高效液相色谱分析.

1、中国矿业大学化工学院 应化系 第二章第二章 高效液相色谱分析高效液相色谱分析High PertormanceHigh Pertormance Liquid Chromatography (HPLC) Liquid Chromatography (HPLC)基本要求：基本要求：1 1了解高效液相色谱的优点及适用范围了解高效液相色谱的优点及适用范围2 2理解常用检测器的原理、优缺点及适用范围理解常用检测器的原理、优缺点及适用范围3 3理解各种分离方式的原理，适用分析对象理解各种分离方式的原理，适用分析对象 及选择原则及选择原则 中国矿业大学化工学院 应化系2.1高效液相色谱法概述高效液相色谱法概述

2、 2.2 影响色谱峰扩展及色谱分离的因素影响色谱峰扩展及色谱分离的因素 2.3高效液相色谱法的主要类型及其分离原理高效液相色谱法的主要类型及其分离原理 2.4液相色谱法液相色谱法固定相固定相 2.5液相色谱法流动相液相色谱法流动相 2.6 高效液相色谱分离类型的选择高效液相色谱分离类型的选择2.7高效液相色谱仪高效液相色谱仪 中国矿业大学化工学院 应化系 21高效液相色谱法概述高效液相色谱法概述1 1 特点：特点：高压高压 高速高速 高效高效 高灵敏度高灵敏度 2 2HPLCHPLC与气相色谱法、经典液相色谱法差别：与气相色谱法、经典液相色谱法差别：（1） HPLCHPLC与气相色谱法差别与气

3、相色谱法差别 流动相流动相 操作条件操作条件 （2） HPLCHPLC与经典液相色谱法差别与经典液相色谱法差别 中国矿业大学化工学院 应化系中国矿业大学化工学院 应化系3 3适用范围适用范围 只要试样能制成只要试样能制成溶液溶液的物质原则上都可的物质原则上都可用用HPLCHPLC法进行分离，分析。法进行分离，分析。尤其适合于那些尤其适合于那些不宜用不宜用GCGC分析的难挥发物质，热不稳定物质分析的难挥发物质，热不稳定物质，离子型物质和生物大分子，离子型物质和生物大分子等。等。 中国矿业大学化工学院 应化系22 影响色谱峰扩展及色谱分离的因素影响色谱峰扩展及色谱分离的因素 1 1涡流扩散项涡流扩

4、散项HeHe 流动相碰到填充物颗粒时，不断改变流动方向流动相碰到填充物颗粒时，不断改变流动方向，使试样组分在流动相中形成类似，使试样组分在流动相中形成类似“涡流涡流”流动而流动而引起色谱峰扩张。引起色谱峰扩张。中国矿业大学化工学院 应化系dpHe2dp 填充物平均颗粒度（填充物平均颗粒度（m） 填充的不均匀性填充的不均匀性 因此使用适当细粒度和颗粒均匀的担体因此使用适当细粒度和颗粒均匀的担体，并填充均匀是成少涡流扩散，提高柱效的，并填充均匀是成少涡流扩散，提高柱效的有效途径。有效途径。中国矿业大学化工学院 应化系uDcHdmdcd 常数常数 Dm 分子在流动相中扩散系数分子在流动相中扩散系数u

5、 流动相线速。流动相线速。由于分子在液体中由于分子在液体中 Dm比气体中小比气体中小45数量级数量级 u0.5cm.s0.5cm.s-1-1时时HdHd很小可忽略。很小可忽略。 2 2纵向扩散项纵向扩散项Hd 试样分子在色谱柱内被流动相带向前时试样分子在色谱柱内被流动相带向前时由分子本来运动所引起纵向扩散引起色谱峰由分子本来运动所引起纵向扩散引起色谱峰扩张。扩张。 中国矿业大学化工学院 应化系3 3传质阻力项传质阻力项（1 1） 固定相传质阻力项固定相传质阻力项主要发生在液液分配色谱分析中。主要发生在液液分配色谱分析中。v固定相传质阻力固定相传质阻力：组分从两相界面扩散到固定相：组分从两相界面

