谷蛋白提取实验

1、实验一实验一 小麦高分子量谷蛋白亚基小麦高分子量谷蛋白亚基（HMW-GSHMW-GS）的提取）的提取一、实验目的一、实验目的了解小麦了解小麦HMW-GSHMW-GS提取及提取及SDS-PAGESDS-PAGE原理。原理。掌握小麦掌握小麦HMW-GSHMW-GS提取及提取及SDS-PAGESDS-PAGE方法。方法。小麦小麦HMW-GS变异类变异类型型图图1 1 以中国春（以中国春（CSCS）为基准的各种小麦）为基准的各种小麦HMW-GSHMW-GS的的SDS-PAGESDS-PAGE谱带及谱带及亚基的编号（亚基的编号（a a、b b、c c、d d等）（等）（Payne lawrence,19

2、83Payne lawrence,1983）二、实验原理二、实验原理变性剂变性剂SDSSDS破坏蛋白质分子结构。破坏蛋白质分子结构。强还原剂巯基乙醇使半胱氨酸残强还原剂巯基乙醇使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂，裂解后的基之间的二硫键断裂，裂解后的氨基酸侧链和氨基酸侧链和SDSSDS充分结合形成充分结合形成带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质-SDS-SDS胶束。胶束。蛋白质蛋白质-SDS-SDS胶束在水溶液中的形胶束在水溶液中的形状像一个长椭圆棒，椭圆棒的短状像一个长椭圆棒，椭圆棒的短轴对不同的蛋白质亚基轴对不同的蛋白质亚基-SDS-SDS胶束胶束基本是相同的，但长轴的长度则基本是相同的，但长轴的长

3、度则与亚基分子量的大小成正比。与亚基分子量的大小成正比。胶束在胶束在SDS-PAGESDS-PAGE中的电泳迁移中的电泳迁移率主要取决于椭圆棒的长轴长度，率主要取决于椭圆棒的长轴长度，即蛋白质或亚基分子量的大小。即蛋白质或亚基分子量的大小。SDSSDS电泳不仅可以分离蛋白质，电泳不仅可以分离蛋白质，而且可以根据迁移率的大小测定而且可以根据迁移率的大小测定蛋白质亚基的分子量。蛋白质亚基的分子量。图1 蛋白质样品用SDS和还原剂处理后解聚成亚基不连续电泳包括两种不同孔径的凝胶：浓缩胶和分离胶。不连续电泳包括两种不同孔径的凝胶：浓缩胶和分离胶。浓缩胶：凝胶浓度较小，孔径相对较大，把较稀的样品加在浓浓

4、缩胶：凝胶浓度较小，孔径相对较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过较大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的缩胶上，经过较大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带，使样品组分在分离胶中得以高分辨率的分离。区带，使样品组分在分离胶中得以高分辨率的分离。分离胶：又称电泳胶，通常孔径较小，通过选择合适的凝胶浓分离胶：又称电泳胶，通常孔径较小，通过选择合适的凝胶浓度，使样品组分得以很好的分离。分离胶又可为均一胶和梯度度，使样品组分得以很好的分离。分离胶又可为均一胶和梯度胶。本实验用的是均一胶。胶。本实验用的是均一胶。二、实验原理二、实验原理图2 SDS不连续电泳（分离胶为均匀胶）1. 1. 实验仪器

5、实验仪器 稳压稳流电泳仪及配套电泳槽、摇床、稳压稳流电泳仪及配套电泳槽、摇床、 台式离心机、微量移液器、台式离心机、微量移液器、 电子天平电子天平2. 2. 实验试剂实验试剂 样品提取液、样品提取液、1.5M Tris-HCl(pH8.8)1.5M Tris-HCl(pH8.8)溶液、溶液、0.5M Tris-HCl(pH6.8)0.5M Tris-HCl(pH6.8)溶液、溶液、30% Acr-30% Acr-0.8% Bis0.8% Bis溶液溶液 、10% SDS10% SDS溶液、溶液、1.5% 1.5% 过过硫酸铵溶液、硫酸铵溶液、 Tris- Tris-甘氨酸电极缓冲液、考马斯亮兰

