药厂微生物培训教程 - 图文-

1、微生物培训教程目录目录 (1第一章微生物概述 (2第一节微生物的种类及分布 (2第二节微生物与人类的关系 (7第二章微生物生长、繁殖及传播 (9第一节微生物的生长繁殖 (11第二节微生物的污染途径 (15第三章灭菌方式 (21第一节药品生产过程中各岗位的灭菌方式 (22第二节常用灭菌法的选择 (23第四章验证的需要 (28第一节法规要求 (29第二节操作规范 (30第五章无菌药品中微生物鉴别 (34附录1: (41附录2: (43附录3: (50第一章微生物概述微生物的一般特点体积小,比表面积大吸收和转化快生长繁殖快易变异,适应性强分布广泛,种类繁多。第一节微生物的种类及分布1、微生物的种类微

2、生物是包括细菌、病毒、真菌以及一些小型的原生动物等在内的一大类生物群体,它个体微小,却与人类生活密切相关。微生物在自然界中可谓“无处不在,无处不有”,涵盖了有益有害的众多种类,广泛涉及健康、医药、工农业、环保等诸多领域。微生物种类繁多。迄今为止,我们所知道的微生物约有10万种,有人估计目前已知的种只占地球上实际存在的微生物总数的20%,微生物很可能是地球上物种最多的一类。微生物资源是极其丰富的,但在人类生产和生活中仅开发利用了已发现微生物种数的1%.一般将微生物划分为以下8大类:细菌、病毒、真菌、放线菌、立克次体、支原体、衣原体、螺旋体。原核:细菌、放线菌、螺旋体、支原体、立克次氏体、衣原体。

3、真核:真菌、藻类、原生动物。非细胞类:病毒和亚病毒。 2、微生物分布广泛虽然我们不借助显微镜就无法看到微生物,可是它在地球上几乎无处不有,无孔不入,就连我们人体的皮肤上,口腔里,甚至肠胃道里,都有许多微生物。85公里的高空、11公里深的海底、2000米深的地层、近100(甚至300的温泉、零下250的环境下,均有微生物存在,这些都属极端环境。至于人们正常生产生活的地方,也正是微生物生长生活的适宜条件。因此,人类生活在微生物的汪洋大海之中,但常常是“深在菌中不知菌”。微生物聚集最多的地方是土壤,土壤是各种微生物生长繁殖的大本营,任意取一把土或一粒土,就是一个微生物世界,不论数量或种类均很多。在肥

4、沃的土壤中,每克土含有20亿个微生物,即使是贫瘠的土壤,每克土中也含有35亿个微生物。空气里悬浮着无数细小的尘埃和水滴,它们是微生物在空气中的藏身之地。哪里的尘埃多,哪里的微生物就多。一般来说,陆地上空比海洋上空的微生物多,城市上空比农村上空多,杂乱肮脏地方的空气里比整洁卫生地方的空气里的多,人烟稠密、家畜家禽聚居地方的空气里的微生物最多。早在60年前我国有一位年轻人,就曾经乘飞机在160米到5300米的高空采集过微生物,发现都有微生物在活动,不过在160米高空的微生物比5300米处要多100倍。各种水域中也有无数的微生物。居民区附近的河水和浅井水容易受到各种污染,水中的微生物就比较多。大湖和

5、海水中,微生物较少。从人和动植物的表皮到人和动物的内脏,也都经常生活着大量的微生物。如大肠杆菌在大肠中清理消化不完的食物残渣,所以,在正常情况下,还是人肠道缺少不了的帮手呢!把手放到显微镜下观察,一双普通的手上带有细菌四万到四十万个,即使是一双刚刚用清水洗过的手,上面也有近三百个细菌。人们在握手时,会把许多细菌传播给对方,所以握手也能传播疾病!幸好大多数微生物不是致病菌,否则后果将不堪设想。 第二节微生物与人类的关系微生物与人类关系密切,它既能造福于人类,也能给人类带来毁灭性的灾难。微生物千姿百态,有些是腐败性的,即引起食品气味和组织结构发生不良变化。当然有些微生物是有益的,它们可用来生产如奶

6、酪,面包,泡菜,啤酒和葡萄酒。微生物非常小,必须通过显微镜放大约1000 倍才能看到。比如中等大小的细菌,1000 个叠加在一起只有句号那么大。想像一下一滴牛奶,每毫升腐败的牛奶中约有 5 千万个细菌,或者讲每夸脱牛奶中细菌总数约为50 亿。也就是一滴牛奶中可有含有50 亿个细菌。微生物对人类最重要的影响之一是导致传染病的流行。在人类疾病中有50%是由病毒引起。世界卫生组织公布资料显示:传染病的发病率和病死率在所有疾病中占据第一位。微生物导致人类疾病的历史,也就是人类与之不断斗争的历史。在疾病的预防和治疗方面,人类取得了长足的进展,但是新现和再现的微生物感染还是不断发生,像大量的病毒性疾病一直