6、扩散到固定相内部。达到分配平衡后又返回两相界面受到的阻力内部。达到分配平衡后又返回两相界面受到的阻力中国矿业大学化工学院 应化系 d df f固定液的液膜厚度固定液的液膜厚度 D Ds s试样分子在固定液内扩散系数试样分子在固定液内扩散系数 C Cs s与容量因子有关的系数与容量因子有关的系数 从上式可看出：从上式可看出： 使用薄的固定相层，使用扩散系数大液使用薄的固定相层，使用扩散系数大液相固定液，可改善传质，增大柱效。相固定液，可改善传质，增大柱效。 uDdCHssfs中国矿业大学化工学院 应化系（2 2） 流动相传质阻力项流动相传质阻力项流动相传质阻力：流动相传质阻力： 组分从流动相扩散

7、到流动相与固定相界面组分从流动相扩散到流动相与固定相界面的传质过程中所受得到的阻力。的传质过程中所受得到的阻力。中国矿业大学化工学院 应化系A A：流动的流动相中传质阻力项：流动的流动相中传质阻力项Hm uDdCHmpmm2 C Cm m 常数常数 d dp p 固定相粒度固定相粒度 u u 流动相线速流动相线速 D Dm m试样分子在流动相中扩散系数试样分子在流动相中扩散系数 从上式可看出：从上式可看出： 使用小粒度固定相，填料规则排布并紧密填充使用小粒度固定相，填料规则排布并紧密填充（C Cm m下降）使用下降）使用D Dm m大的流动相，可改善传质，提高大的流动相，可改善传质，提高柱效，

8、减小峰宽。柱效，减小峰宽。中国矿业大学化工学院 应化系B B：滞留的流动相中传质阻力项：滞留的流动相中传质阻力项H HsmsmuDdCHmpsmsm2 C Csmsm常数常数 d dp p固定相粒度固定相粒度 D Dm m- - 试样分子在流动相中扩散系数试样分子在流动相中扩散系数 u u流动相线速。流动相线速。由上式可看出：由上式可看出： 固定相微孔小而深，传质慢峰扩展就大。固固定相微孔小而深，传质慢峰扩展就大。固定相粒度愈小，孔径越大，传质效率越好，柱效定相粒度愈小，孔径越大，传质效率越好，柱效就越高。就越高。 滞留区与固定相结构有关，改进固定相就成滞留区与固定相结构有关，改进固定相就成为

9、提高液相色谱柱效一个重要问题。为提高液相色谱柱效一个重要问题。.中国矿业大学化工学院 应化系综上所述综上所述: : 由于柱内色谱峰扩展所引起塔板高度变化可归内为：由于柱内色谱峰扩展所引起塔板高度变化可归内为：uDsCsdfDmCmdpDmCmdpuCdDmdpH)(2222cuuBAH可简化为：可简化为： 与气相色谱的速率方程式一致。与气相色谱的速率方程式一致。主要区别：主要区别： HPLCHPLC的第二项可忽略不计，影响柱效的主要因素的第二项可忽略不计，影响柱效的主要因素是传质项是传质项。中国矿业大学化工学院 应化系根据以上讨论可知：根据以上讨论可知： 提高柱内填料装填的均匀性和小粒度以加快

10、提高柱内填料装填的均匀性和小粒度以加快传质，提高液相色谱分离效率。传质，提高液相色谱分离效率。 选用低粘度流动相，或适当提高柱温以降低选用低粘度流动相，或适当提高柱温以降低流动相粘度，利于提高传质效率，但提高柱温将流动相粘度，利于提高传质效率，但提高柱温将降低色谱峰分辨率。降低色谱峰分辨率。 降低流速可降低传质阻力项影响，但又会使降低流速可降低传质阻力项影响，但又会使纵向扩散项增加并延长分析时间。纵向扩散项增加并延长分析时间。 因此因此, ,后两种因素可根据具体情况而定。后两种因素可根据具体情况而定。中国矿业大学化工学院 应化系将典型气相色谱法和液相色谱法将典型气相色谱法和液相色谱法H-uH-

11、u绘制曲线。绘制曲线。 GC: H-uGC: H-u曲线是一抛物线，有一最低点（曲线是一抛物线，有一最低点（u uoptopt）LCLC：是一种斜率不大的直线，这是因为第二项不起作用。：是一种斜率不大的直线，这是因为第二项不起作用。 中国矿业大学化工学院 应化系2.3 高效液相色谱法的主要类型及其分离原理高效液相色谱法的主要类型及其分离原理中国矿业大学化工学院 应化系2.3.1 液液分配色谱法液液分配色谱法 固定相与流动相均为液体（互不相溶）固定相与流动相均为液体（互不相溶） 基本原理：基本原理： 试样溶于流动相后，在色谱柱内经过两相分界面进入试样溶于流动相后，在色谱柱内经过两相分界面进入固定

