水溶液和有机溶剂分层出的蛋白质分子会聚集在水溶液和有机溶剂分层的两相界面处形成白色的凝集物的两相界面处形成白色的凝集物,水溶液中的核酸水溶液中的核酸分子就能够用吸管分离出来。分子就能够用吸管分离出来。2829v一些一些RNA分子，特别是分子，特别是mRNA，会在苯酚处理过，会在苯酚处理过程中被除去，但是绝大多数的程中被除去，但是绝大多数的RNA都和都和DNA一起一起保留在水溶液中。保留在水溶液中。v最有效的除去最有效的除去RNA的方法：的方法：使用核糖核酸酶，它能够迅速降解使用核糖核酸酶，它能够迅速降解RNA分子，把分子，把它们变成

12、单核苷酸它们变成单核苷酸30v常用：无水乙醇、异丙醇常用：无水乙醇、异丙醇v乙醇沉淀法的额外优点是将短链和单体核酸成分乙醇沉淀法的额外优点是将短链和单体核酸成分留在了溶液中。核糖核酸酶处理产生的核苷酸因留在了溶液中。核糖核酸酶处理产生的核苷酸因此在这一步得到了去除。此在这一步得到了去除。（3）沉淀）沉淀DNA313233 一般过程及原理：一般过程及原理：动物组织剪成小块，动物组织剪成小块，匀浆匀浆或置或置液氮液氮中冻结后中冻结后研磨研磨成细粉末。成细粉末。 组织培养的细胞用组织培养的细胞用胰酶胰酶消化松散后直接使用。消化松散后直接使用。（1）组织粉碎）组织粉碎2. 哺乳动物细胞基因组哺乳动物细

13、胞基因组DNA的抽提的抽提340.5%SDS和和0.1mg/ml蛋白酶蛋白酶K。50 oC温育。温育。（2）细胞裂解）细胞裂解（3）纯化）纯化DNA用苯酚和酚用苯酚和酚-氯仿抽提除去蛋白质污染。氯仿抽提除去蛋白质污染。SDS是离子型去垢剂（是离子型去垢剂（detergent），可以使），可以使细胞膜崩解。细胞膜崩解。（5）除去）除去RNA污染污染RNase。无水乙醇（可以加入无水乙醇（可以加入1/10体积的体积的3M乙酸铵乙酸铵辅助沉淀）辅助沉淀）异丙醇异丙醇（4）沉淀）沉淀DNA35 一般过程及原理：一般过程及原理： （1）组织粉碎）组织粉碎用用液氮液氮冷冻后冷冻后研磨研磨成细粉末。成细粉末

14、。3. 从植物组织中制备从植物组织中制备 DNA（2）细胞裂解）细胞裂解用用2%CTAB/2-ME (十六烷基三甲基溴化铵十六烷基三甲基溴化铵/2巯基乙醇）。巯基乙醇）。 或或1% SDS和蛋白酶和蛋白酶K。 65oC温育温育1h左右。左右。2% CTAB抽提缓冲液：抽提缓冲液：CTAB 10 g；5 M NaCl 140 ml；0.5 M EDTA 25 ml；1 M Tris-Cl（pH 8.0） 50 ml；加；加ddH2O定容至定容至500 ml。 36用用0.6倍体积的倍体积的异丙醇异丙醇（3）纯化）纯化DNA用苯酚和酚用苯酚和酚-氯仿抽提除去蛋白质污染。氯仿抽提除去蛋白质污染。（4

15、）沉淀）沉淀DNA（5）除去）除去RNA污染污染用用RNase A。（可以加入（可以加入1/10体积的体积的3M醋酸氨辅助沉淀）醋酸氨辅助沉淀） 。37三、噬菌体三、噬菌体DNA的提取的提取v噬菌体噬菌体DNA一般都是从噬菌体颗粒中制得，不从一般都是从噬菌体颗粒中制得，不从被侵染细胞中制得，因此不存在被细菌被侵染细胞中制得，因此不存在被细菌DNA污染污染的问题。的问题。v但除去噬菌体衣壳过程中需要用到专门技术。但除去噬菌体衣壳过程中需要用到专门技术。 一个例外：一个例外：M13噬菌体的双链复制模式，像细菌噬菌体的双链复制模式，像细菌质粒一样，质粒一样，M13噬菌体噬菌体DNA也能够从被侵染的大

