无毒苗木培养

1、13 植物脱毒技术植物脱毒技术13.1 引言引言 多数农作物多易受一种或一种以上多数农作物多易受一种或一种以上病毒的周身侵染。例以知草莓能感染病毒的周身侵染。例以知草莓能感染62种病毒和类菌质体。种病毒和类菌质体。 无病毒植株产量最多可提高无病毒植株产量最多可提高300%（平均为（平均为30%） 由于大部分病毒都不是通过种子传由于大部分病毒都不是通过种子传 播的，因此若是使用未受侵染或侵染播的，因此若是使用未受侵染或侵染程度较轻的个体的种子进行繁殖就程度较轻的个体的种子进行繁殖就有可能得到无病毒植株。有可能得到无病毒植株。 病毒在植物体内的分布是不均匀病毒在植物体内的分布是不均匀的，在受侵染的

2、植物中，顶端分生的，在受侵染的植物中，顶端分生组织一般说或者是无毒的，或者只组织一般说或者是无毒的，或者只携带有浓度很低的病毒。携带有浓度很低的病毒。13.2 术语释义术语释义 “无病毒无病毒”植物一词只有当某些植物一词只有当某些病毒在特定的检验中为负结果时，病毒在特定的检验中为负结果时，才能说该植物不带有那些病毒。才能说该植物不带有那些病毒。13.3 通过热处理消除病毒通过热处理消除病毒热空气处理：把旺盛生长的植物移入到热空气处理：把旺盛生长的植物移入到一个热疗室中，在一个热疗室中，在3540。C下处理一段下处理一段时间即可。处理的时间的长短，可由几时间即可。处理的时间的长短，可由几分钟到数

3、周不等。因植物而异。分钟到数周不等。因植物而异。热处理时，最初几天空气温度应逐步增热处理时，最初几天空气温度应逐步增高，直到达到要求的温度为止。若钝化高，直到达到要求的温度为止。若钝化病毒所需要的连续高温处理会伤害寄主病毒所需要的连续高温处理会伤害寄主组织，则应当试验高低温交替的效果。组织，则应当试验高低温交替的效果。和单独采用热疗法相比，茎尖培养和单独采用热疗法相比，茎尖培养具更广泛的适用性。茎尖培养现在具更广泛的适用性。茎尖培养现在已成为消除病毒的一个很常用的手已成为消除病毒的一个很常用的手段。段。13.4 通过茎尖培养消除病毒通过茎尖培养消除病毒13.4.1 外植体的名称外植体的名称1、

4、在应用组织培养方法以获得无病原菌、在应用组织培养方法以获得无病原菌植物时，所用的外植体可以是茎尖，也植物时，所用的外植体可以是茎尖，也可以是茎的顶端分生组织。可以是茎的顶端分生组织。2、茎的顶端分生组织：指茎的最幼龄叶、茎的顶端分生组织：指茎的最幼龄叶原基上方的一部分，最大直径约为原基上方的一部分，最大直径约为100um，最大长度约为，最大长度约为250um。3、茎尖：是指由顶端分生组织、茎尖：是指由顶端分生组织及其下方的及其下方的13个幼叶原基一起个幼叶原基一起构成的。构成的。13.4.2 方法方法1、防止茎尖变干。、防止茎尖变干。2、最好先把供试植株种在无菌的盆土中，、最好先把供试植株种在

5、无菌的盆土中， 并放在温室中进行栽培。浇水时，水并放在温室中进行栽培。浇水时，水 要直接浇在土壤上，而不要浇在叶片要直接浇在土壤上，而不要浇在叶片 上。另外，最好还要给植株定期喷施上。另外，最好还要给植株定期喷施 内吸杀菌剂，如苯菌灵（内吸杀菌剂，如苯菌灵（0.1%）和）和 抗生素链霉素（抗生素链霉素（0.1%）的混合液）的混合液。3、在切取外植体之前一般仍需对茎芽进、在切取外植体之前一般仍需对茎芽进 行表面消毒。叶片包被严紧的芽，只行表面消毒。叶片包被严紧的芽，只 需在需在75%酒精浸醺一下，而叶片包酒精浸醺一下，而叶片包 被松散的芽，则要用被松散的芽，则要用0.1%的次氯酸的次氯酸 钠溶液