12、液中。由于试样组分在固定相和流动相之间的相对溶固定液中。由于试样组分在固定相和流动相之间的相对溶解度存在差异，因而组分在两者间进行分配解度存在差异，因而组分在两者间进行分配。 液一液分配色谱法与气一液色谱法的比较：液一液分配色谱法与气一液色谱法的比较： 相似处：相似处： 分离顺序决定于分配系数的大小，分离顺序决定于分配系数的大小，K K大的组分保留值大。大的组分保留值大。 不同处：不同处： GCGC流动相性质对流动相性质对K K影响不大，而影响不大，而LCLC中流动相种类对中流动相种类对K K影响较大。影响较大。中国矿业大学化工学院 应化系 流动相流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即

13、流对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性（正相动相的极性小于固定液的极性（正相 normal phase），反之），反之，流动相的极性大于固定液的极性（反相，流动相的极性大于固定液的极性（反相 reverse phase）。）。正相与反相的出峰顺序相反；正相与反相的出峰顺序相反； 固定相：固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用；早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用； 化学键合固定相：化学键合固定相：（将各种不同基团通过化学反应键合（将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。到硅胶（担体）表面的游离羟基上。C-18柱（反相柱）柱（反相柱）。应

14、用：应用： 反相键合色谱法适用反相键合色谱法适用于极性较小的样品分离。可以分离同系于极性较小的样品分离。可以分离同系物、复杂稠环芳烃以及药物、激素、天然产物、农药残留量的物、复杂稠环芳烃以及药物、激素、天然产物、农药残留量的测定测定 。中国矿业大学化工学院 应化系2.3.2 液固色谱法（液固吸附色谱法）液固色谱法（液固吸附色谱法）分离原理：分离原理： 利用各组分在固定相上吸附能力的不同将它们分利用各组分在固定相上吸附能力的不同将它们分离的。离的。固定相固定相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是使用的是5 510m10m的硅胶吸附剂的硅胶吸附剂；应

15、用：应用： 适用于相对分子质量中等的油溶性试样。对具有适用于相对分子质量中等的油溶性试样。对具有不同官能团的化合物和异构体有较高的选择性。不同官能团的化合物和异构体有较高的选择性。中国矿业大学化工学院 应化系2.3.3 离子交换色谱法离子交换色谱法 固定相固定相：阴离子交换树脂或阳离子交换树脂；：阴离子交换树脂或阳离子交换树脂； 流动相流动相：阴离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；：阴离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阳离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液；阳离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液； 基本原理基本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；：组分在固定相上发生的反复离子交换

16、反应；组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长；在形式等有关。亲和力大，保留时间长； 阳离子交换：阳离子交换：RSO3H +M+ = RSO3 M + H + 阴离子交换：阴离子交换：RNR3OH +X- = RNR3 X + OH- 中国矿业大学化工学院 应化系 总之，离子交换色谱是根据不同组分离子对固定总之，离子交换色谱是根据不同组分离子对固定离子基团的亲和力的差别而达到分离目的。离子基团的亲和力的差别而达到分离目的。应用：应用： 主要用来分离离子或可离解的化合物主要用来分离离子或可离解的化合

17、物，不仅应用，不仅应用于无机离子的分离如稀土化合物。还用于有机物分于无机离子的分离如稀土化合物。还用于有机物分离（分离氨基酸、核酸、蛋白质等）。离（分离氨基酸、核酸、蛋白质等）。中国矿业大学化工学院 应化系2.3.4 离子色谱法离子色谱法 离子色谱的流程装置离子色谱的流程装置 如图如图 具有抑制柱的离具有抑制柱的离子色谱法称为抑制型子色谱法称为抑制型离子色谱法，又称双离子色谱法，又称双柱离子色谱法柱离子色谱法。中国矿业大学化工学院 应化系过程过程例如阴离子分析时：例如阴离子分析时： 试样通过阴离子交换树脂时，流动相中待测阴试样通过阴离子交换树脂时，流动相中待测阴离子（以离子（以BrBr- -为

