qPCR实时荧光定量PCRppt课件

1、1.实时荧光定量PCR技术原理及特点 实时荧光定量PCR是将荧光能量传送技术(fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)运用于常规PCR仪中,指在PCR反响体系中参与荧光基团或荧光染料,利用荧光信号积累,从而实时监测整个PCR过程,最后经过规范曲线对未知模板浓度进展定量分析的方法 。1.1 根本原理 在实时荧光定量PCR中,对整个PCR反响扩增过程进展了实时的监测和延续地分析扩增相关的荧光信号,随着反响时间的进展,监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。 在PCR反响早期,产生荧光的程度不能与背景明显地域别,而后荧光的产生进入指数期、线性期和最终的平台

2、期。FQ-PCR可行性定量是在PCR扩增的指数期进展的。首先需设定一定荧光信号的域值,普通这个域值是以PCR反响的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号,荧光域值的缺省设置是315个循环的荧光信号的规范偏向的10倍。域值域值Ct 假设检测到荧光信号超越域值那么被以为是真正的信号,它可用于定义样本的域值循环数(Ct)。 Ct(cyclethreshold)值的含义是:每个反响管内的荧光信号到达设定的域值时所阅历的循环数。 研讨阐明,每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,Ct值随着起始模板量的添加而线性降低,利用知起始拷贝数的规范品可作出规范曲线。其中横坐标代表起始拷贝数的对数，

3、纵坐标代Ct值。因此只需获得未知样品的Ct值,即可从规范曲线上计算出该样品的起始拷贝数。1.2 化学反响原理 根据反响中所选荧光物质的不同,实时荧光定量PCR的化学反响原理通常分为荧光染料和荧光探针两种:(1) SYBR荧光染料:SYBR是一种与双链DNA小沟结合的染料。在PCR反响体系中,参与过量SYBR荧光染料, SYBR荧光染料特异性掺入DNA双链后,发射荧光信号,而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号,从而保证荧光信号的添加与PCR产物的添加完全同步。(2)TaqMan荧光探针:该探针是一种寡核苷酸探针。 PCR扩增时在参与一对引物的同时参与一个特异性的荧光探针,两端分别标

4、志一个荧光基团和一个淬灭基团。当探针与靶序列配对时,荧光基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收。PCR扩增时,Taq酶的5-3外切酶活性将探针酶切降解,使荧光基团和淬灭基团分别,从而荧光监测系统可接纳到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子构成,实现了荧光信号的累积与PCR产物构成完全同步。1.3 特点 普通PCR产物都需求经过琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭EB染色紫外光察看结果或经过聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染检测,不仅需求多种仪器,而且费时费力,所运用的染色剂溴化乙锭对人体又有害处,在这繁杂的实验过程中会带来假阳性的污染。而荧光定量PCR抑制了常规PCR的许多缺陷,有着如下显著的优点:(1)特异性好。运用针对靶序列设计的特异性探针对定量分子进展识别,具有很高的准确性。同时,靶序列由引物和探针双重控制,特异性好、假阳性低。(2)灵敏度高。荧光定量PCR检测技术是综合了PCR技术、荧光标志技术、激光技术、数码显像技术为一体的技术,因此大大提高了其检测灵敏度。(3)线性关系好、线性范围宽。由于荧光信号的产生和每次扩增产物成一一对应的关系,经过荧光信号的检测可以直接对产物进展定量。(4)操作简单、平安、自动化程度高、防污染。扩增和检测在全封锁的同一管内检测,不需求开盖,降低了溴化乙锭的污染。同时扩增和检测一步完成,不需求后期处置,不再需