16、也能够从被侵染的大肠杆菌中获得。肠杆菌中获得。38v噬菌体颗粒能够从被侵染细菌的细胞外培养基中噬菌体颗粒能够从被侵染细菌的细胞外培养基中大量获得。大量获得。v当这样的培养物被离心时，细菌聚集成小球沉淀当这样的培养物被离心时，细菌聚集成小球沉淀在离心管的底部，把噬菌体颗粒留在了悬液中在离心管的底部，把噬菌体颗粒留在了悬液中,噬噬菌体颗粒接着被从悬液中收集起来。菌体颗粒接着被从悬液中收集起来。v噬菌体噬菌体DNA需要经过一个去除蛋白的步骤以除去需要经过一个去除蛋白的步骤以除去蛋白衣壳后才能够得到。蛋白衣壳后才能够得到。3940v溶源性溶源性噬菌体的制备：噬菌体的制备：v被侵染培养物主要是由含有已经

17、整合到细菌染色被侵染培养物主要是由含有已经整合到细菌染色体的前噬菌体的细胞所组成，在这种环境下，细体的前噬菌体的细胞所组成，在这种环境下，细胞外的胞外的噬菌体浓度非常低。为了得到高产量的噬菌体浓度非常低。为了得到高产量的细胞外细胞外噬菌体，培养物必须被诱导，以使所有噬菌体，培养物必须被诱导，以使所有细菌进入侵染循环中的溶解阶段，导致细胞死亡细菌进入侵染循环中的溶解阶段，导致细胞死亡并将并将噬菌体颗粒释放到培养基中噬菌体颗粒释放到培养基中1. 噬菌体噬菌体DNA的抽提的抽提4142v非溶源性非溶源性噬菌体的制备噬菌体的制备v绝大多数的噬菌体都是溶源性噬菌体，但很多源绝大多数的噬菌体都是溶源性噬菌

18、体，但很多源自自噬菌体的克隆载体都经过了改造，切除了一噬菌体的克隆载体都经过了改造，切除了一些基因以消除细菌的溶源性。因此这些噬菌体就些基因以消除细菌的溶源性。因此这些噬菌体就不能够整合到细菌基因组中，并且只能够通过细不能够整合到细菌基因组中，并且只能够通过细菌溶解循环来侵染细胞。菌溶解循环来侵染细胞。43v存在的问题：噬菌体在细胞分裂达到其最大分裂存在的问题：噬菌体在细胞分裂达到其最大分裂速度之前加入，所有细胞都会立刻溶解，这样得速度之前加入，所有细胞都会立刻溶解，这样得到的噬菌体浓度非常低。另一方面，如果细胞密到的噬菌体浓度非常低。另一方面，如果细胞密度太高的情况下加入噬菌体，培养物不能够

19、彻底度太高的情况下加入噬菌体，培养物不能够彻底溶解，所得的噬菌体浓度也比较低。溶解，所得的噬菌体浓度也比较低。4445噬菌体颗粒在上清液中噬菌体颗粒在上清液中 一般过程及原理：一般过程及原理：（1）离心收集噬菌体颗粒）离心收集噬菌体颗粒（2）聚乙二醇）聚乙二醇(PEG)沉淀噬菌体颗粒沉淀噬菌体颗粒聚乙二醇是一种长链多聚化合物，在盐存在下，能够聚乙二醇是一种长链多聚化合物，在盐存在下，能够吸收水分，使像噬菌体颗粒这样的大分子聚集沉淀吸收水分，使像噬菌体颗粒这样的大分子聚集沉淀（3）重悬噬菌体颗粒）重悬噬菌体颗粒收集并在一个适当的小体积中重新溶解收集并在一个适当的小体积中重新溶解46（4）CsCl

20、密度梯度离心密度梯度离心47（5）透析除去）透析除去CsCl48（6）除去蛋白质）除去蛋白质有机溶剂法、酶法有机溶剂法、酶法（7）沉淀）沉淀DNA无水乙醇、异丙醇无水乙醇、异丙醇492. M13噬菌体噬菌体DNA的抽提的抽提v被侵染培养物的生长；被侵染培养物的生长；v离心沉淀细菌；离心沉淀细菌；vPEG沉淀噬菌体颗粒；沉淀噬菌体颗粒；v苯酚抽提分离噬菌体蛋白外壳；苯酚抽提分离噬菌体蛋白外壳；v乙醇沉淀浓缩制得乙醇沉淀浓缩制得DNA。 一般过程及原理：一般过程及原理：50511. 紫外光谱法紫外光谱法DNA（或（或 RNA）在）在260nm波长处有特异的紫波长处有特异的紫外吸收峰。外吸收峰。用微