18、例）与树脂上的为例）与树脂上的OHOH- -离子交换离子交换。OHNaBrRBrNaOHR R R+ +-离子交换树脂离子交换树脂 洗脱过程：洗脱过程：OHOH- -从分离柱的阴离子交换位置置从分离柱的阴离子交换位置置换待测阴离了换待测阴离了BrBr- -。 当待测阴离子当待测阴离子BrBr- -，从柱中被洗脱下来进入电导，从柱中被洗脱下来进入电导池时，要求能检测出洗脱液中电导的改变。池时，要求能检测出洗脱液中电导的改变。问题：问题：与洗脱液的电导值相比，试样离子进入洗与洗脱液的电导值相比，试样离子进入洗脱液而引起的电导的改变非常小，结果用电导检测脱液而引起的电导的改变非常小，结果用电导检测器

19、直接测定试样中阴离子灵敏度极差。器直接测定试样中阴离子灵敏度极差。中国矿业大学化工学院 应化系解决方法：解决方法： 加入抑制装置加入抑制装置 当流动相进入抑制柱时，发生反应：当流动相进入抑制柱时，发生反应： OHNaROHNaHR2BrHNaRBrNaHR 抑制柱使碱生抑制柱使碱生H2O（电导值很小），消除（电导值很小），消除本底电导影响。大大提高了所测阴离子检测灵本底电导影响。大大提高了所测阴离子检测灵敏度。敏度。中国矿业大学化工学院 应化系分类：分类：化学抑制型离子色谱法（双柱型）化学抑制型离子色谱法（双柱型）3No24SO非抑制型离子色谱法（单柱型）如流动相选非抑制型离子色谱法（单柱型）

20、如流动相选用低电导物质，不仅能有效分离柱上的各个阴用低电导物质，不仅能有效分离柱上的各个阴离子，且背景电导低，能显示试样中痕量离子，且背景电导低，能显示试样中痕量F-，Cl-， ， 等阴离子电导，因此不需加抑制柱等阴离子电导，因此不需加抑制柱应用：应用：v 水溶液中阴离子分析最佳方法；水溶液中阴离子分析最佳方法；v 可应用于无机，有机阴离子，金属阳离子；可应用于无机，有机阴离子，金属阳离子；v 也可用于有机阳离子，糖类，氨基酸等分离。也可用于有机阳离子，糖类，氨基酸等分离。 中国矿业大学化工学院 应化系2.3.5 离子对色谱法离子对色谱法 原理：原理：将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子（

21、将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子（对离子或反离子）加到流动相中使其与溶质离子结合形成疏对离子或反离子）加到流动相中使其与溶质离子结合形成疏水性离子对化合物，使其能够在两相之间进行分配；水性离子对化合物，使其能够在两相之间进行分配； 阴离子分离：阴离子分离：常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基铵或氢常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基铵或氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子；氧化十六烷基三甲铵作为对离子； 阳离子分离：阳离子分离：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子；离子； 反相离子对色谱：反相离子对色谱：非极性的疏水固定相非极性的疏水固定相(C-18柱柱)，含有，

22、含有对离子对离子Y+的甲醇的甲醇-水或乙腈水或乙腈-水作为流动相，试样离子水作为流动相，试样离子X-进入进入流动相后，生成疏水性离子对流动相后，生成疏水性离子对Y+ X -后；在两相间分配。后；在两相间分配。中国矿业大学化工学院 应化系 分类：分类：根据流动相和固定相的性质可分为根据流动相和固定相的性质可分为 正相离子对色谱法正相离子对色谱法 反相离子对色谱法反相离子对色谱法非极性的疏水固定相非极性的疏水固定相(C-18柱柱)，含有对离子，含有对离子Y+的甲醇的甲醇-水或乙腈水或乙腈-水作为流动相，试样水作为流动相，试样离子离子X-进入流动相后，生成疏水性离子对进入流动相后，生成疏水性离子对Y