7、缺乏有效的治疗药物。一些疾病的致病机制并不清楚。大量的广谱抗生素的滥用造成了强大的选择压力,使许多菌株发生变异,导致耐药性的产生,人类健康受到新的威胁。一些分节段的病毒之间可以通过重组或重配发生变异,最典型的例子就是流行性感冒病毒。每次流感大流行流感病毒都与前次导致感染的株型发生了变异,这种快速的变异给疫苗的设计和治疗造成了很大的障碍。而耐药性结核杆菌的出现使原本已近控制住的结核感染又在世界范围内猖獗起来。然而,我们在关注微生物在给人类提供诸多负面影响的同时,也不能忽视其给人类带来的巨大好处。微生物学在解决当代重大社会问题中起着重要作用。例如微生物采油技术中,它发挥令人难以想象的巨大作用。它可

8、降低原油的黏度,增加原油的流动性,从而大大提高了原油的采收率。此种技术成本低,设备简单,不伤害地层,不污染环境,而且效益显著。19952000 年,斯诺克尔石油技术公司实施该技术且获得很好的效益。而日本则把光合菌、乳酸菌、酵母菌、发酵丝状菌、放线菌等功能各异的80 多种微生物组成的一种活菌制剂。这些微生物组合在一个统一体中,互相促进,共同构成一个复杂而稳定的具有多元功能的微生态系统,可抑制有害微生物,尤其是病原菌和腐败细菌的活动,促进植物生长。该技术在自然农法中广泛应用。随着国民经济的发展,微生物的应用也越来越广泛。在生物制药、能源、环保、食品、工业等方面,微生物都扮演着重要的角色。有益方面:

9、工业上酿酒,生产酶制剂和有机酸等医药上抗生素,疫苗等农业上杀虫、抗病、固氮、作饲料添加剂等利用微生物进行沼气发酵、生产食用菌等有害方面:引起人畜疾病引起植物病害引起食物腐败和多种物质变质等事有利弊,所有事情均有两面性,利与弊在于我们如何让看待,微生物的利与害也要看我们如何利用,用为害则为害,利用其有利方面,则可造福人类。二战期间的细菌战、病毒战等均是利用微生物致病力强、传播速度快等特点来大量杀害人民;抗生素的使用在第二次世界大战中挽救了无数人的生命。疫苗等的应用这是利用病毒的外壳有引起人体免疫反应却不会致病等特点来找付人类。 微生物生长、繁殖及传播第二章微生物生长、繁殖及传播微生物适应能力强,

10、任何有其它生物生存的环境中,都能找到微生物。而在其它生物不可能生存的极端环境中也有微生物存在。微生物在大多数已知环境中可生长、繁殖。例如:高温、低温、高盐、高碱以及高辐射等普通生命体不能生存的环境,依然存在着一部分微生物等等。微生物具有极强的抗热性、抗寒性、抗盐性、抗干燥性、抗酸性、抗碱性、抗压性、抗缺氧、抗辐射和抗毒物等能力,显示出其抗性的多样性。现在已从近于100 条件下的温泉中分离到了高温芽孢杆菌,并观察到在105 时还能生长。甚至有报导,有人从太平洋25 000m 深处分离到的高温菌,在265atm 和250 下,经过40 分钟的培养,细菌数量增加 1 倍,几小时后增加了100 倍,甚

11、至升温到300 时仍在生长。细菌芽孢具有高度抗热性,这常给科研和发酵工业生产带来危害。许多细菌也耐冷和嗜冷,有些在-12 下仍可生活,造成贮藏于冰箱中的肉类、鱼类和蔬菜水果的腐败。人们常用冰箱(+4 、低温冰箱(-20 、干冰(-70 、液氮(-196 来保藏菌种,都具有良好的效果。嗜酸菌可以在pH 为0.5 的强酸环境中生存,而硝化细菌可在pH 9.4 、脱氮硫杆菌可在pH10.7 的环境中活动。在含盐高达23 %25%的“死海”中仍有相当多的嗜盐菌生存。在糖渍蜜饯、蜂蜜等高渗物中同样有高渗酵母等微生物活动,从而往往引起这些物品的变质。微生物在不良条件下很容易进入休眠状态,某些种类甚至会形成