21、量比色杯（用微量比色杯（10 l）在紫外分光光度计）在紫外分光光度计直接测定。直接测定。原理：原理：蛋白质在蛋白质在280nm处有吸收峰处有吸收峰四、四、DNA的定量和纯度测定的定量和纯度测定5253溴化乙锭（溴化乙锭（EB）能插入）能插入DNA分子中，紫外分子中，紫外光照射下能发光照射下能发 红色荧光红色荧光。2. 琼脂糖凝胶电泳估计琼脂糖凝胶电泳估计原理：原理：与与已知浓度已知浓度的的DNA电泳带荧光强度电泳带荧光强度对比对比，就，就可以估计出可以估计出DNA含量。含量。54一般使用琼脂糖凝胶电泳，与一般使用琼脂糖凝胶电泳，与已知分子量已知分子量的的DNA标准混合液标准混合液对比对比得知。

22、得知。DNA分子量分子量Marker有许多公司的商品，使用非常有许多公司的商品，使用非常方便。如方便。如 DNA的的Hind 酶切物等。酶切物等。五、五、DNA分子量的估计分子量的估计MarkerMarker55DNA ladder28kb2500bp2300bp1300bp900bp750bp200bp5000bp20kb1000bp900bp800bp700bp600bp500bp400bp300bp200bp100bpDNA Marker5657总总RNA的提取与纯化的提取与纯化 不同丰度不同丰度组织名称组织名称样品量样品量总总RNA含量含量高丰度高丰度肝脏肝脏1mg2-4g脾脏脾脏1m

23、g心脏心脏1mg中丰度中丰度大脑大脑1mg0.05-2g胚胎胚胎1mg肾脏肾脏1mg肺肺1mg低丰度低丰度膀胱膀胱1mg0-0.05g骨骨1mg脂肪脂肪1mg高丰度高丰度成纤细胞成纤细胞1050.5-1g人白细胞人白细胞105中丰度中丰度酵母酵母1050.5-1.5g拟南芥叶片拟南芥叶片1mg0.2-0.5g低丰度低丰度烟草叶片烟草叶片1mg0.05-0.1g玉米叶片玉米叶片1mgRNA分布分布58RNA提取注意事项提取注意事项制备制备RNA的关键的关键防止内外源防止内外源RNase的作用的作用RNase的特点：抗酸抗碱的特点：抗酸抗碱,具很广具很广pH作用范围作用范围; 抗高温严寒抗高温严寒

24、(0-65均具活性）均具活性） 抗变性剂抗变性剂59RNA提取注意事项提取注意事项体内体内RNase 样品取材要新鲜，并且在液氮或样品取材要新鲜，并且在液氮或-70冰箱中冻存。冰箱中冻存。 RNA提取试剂的选择，提取试剂的选择，TRIzol Reagent 或试剂盒。或试剂盒。 匀浆器或是研钵；破碎细胞要快速；尽量在低温下进行。匀浆器或是研钵；破碎细胞要快速；尽量在低温下进行。体外体外RNase 空气中的空气中的RNase 试剂中带有的试剂中带有的RNase 实验耗材实验耗材1. 实验者本身实验者本身60解决办法：解决办法：外源外源RNase高温，高温，焦碳酸二乙酯焦碳酸二乙酯(DEPC)处处

25、理所有溶液，（理所有溶液，（TrisHCl除外）和器皿，操作除外）和器皿，操作者带手套者带手套内源内源RNase高温抽提，强蛋白质变性剂，高温抽提，强蛋白质变性剂，RNase抑制剂，蛋白酶抑制剂，蛋白酶K等等 61vDEPC有刺激性，对眼睛气道粘膜有强刺激，在有刺激性，对眼睛气道粘膜有强刺激，在操作中应尽量在通风的条件下进行，操作中应尽量在通风的条件下进行，DEPC毒性毒性并不是很强，但吸入的毒性是最强的，使用时戴并不是很强，但吸入的毒性是最强的，使用时戴口罩，不小心占到手上注意立即冲洗。口罩，不小心占到手上注意立即冲洗。v高温高压高温高压121， 15min， DEPC即降解成二氧即降解成二氧化碳和水化碳和水62总总RNA的提取与纯化的提取与纯化一般流程：一般流程： 1、样本前处理、样本前处理 2、细胞裂解释放、细胞裂解释放RNA 3、RNA的纯化及获得的纯化及获得 4、RNA质量检测质量检测 63样品前处理样品前处理新鲜血液，不超过新鲜血液，不超过4小时小时新鲜的幼嫩组织新鲜的幼嫩组织生长旺盛期的细胞生长旺盛期的细胞生长旺盛的新鲜组织生长旺盛的新鲜组织64细胞裂解释放细胞裂解释放RNAv异硫氰酸胍异硫氰酸胍/酚酚TRIzol总总RNA提取试剂提取试剂v胍盐胍盐/-巯基乙醇巯基乙