23、+ X -后；在两相间后；在两相间分配。分配。 应用：应用：酸、碱和离子、非离子混合物的分离酸、碱和离子、非离子混合物的分离，尤其对一些生化试样如核苷、核酸、儿茶酚胺，尤其对一些生化试样如核苷、核酸、儿茶酚胺，生物碱以及药物等分离。，生物碱以及药物等分离。中国矿业大学化工学院 应化系2.3.7 空间排阻色谱法空间排阻色谱法固定相固定相：凝胶凝胶( (具有一定大小孔隙分布具有一定大小孔隙分布) )分离原理（动画）：分离原理（动画）： 按分子尺寸差异进行分离的一种液相色谱法。按分子尺寸差异进行分离的一种液相色谱法。当被测组分随流动相通过凝胶色谱柱时当被测组分随流动相通过凝胶色谱柱时: : 尺寸大于

24、孔径的组分分子不能渗入凝胶孔而被尺寸大于孔径的组分分子不能渗入凝胶孔而被全部排斥，最先流出色谱柱全部排斥，最先流出色谱柱 尺寸小于孔径的分子则全部渗入凝胶，最后流尺寸小于孔径的分子则全部渗入凝胶，最后流出出尺寸中等分子部分渗入较大孔，而排斥较小空尺寸中等分子部分渗入较大孔，而排斥较小空穴。因此介于中间流出。穴。因此介于中间流出。中国矿业大学化工学院 应化系中国矿业大学化工学院 应化系分类：分类： 凝胶过滤色谱凝胶过滤色谱以水溶液作流动相以水溶液作流动相 凝胶渗透色谱凝胶渗透色谱以有机溶剂作流动相以有机溶剂作流动相应用：应用：测量较广范围的相对分子质量分布测量较广范围的相对分子质量分布a a、优

25、点：、优点：柱内停留时间短柱内停留时间短固定相，流动相选择方便固定相，流动相选择方便分离较广范围相对分子质量分布分离较广范围相对分子质量分布 b b、缺点：、缺点： 不能用来分离大小相似，相对分子质量接近的不能用来分离大小相似，相对分子质量接近的分子。如：异构体等。分子。如：异构体等。中国矿业大学化工学院 应化系2.4 2.4 液相色谱固定相液相色谱固定相2.4.12.4.1液一液色谱法及离子对色谱法固定相液一液色谱法及离子对色谱法固定相1 1、全多孔型担体、全多孔型担体 由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采用100m的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见； 现采用10m以下的

26、小颗粒，化学键合制备柱填料；2 2、表面多孔型担体、表面多孔型担体 （薄壳型微珠担体） 3040m的玻璃微球，表面附着一层厚度为1 2m的多孔硅胶。 表面积小，柱容量底；中国矿业大学化工学院 应化系3 3、化学键合固定相、化学键合固定相 OHSi 化学键合固定相: 目前应用最广、性能最佳的固定相； a. 硅氧碳键型：硅氧碳键型： SiOC b. 硅氧硅碳键型：硅氧硅碳键型：SiOSi C 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广；稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广； c. 硅碳键型：硅碳键型： SiC d. 硅氮键型：硅氮键型： SiN中国矿业大学化工学院 应化系 化学键合固定相特点：化学键

27、合固定相特点：传质快传质快表面没有液坑，比一般液体固定相传质快表面没有液坑，比一般液体固定相传质快得多。得多。寿命长寿命长无固定液流失，增加了色谱柱的稳定性和无固定液流失，增加了色谱柱的稳定性和寿命。寿命。选择性好选择性好可以键合不同官能团，能灵活地改变选可以键合不同官能团，能灵活地改变选择性，应用于多种色谱类型择性，应用于多种色谱类型有利于梯度洗脱有利于梯度洗脱，也有利于配用灵敏的检测器和，也有利于配用灵敏的检测器和馏分收集。馏分收集。 中国矿业大学化工学院 应化系2.4.2 2.4.2 液一固吸附色谱法固定相液一固吸附色谱法固定相 种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等；种类：硅胶、氧化铝、

28、分子筛、聚酰胺等； 结构类型：全多孔型和薄壳型；结构类型：全多孔型和薄壳型； 粒度：粒度：510 m； 2.4.3 2.4.3离子交换色谱法固定相离子交换色谱法固定相1 1、 薄膜型离子交换树脂薄膜型离子交换树脂: : 以薄壳玻璃为担体，在它的表面涂约以薄壳玻璃为担体，在它的表面涂约1%1%的离子的离子交换树脂。交换树脂。2 2、离子交换键合固定相、离子交换键合固定相: : 化学反应将离子交换基因键合在惰性担体表面化学反应将离子交换基因键合在惰性担体表面中国矿业大学化工学院 应化系2.4.42.4.4排阻色谱法固定相排阻色谱法固定相1 1、软质凝胶、软质凝胶 如葡聚糖凝胶，琼脂糖凝胶等。如葡聚