6、表面消毒钠溶液表面消毒10min。4、在剖取茎尖使要防止染、在剖取茎尖使要防止染菌。菌。5、有茎尖长出的新茎，若不能、有茎尖长出的新茎，若不能生根，则须把脱病毒的茎嫁接到生根，则须把脱病毒的茎嫁接到健康的砧木上。健康的砧木上。13.4.3 在茎尖培养中影响在茎尖培养中影响 脱毒效果的因素脱毒效果的因素13.4.3.1 培养基培养基 通过正确选择培养基，可以显著提高通过正确选择培养基，可以显著提高获得完整植株的成功率，所应考虑的培获得完整植株的成功率，所应考虑的培养基的主要性质是它的营养成分、生长养基的主要性质是它的营养成分、生长调节物质和物理状态。调节物质和物理状态。1、培养基中必须有一定量的

7、、培养基中必须有一定量的K+和和NH 4+。2、MS培养基使用于茎尖培养。培养基使用于茎尖培养。3、一般来说，含有少量（、一般来说，含有少量（0.1 0.5mg/L) 或者二者兼有常常是有利的。生长或者二者兼有常常是有利的。生长 素可能是由第而对幼叶原基形成的。素可能是由第而对幼叶原基形成的。 在洋紫苏、胡萝卜、烟草、旱金莲在洋紫苏、胡萝卜、烟草、旱金莲 以及一种百合植物中，要能成功的以及一种百合植物中，要能成功的 培养不带任何叶原基的分生组织外培养不带任何叶原基的分生组织外 植体，外源激素的存在是必不可少植体，外源激素的存在是必不可少的。在麝香石竹离体顶端分生组织培养的。在麝香石竹离体顶端分

8、生组织培养中，既需要生长素，也需细胞分裂素。中，既需要生长素，也需细胞分裂素。 在各种不同的生长素中，应当避免使用在各种不同的生长素中，应当避免使用2，4D，因为它通常能诱导外植体形，因为它通常能诱导外植体形成愈伤组织。广泛使用的生长素是成愈伤组织。广泛使用的生长素是NAAIAA，其中，其中NAA由于比较稳定，效果更由于比较稳定，效果更好。好。4、GA3培养基有作者认为能抑制愈培养基有作者认为能抑制愈伤组织的形成，有助于更好地生长伤组织的形成，有助于更好地生长和分化。然而其他一些作者却发现，和分化。然而其他一些作者却发现， GA3并没有什么显著作用，在高浓并没有什么显著作用，在高浓度时甚至有抑

9、制效应。度时甚至有抑制效应。13.4.3.2 外植体大小外植体大小1、外植体越大，产生再生植株的机、外植体越大，产生再生植株的机会也越多。小的外植体可能不利于会也越多。小的外植体可能不利于茎的生根。但外植体大小与脱毒效茎的生根。但外植体大小与脱毒效率呈负相关。外植体大小应小到足率呈负相关。外植体大小应小到足以能根除病毒，大到足以能发育成以能根除病毒，大到足以能发育成一个完整的植株。一个完整的植株。2、叶原基的存在与否也影响分生组、叶原基的存在与否也影响分生组织形成植株的能力。不带叶原基的织形成植株的能力。不带叶原基的顶端分生组织可能有利于形成完整顶端分生组织可能有利于形成完整的植株，但不利于脱