12、特殊的休眠构造,如芽孢、分生孢子、孢囊等。有些芽孢在休眠了几百年,甚至上千年之后仍有活力。甚至报导过30004000年前埃及金字塔中的木乃尹上至今仍有活的病原菌。 海洋底部的生命:太平洋胡安德富卡洋脊中吸烟热液硫化物正在喷出第一节 微生物的生长繁殖生长:生物个体物质有规律地、不可逆增加,导致个体体积扩大的生物学过程。繁殖:生命个体生长到一定阶段,通过特定方式产生新的生命个体,即引起生命个体数量增加的生物学过程。微生物生长繁殖的过程:同化作用:生物体把从外界环境中获取的营养物质转变成自身的组成物质,并且储存能量的变化过程。 异化作用:将自身有机物分解成无机物归还到无机环境并释放能量的过程。单细胞

13、真菌-酵母一个微生物细胞合适的外界条件,吸收营 养物质,进行代谢。 个体的生长 个体繁殖 群体生长 如果同化作用的速度 超过了异化作用 群体生长 = 个体生长 + 个体繁殖 烟曲霉 微生物的繁殖方式相对于动植物的繁殖也具有多样性。细菌以二裂法为主,个别可由性接合的方式繁殖;放线菌可以菌丝和分生孢子繁殖;霉菌可由菌丝、无性孢子和有性孢子繁殖,无性孢子和有性孢子又各有不同的方式和形态;酵母菌可由出芽方式和形成子囊孢子方式繁殖。微生物尤其是以二裂法繁殖的细菌具有惊人的繁殖速率。如在适宜条件下,大肠杆菌37时世代时间为18分钟,每24小时可分裂80次,每24小时的增殖数为1.2 x 1024个。枯草芽

14、孢杆菌30时的时代时间为31 分钟,每24小时可分裂46次,增殖数为7.0 x 1013个。微生物由于个体小,结构简单,繁殖快,与外界环境直接接触等原因,很容易发生变异,一般自然变异的频率可达105-1010-,而且在很短时间内出现大量的变异后代。变异具有多样性,其表现可涉及到任何性状,如形态构造、代谢途径、抗性、抗原性的形成与消失、代谢产物的种类和数量等等。如常见的人体病原菌抗药性的提高,常需要提高用药剂量,则是病原菌变异的结果。抗生素生产和其他发酵性生产中利用微生物变异,提高发酵产物产量。最典型的例子是青霉素的发酵生产,最初发酵产物每毫升只含20单位左右,而现在已有极大的增加,甚至接近10

15、万单位了。微生物的营养:微生物生长所必需的营养物质:碳源、氮源、无机盐、生长因子、水这五类物质在微生物生长繁殖过程中缺一不可,在灭杀微生物过程中,可考虑破坏微生物的生长环境,使其缺乏某一或多种营养,从而达到灭杀的效果。微生物是杂食性的:一般生物能利用的,微生物能利用;一般生物不能利用的,微生物也能利用;石油,大气N2等;对一般生物有害的,微生物还能利用。氰化物、酚等。所有致病微生物均为化能有机异养型微生物;培养基:是一种人工配制的、适合微生物生长繁殖或产生代谢产物用的营养基质。培养基几乎是一切对微生物进行研究和利用工作的基础:促使微生物生长;积累代谢产物;分离微生物菌种;鉴定微生物种类;微生物

16、细胞计数;菌种保藏;制备微生物制品。任何培养基都应具备微生物所需要的五大营养要素,且应比例适当。所以一旦配成必须立即灭菌。培养基的配制原则:(一培养基组分应适合微生物的营养特点(目的明确(二营养物的浓度与比例应恰当(营养协调(三物理化学条件适宜(条件适宜(四根据培养目的选择原料及其来源(经济节约微生物有最佳生长pH:高压蒸气灭菌一般培养基:1.05 Kg/cm2, 121.3, 15-30 min含糖培养基:0.56 Kg/cm2, 112.6 , 15-30 min种子培养基是为保证发酵生产获得大量优质种子而设计的培养基,特点是营养较丰富,氮源比例较高。有时为使菌种能迅速适应后面的发酵条件,

17、还有意识地加入发酵培养基的基质。发酵培养基用于生产预定发酵产物,一般以碳为主要元素,碳源含量往往高于种子培养基。大规模生产时,原料应价廉易得,还应有利于下游的分离提取。第二节微生物的污染途径污染:当某物与不洁净的或腐坏物接触或混合在一起使该物变的不纯净或不适用时,即受污染。自身污染:由于患者和员工自身携带微生物而污染。接触污染:由于和非无菌的用具、器械或人的接触而污染。空气污染:由于空气中所含微生物的沉降、附着或被吸入而污染。其他污染:由于其他因素(如昆虫而污染。药品中微生物污染的特殊性:能繁殖的活细胞生物;数量少而分布不均匀;多数处于受损伤状态;生存环境的多样性及复杂性。污染洁净室(区洁净度