29、糖凝胶，琼脂糖凝胶等。 适于水为流动相。只能用于常压排阻色谱法适于水为流动相。只能用于常压排阻色谱法。2 2、半硬质凝胶、半硬质凝胶 如苯乙烯一二乙烯基苯交联共聚凝胶是应用最多如苯乙烯一二乙烯基苯交联共聚凝胶是应用最多的有机凝胶。的有机凝胶。 适用于非极性有机溶剂，能耐较高压力，流速不适用于非极性有机溶剂，能耐较高压力，流速不宜大。宜大。中国矿业大学化工学院 应化系3 3、硬质凝胶、硬质凝胶 多孔硅胶多孔硅胶是用得较多的无机凝胶是用得较多的无机凝胶 多孔玻珠多孔玻珠具有恒定孔径和较窄粒度分布，色谱具有恒定孔径和较窄粒度分布，色谱柱易于填充，适用于较高流速下操作。柱易于填充，适用于较高流速下操作

30、。 2.52.5液相色谱法流动相液相色谱法流动相1.1.用作流动相的溶剂要求：用作流动相的溶剂要求： 纯度高纯度高 粘度低粘度低 化学稳定性好化学稳定性好 溶剂沸点要高于溶剂沸点要高于5555 溶剂对试样要有合适的溶解度溶剂对试样要有合适的溶解度 应与检测器匹配应与检测器匹配中国矿业大学化工学院 应化系2. 2. 流动相类别流动相类别 按流动相组成分：单组分和多组分；按流动相组成分：单组分和多组分； 按极性分：极性、弱极性、非极性；按极性分：极性、弱极性、非极性； 按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。 常用溶剂：常用溶剂： 己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯

31、、乙醇己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。、乙腈、水。 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。中国矿业大学化工学院 应化系3. 3. 流动相选择流动相选择 在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。 采用正相液采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。 也可

32、在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。保留时间缩短。 常用溶剂的极性顺序：常用溶剂的极性顺序： 水水(最大最大) 甲酰胺甲酰胺 乙腈乙腈 甲醇甲醇 乙醇乙醇 丙醇丙醇 丙酮丙酮 二氧六环二氧六环 四氢呋喃四氢呋喃 甲乙酮甲乙酮 正丁醇正丁醇 乙酸乙酯乙酸乙酯 乙醚乙醚 异丙醚异丙醚 二氯甲烷二氯甲烷氯仿氯仿溴乙烷溴乙烷苯苯四氯化碳四氯化碳二硫化碳二硫化碳环己烷环己烷己烷己烷煤油煤油(最小最小)中国矿业大学化工学院 应化系2.6 2.6 高效液相色谱分离类型的选择高效液相色谱分离类型的选择 相对分子质量较低，挥发性较高的试样相对分子

33、质量较低，挥发性较高的试样GCGC 相对分子质量相对分子质量200 200 2000 2000 LCLC（标准）（标准） 相对分子质量相对分子质量20002000空间排阻色谱法空间排阻色谱法下表的选择分离类型可供参考。下表的选择分离类型可供参考。中国矿业大学化工学院 应化系中国矿业大学化工学院 应化系2.7 2.7 高效液相色谱仪高效液相色谱仪中国矿业大学化工学院 应化系中国矿业大学化工学院 应化系中国矿业大学化工学院 应化系流程及主要部件流程及主要部件 HPLCHPLC主要有贮液器，高压泵、梯度洗提装主要有贮液器，高压泵、梯度洗提装置，进样器、色谱柱，检测器等组成。置，进样器、色谱柱，检测器

34、等组成。如图：如图： 中国矿业大学化工学院 应化系2. 7.1 2. 7.1 贮液器贮液器v 用于用于存放溶剂存放溶剂，材料要耐腐性，对溶剂惰性。，材料要耐腐性，对溶剂惰性。v 常用常用1-2L1-2L玻璃瓶，也可用不锈钢制成。玻璃瓶，也可用不锈钢制成。v 贮液器应配有贮液器应配有溶剂过滤器溶剂过滤器，以防止流动相中颗，以防止流动相中颗粒流入泵中。粒流入泵中。2.7.2 2.7.2 高压泵高压泵高压泵用于输送流动相，压力一般高压泵用于输送流动相，压力一般Pa510350150泵要求：泵要求： 流量稳定，压力平稳无脉动，耐压、耐腐蚀、流量稳定，压力平稳无脉动，耐压、耐腐蚀、密封性好。密封性好。