10、毒。故用较大的植株，但不利于脱毒。故用较大的带叶原基的茎尖做外植体比只用的带叶原基的茎尖做外植体比只用分生组织效果较好。分生组织效果较好。13.4.3.3 培养条件培养条件1、在茎尖培养中，一般照光培养的、在茎尖培养中，一般照光培养的 效果通常比暗培养好。但天竺葵效果通常比暗培养好。但天竺葵 茎尖培养使须一段时间的黑暗。茎尖培养使须一段时间的黑暗。2、对温度的要求，培养物通常都是、对温度的要求，培养物通常都是 放在标准的培养室温度下。放在标准的培养室温度下。 （25 。C +2 。C）13.4.3.4 外植体的生理状态外植体的生理状态1、茎尖最好要由活跃生长的芽上切取。、茎尖最好要由活跃生长的

11、芽上切取。为了增加脱毒植株的总数还是要采用腋为了增加脱毒植株的总数还是要采用腋芽，这是因为腋芽在每个枝条上有好几芽，这是因为腋芽在每个枝条上有好几个，而顶芽只有一个。个，而顶芽只有一个。2、取芽时间必须在生长旺盛的季节，不、取芽时间必须在生长旺盛的季节，不要在休眠期进行，若要在休眠期进行，要在休眠期进行，若要在休眠期进行，则必须采用某中适当的处理。则必须采用某中适当的处理。13.4.3.5 热疗法热疗法把茎尖培养和与热疗法结合起来，把茎尖培养和与热疗法结合起来，有利于或得脱病毒植株。热处理可有利于或得脱病毒植株。热处理可在切取茎尖之前在母株上进行，也在切取茎尖之前在母株上进行，也可以在茎尖培养

12、期间进行。但在切可以在茎尖培养期间进行。但在切取茎尖之前的母株上进行可切取较取茎尖之前的母株上进行可切取较大的外植体进行培养，效果更好。大的外植体进行培养，效果更好。要慎重处理热处理的时间。在菊花中，要慎重处理热处理的时间。在菊花中，热处理时间由热处理时间由10d增加到增加到30d，可使，可使无病毒植株百分数由无病毒植株百分数由9%增加到增加到90%，处理处理40d或更长并不能增加无毒植株的百或更长并不能增加无毒植株的百分数，反而减少形成植株的茎尖总数。主分数，反而减少形成植株的茎尖总数。主要是长时间的热处理除可消除病毒要是长时间的热处理除可消除病毒之外，也能钝化寄主组织中的抗病毒因子。之外，

13、也能钝化寄主组织中的抗病毒因子。如果连续进行高温处理会引起受如果连续进行高温处理会引起受处理寄主的损伤，可以试用昼夜处理寄主的损伤，可以试用昼夜或隔日高低温交替处理。或隔日高低温交替处理。13.4.3.6 化学疗法化学疗法1、生长调节物质能减少组织中病毒、生长调节物质能减少组织中病毒 的浓度，但不可能把它们消除。的浓度，但不可能把它们消除。2、据报道，用齿舌兰、据报道，用齿舌兰 (Odontlossum)环斑病毒抗血环斑病毒抗血 清预处理兰花的离体分生组织，清预处理兰花的离体分生组织， 增加了脱毒植株的频率。增加了脱毒植株的频率。3、一种抗病毒制剂、一种抗病毒制剂Virazole已知对已知对若

14、干种动物若干种动物DNA和和RNA病毒是病毒是有效的。有效的。4、在植物中，放线菌、在植物中，放线菌-D酮和放酮和放线菌也能抑制原生质体中病毒的线菌也能抑制原生质体中病毒的复制。复制。13.5通过愈伤组织培通过愈伤组织培养消除病毒养消除病毒在用机械方法由受在用机械方法由受TMV侵染的烟草愈伤侵染的烟草愈伤组织分离出来的单个细胞中，只有组织分离出来的单个细胞中，只有40%带有病毒。由受侵染的愈伤长一智中再带有病毒。由受侵染的愈伤长一智中再生出很多不含有生出很多不含有TMV的植株，这一事实的植株，这一事实也证明了愈伤组织中的某些细胞是不含也证明了愈伤组织中的某些细胞是不含病毒的。病毒的。在一个受到