6、染甘氨酸电极缓冲液、考马斯亮兰染色液色液 三、实验仪器和实验试剂三、实验仪器和实验试剂2. 实验试剂实验试剂1 1 样品提取母液样品提取母液: 6g SDS(十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠)+37.5ml 0.5M Tris-HCl（pH6.8） +30.0mg溴酚兰溴酚兰+17.4ml蒸馏水蒸馏水+30ml甘油甘油2 样品提取液样品提取液: 27.2ml样品提取母液样品提取母液+ 4.8ml -巯基乙醇巯基乙醇+64ml蒸馏水蒸馏水3 1.5M Tris-HCl(pH8.8)溶液溶液:18.17g Tris 溶于溶于40ml水中，加浓水中，加浓HCl调调pH至至8.8，定容到，定容到100ml

7、4 0.5M Tris-HCl(pH6.8)溶液溶液:6.05g Tris溶于溶于40ml水中，加浓水中，加浓HCl调调pH 至至6.8，定容到，定容到100ml5 30% Acr(丙烯酰胺丙烯酰胺)-0.8% Bis(N, N-甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺)溶液溶液: 30gAcr+0.8gBis溶于溶于40ml水中，定容到水中，定容到100ml6 10% SDS溶液溶液:10g SDS加加40ml蒸馏水溶解，定容到蒸馏水溶解，定容到100ml7 1.5% 过硫酸铵（过硫酸铵（AP）溶液）溶液:0.15g AP溶于溶于10ml蒸馏水中，现用现配。蒸馏水中，现用现配。8 Tris-甘氨酸电极缓

8、冲液甘氨酸电极缓冲液:3.032g Tris+1g SDS+14.4g甘氨酸甘氨酸,定至定至1000ml9 考马斯亮兰染色液考马斯亮兰染色液:250ml甲醇甲醇+100ml乙酸乙酸+0.6g考马斯亮兰考马斯亮兰+250ml蒸馏水蒸馏水10 脱色液脱色液:50ml甲醇甲醇+50ml乙酸乙酸+400ml蒸馏水；也可以直接用自来水作蒸馏水；也可以直接用自来水作脱色液脱色液四、实验步骤四、实验步骤1.将小麦籽粒砸碎放入将小麦籽粒砸碎放入1.5ml离心管离心管2.加入加入400ul 50%异丙醇溶液，异丙醇溶液，60水浴水浴30min，其，其间摇晃间摇晃2次。次。10000rpm离心离心3min，弃上清

9、液，弃上清液3.重复以上步骤重复以上步骤2次次4.加入加入100ul提取液提取液B1（50%异丙醇异丙醇+0.3%二硫代苏二硫代苏糖醇），糖醇），60水浴水浴30min5.加入加入100ul提取液提取液B2（50%异丙醇异丙醇+1.4%（v/v）4-乙烯基吡啶），乙烯基吡啶），60水浴水浴1h，10000rpm离心离心10min6.把把160ul上清液转移到新的离心管中，并在其中加上清液转移到新的离心管中，并在其中加600ul丙酮，放在丙酮，放在41.5-2h7.10000rpm离心离心10min，弃上清液，在沉淀中加入，弃上清液，在沉淀中加入100ul样品提取液，放置样品提取液，放置2h以上

10、，沉淀充分溶解后以上，沉淀充分溶解后即可使用。即可使用。 五五 制胶与电泳制胶与电泳（1 1）取一套或两套干净的制胶专用玻璃板，在制胶架上）取一套或两套干净的制胶专用玻璃板，在制胶架上 固定好固定好（2 2）先按照表）先按照表1 1的比例制好分离胶，摇匀后灌到玻璃板的比例制好分离胶，摇匀后灌到玻璃板 间，上端留间，上端留2.5cm2.5cm左右空间，加入蒸馏水；等待分离左右空间，加入蒸馏水；等待分离 胶凝结的时间里，按表胶凝结的时间里，按表2 2的比例制好浓缩胶预工作液的比例制好浓缩胶预工作液 （加入前四项）（加入前四项）表1 分离胶工作液的配制试剂试剂 单板单板30%Acr-0.8% Bis