35、泵有恒流泵和恒压泵两类。泵有恒流泵和恒压泵两类。中国矿业大学化工学院 应化系1 1、往复式柱塞泵（恒流泵），、往复式柱塞泵（恒流泵），如图如图 往复式柱塞泵流量与外界阻力无关，死体往复式柱塞泵流量与外界阻力无关，死体积小，非常适合于梯度洗脱积小，非常适合于梯度洗脱 中国矿业大学化工学院 应化系2 2、气动放大泵（恒压泵）如图：、气动放大泵（恒压泵）如图： 缺点缺点：泵腔体积大，流量随外界阻力而变，不适泵腔体积大，流量随外界阻力而变，不适合梯度洗脱，已被恒流泵所代替。合梯度洗脱，已被恒流泵所代替。中国矿业大学化工学院 应化系2.7.32.7.3梯度洗提装置梯度洗提装置梯度洗脱：梯度洗脱： 分离过

36、程中，通过改变流动相组成增加洗脱能力的一种方法。分离过程中，通过改变流动相组成增加洗脱能力的一种方法。 通过梯度装置可得两种或三种、四种溶剂按一定比例混合进行通过梯度装置可得两种或三种、四种溶剂按一定比例混合进行二元三元或四元梯度洗脱。二元三元或四元梯度洗脱。低压梯度低压梯度 在常压下预先按一定程序将溶剂混合后再用泵输入色谱柱。在常压下预先按一定程序将溶剂混合后再用泵输入色谱柱。高压梯度高压梯度 将溶剂用高压泵增压后输入色谱系统的梯度混合室，加以混合将溶剂用高压泵增压后输入色谱系统的梯度混合室，加以混合后送入色谱柱。后送入色谱柱。中国矿业大学化工学院 应化系优点：优点：改善峰形改善峰形提高柱效

37、提高柱效减少分析时间减少分析时间2.7.42.7.4进样器进样器 HPLCHPLC进样普遍使用进样普遍使用高压进样阀。高压进样阀。 通过进样阀（常用通过进样阀（常用六通阀六通阀），直接向压力系统），直接向压力系统内进样而不必停止流动相流动的一种进样装置。内进样而不必停止流动相流动的一种进样装置。 如图：如图： 中国矿业大学化工学院 应化系中国矿业大学化工学院 应化系2.7.52.7.5色谱柱色谱柱 LCLC常用的标准柱型：内径常用的标准柱型：内径4.64.6或或3.9 m m3.9 m m，长，长度度151530cm30cm直形不锈钢柱。填料粒度直形不锈钢柱。填料粒度5 5 10um10um，

38、柱效以理论塔板数计大约柱效以理论塔板数计大约70007000 1000010000。 LCLC色谱柱发展趋势：色谱柱发展趋势：减小填料颗粒度（减小填料颗粒度（3 3 5 um5 um）提高柱效。）提高柱效。 减小柱径（内径小于减小柱径（内径小于1 mm1 mm）。即降低溶剂）。即降低溶剂用量，提高检测浓度用量，提高检测浓度中国矿业大学化工学院 应化系中国矿业大学化工学院 应化系2.7.62.7.6检测器检测器1 1、紫外光度检测器、紫外光度检测器 选择性浓度型检测器选择性浓度型检测器，是，是LCLC广泛使用的检广泛使用的检测器。测器。 作用原理：作用原理： 基于被分析试样组分对特定波长紫外光的基于被分析试样组分对特定波长紫外光的选择吸收，组分浓度与吸光度关系遵守比尔定律选择吸收，组分浓度与吸光度关系遵守比尔定律。中国矿业大学化工学院 应化系优点：优点：灵敏度高，最小检测浓度达灵敏度高，最小检测浓度达 。1910mlg对温度和流速不敏感，可用于梯度洗脱。对温度和流速不敏感，可用于梯度洗脱。缺点：缺点：不适合于对紫外光完全不吸收的试样。不适合于对紫外光完全不吸收的试样。中国矿业