15、在一个受到TMV侵染的叶片中，暗绿色侵染的叶片中，暗绿色的组织或者是不含病毒的，或者是病毒的组织或者是不含病毒的，或者是病毒浓度很低。由这些组织中切取浓度很低。由这些组织中切取1mm的外植体进行培养，在再生植株中的外植体进行培养，在再生植株中有有50%是无毒的。是无毒的。确定在植物组织中是否有病毒存在的最确定在植物组织中是否有病毒存在的最简单的方法，是检验叶和茎是否有该中简单的方法，是检验叶和茎是否有该中病毒所特有的可见症状。病毒所特有的可见症状。病毒的汁液感染法是一般用于检验病毒病毒的汁液感染法是一般用于检验病毒的所有方法中最为敏感的方法。具体介的所有方法中最为敏感的方法。具体介绍如下：绍如

16、下：由受检植株上取下叶片，置于等容积由受检植株上取下叶片，置于等容积（W/V）的缓冲液（）的缓冲液（0.1mol/L磷酸钠）磷酸钠）13.6 脱毒效果的检验脱毒效果的检验中，用研钵和研杆将叶片研碎。在指示中，用研钵和研杆将叶片研碎。在指示植物（对某种或某些特定病毒非常敏感植物（对某种或某些特定病毒非常敏感的植物）的叶片上撒上少许的植物）的叶片上撒上少许600号金刚号金刚砂，然后用受检植物的叶汁轻轻涂于其砂，然后用受检植物的叶汁轻轻涂于其上。适当用力摩擦，以使指示植物叶表上。适当用力摩擦，以使指示植物叶表面细胞受到侵染，但又不要损伤叶片。面细胞受到侵染，但又不要损伤叶片。大约大约5mm后，用水轻

17、轻洗去接种叶片上后，用水轻轻洗去接种叶片上的残余汁液。把接过种的指示植物放在的残余汁液。把接过种的指示植物放在一间温室或防蚜罩内，株间以及与其他一间温室或防蚜罩内，株间以及与其他植物间都要隔开一定的距离。取决植物间都要隔开一定的距离。取决于病毒的性质和液汁中病毒的数量，于病毒的性质和液汁中病毒的数量，大概需要大概需要68d或是几周，知指示植或是几周，知指示植物即可表现症状。物即可表现症状。检验植物中是否存在病毒的其他方检验植物中是否存在病毒的其他方法，还有血清测验法和电镜观察法。法，还有血清测验法和电镜观察法。13.7 无毒原种的保存无毒原种的保存为解决无毒植株有可能很快又被重为解决无毒植株有

18、可能很快又被重新感染，应将无毒原种种在田间的新感染，应将无毒原种种在田间的隔离区内，这样就较少有重新感染隔离区内，这样就较少有重新感染的机会。的机会。另外一种更容易的方法是，把茎尖另外一种更容易的方法是，把茎尖得到的并已经过脱毒检验的植物通得到的并已经过脱毒检验的植物通过离体培养进行繁殖和保存。过离体培养进行繁殖和保存。13.8脱毒植株的应用脱毒植株的应用1.通过把已知病毒引入无毒植株，并比通过把已知病毒引入无毒植株，并比较同一个无性系的感病株和无毒株的表较同一个无性系的感病株和无毒株的表现，可对病毒造成的产量损失做出更精现，可对病毒造成的产量损失做出更精确的估计。确的估计。2.茎尖培养产生的植株比未受过处理的茎尖培养产生的植株比未受过处理的生活力强，产生插条的数目多生活力强，产生插条的数目多20%-30%，而且这些插条很容易生根。，而且这些插条很容易生根。13.9病毒以外病原菌的消除方法病毒以外病原菌的消除方法外植体的反复转管或通过茎尖培养可消外植体的反复转管或通过茎尖培养可消除病毒以外的病原菌。除病毒以外的病原菌。13.9 通过茎尖培养消除通过茎尖培养消除 病毒的注意事项病毒的注意事项要想得到和繁殖一个品种的脱毒植株，要想得到和繁殖一个品种的脱毒植株，首先必须了解有关该种植物的一些背景首先必须了解有关该种植物的一些背景知识