11、溶液溶液13.3ml1.5MTris-HCl（pH8.8）10.0ml10% SDS0.4ml蒸馏水蒸馏水13.3ml1.5% AP3.0mlTEMED30l表2 浓缩胶工作液的配制试剂试剂 双板双板30% Acr-0.8% Bis溶液溶液2.5ml0.5M Tris-HCl（pH6.8）5.0ml10% SDS200l蒸馏水蒸馏水11.2ml1.5% AP1.0mlTEMED20l五五 制胶与电泳制胶与电泳（3 3）分离胶凝结后胶面与水面之间会出现清晰的界面，）分离胶凝结后胶面与水面之间会出现清晰的界面，此此 时将水倒出来，用滤纸把剩余的水吸干；在浓缩胶时将水倒出来，用滤纸把剩余的水吸干；在

12、浓缩胶预预 工作液中加入表工作液中加入表2 2中要求的中要求的1.5% AP1.5% AP及及TEMEDTEMED，混匀，混匀后后 灌进玻璃板内，迅速插入样梳灌进玻璃板内，迅速插入样梳（4 4）浓缩胶凝固后将其从制胶架上取下来，拔出样梳，）浓缩胶凝固后将其从制胶架上取下来，拔出样梳，用用 蒸馏水水将点样孔冲干净；将胶板夹在电泳槽上，蒸馏水水将点样孔冲干净；将胶板夹在电泳槽上，在在 电泳槽的倒入电极缓冲液，上样量为电泳槽的倒入电极缓冲液，上样量为4ul4ul（5 5）接通电源，每板胶稳流）接通电源，每板胶稳流12-15mA12-15mA，指示剂出胶后，指示剂出胶后再跑再跑2 2 h h，停止电泳

13、；，停止电泳；（6 6）揭开玻璃板，切下浓缩胶，将分离胶放到染色液）揭开玻璃板，切下浓缩胶，将分离胶放到染色液内，内， 染色染色15-3015-30分钟（视染色液新旧而定）；然后用脱色分钟（视染色液新旧而定）；然后用脱色 液或水脱色至背景清晰。液或水脱色至背景清晰。51021217187912*13168六 实验结果1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18不连续电泳包括两种不同孔径的凝胶：浓缩胶和分离胶。不连续电泳包括两种不同孔径的凝胶：浓缩胶和分离胶。浓缩胶：凝胶浓度较小，孔径相对较大，把较稀的样品加在浓浓缩胶：凝胶浓度较小，孔径相对较大，把较

14、稀的样品加在浓缩胶上，经过较大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的缩胶上，经过较大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带，使样品组分在分离胶中得以高分辨率的分离。区带，使样品组分在分离胶中得以高分辨率的分离。分离胶：又称电泳胶，通常孔径较小，通过选择合适的凝胶浓分离胶：又称电泳胶，通常孔径较小，通过选择合适的凝胶浓度，使样品组分得以很好的分离。分离胶又可为均一胶和梯度度，使样品组分得以很好的分离。分离胶又可为均一胶和梯度胶。本实验用的是均一胶。胶。本实验用的是均一胶。二、实验原理二、实验原理图2 SDS不连续电泳（分离胶为均匀胶）1. 1. 实验仪器实验仪器 稳压稳流电泳仪及配套电泳槽、摇床、稳压稳流电泳仪及配套电泳槽、摇床、 台式离心机、微量移液器、台式离心机、微量移液器、 电子天平电子天平2. 2. 实验试剂实验试剂 样品提取液、样品提取液、1.5M Tris-HCl(pH8.8)1.5M Tris-HCl(pH8.8)溶液、溶液、0.5M Tris-HCl(pH6.8)0.5M Tris-HCl(pH6.