18、的因素(一来自外部的污染物质。(二洁净室内的污染源主要来自四个方面:1.大气中含尘、含菌、净化空调系统中新风带入的尘粒和微生物;2.作业人员发尘;3.建筑围护结构、设施的产尘,这里包括墙、顶棚、地面和一些裸露管线的产尘;4.设备及产品生产过程的产尘。室内发生污染空气的主要物质 人员与室内空气污染作业人员的发尘量洁净室内的尘源,主要来自生产工艺设备运转发尘,产品和材料运送过程中发尘,洁净室内建筑内表面等的发尘和人员产尘。来自生产设备运转中的尘粒有的可通过局部排风装置排除;按洁净室的管理规定,产品和材料均应进行清洁,在运送过程中的发尘量与人体发尘量相比是很少的;洁净室内表面只要严格按规定进行清扫、

19、清洁,其发尘量也可控制到很少。洁净室的尘源主要来自操作人员的发尘,即使按“人净程序”进行了人身净化,洁净室内人员产尘仍是主要污染源。在洁净生产环境内,工作人员的发尘量多少与其穿着的洁净工作服种类、形式和洁净服的着装材质类型有关,与工作人员在洁净室内的活动、动作的幅度等因素有关。作业人员不同的行为发尘量作业人员发尘量粒/(人·min,0.5µm 人体发菌量生物洁净室,包括制药工业、生物制品工厂、医院的手术室等,必须控制人体的发菌量,人体的细菌散发量与服装、人员的活动及场所等因素有关。人体各部位的带菌数 不同衣着、不同动作时的人体散发菌量/pc·(人·min

20、 注:踏步频率为90次/min,起立坐下为20次/min,抬臂为30次/min污染的来源与控制:空气、压缩空气、水 污染的来源与控制:人的皮肤、呼吸道、物料、建筑、设备 微生物生长、繁殖及传播 微生物控制 第三章灭菌方式灭菌与消毒灭菌:采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施。常用的灭菌方法:高压蒸汽灭菌(103.4千帕蒸汽压温度达121.3,维持15-20分钟。温度达132以上并维持10分钟,即可杀死包括具有顽强抵抗力的芽胞、孢子在内的一切微生物。,高温干热灭菌(一般250,2小时消毒:采用较温和的理化因素仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的病原菌,而对被

21、消毒的物体基本无害的措施。本厂常用消毒剂:75%乙醇:用于操作者手消毒、C级设备外表面、物料外表面的消毒。0.1%新洁尔灭:用于对洁净区操作间内的棚顶、墙面、地面、操作台、与物料、产品不接触的设备外表面、工具表面等的消毒。无菌:是指产品中不存在任何活性微生物。它是一个绝对的概念,无法通过实验加以证明。无菌工艺:是药品达到无菌要求的另外一种方式,指对药品的各个组成部分,如原料、包装材料分别经过灭菌处理,而后再极高洁净环境下进行灌装和密封。产品在最终容器中不做最终灭菌处理。灭菌方法:应用物理和化学等方法杀灭或除去一切存活的微生物繁殖体或芽孢,使之达到无菌的方法。灭菌工艺:指通过适当的物理或化学手段

22、,将一定数量的活性微生物完全杀灭,并且使其生命活动不可逆转的过程,是药品达到无菌要求的方式之一。灭菌的目的:提高药物制剂的安全性、保护制剂的稳定性、保证制剂的临床疗效。灭菌方法包括物理灭菌法和化学灭菌法。第一节药品生产过程中各岗位的灭菌方式洁净区(化学试剂、设备(化学试剂、干热、湿热、洗衣(湿热、配制(过滤、湿热、器具灭菌室(湿热、干热灭菌、空调(过滤、水(过滤厂房经过改造或生产一定时间后要进行一次熏蒸消毒灭菌,本书以甲醛熏蒸为例,其原理是,甲醛经加热产生甲醛蒸汽,经一定时间后甲醛浓度达一定浓度从而杀死微生物。甲醛气体含量越高,消毒效果越好。为了防止气体逸出厂房外对环境造成污染,在厂房熏蒸消毒

23、之前,一定要检查厂房的密闭性,确保厂房密闭不会有甲醛气体溢出。一般厂房不应低于18,相对湿度以60%80%为好,不宜低于60%。当厂房温度在26,相对湿度在80%以上时,消毒效果最好。厂房要求熏蒸消毒24小时以上。熏蒸消毒后逸散气体,消毒后禽舍内甲醛气味较浓、有刺激性,因此,要通风换气,等甲醛气体完全逸散后再使用。如急需使用时,可用氨气中和甲醛,按空间用氯化铵5克/立方米、生石灰10克/立方米、75热水10毫升/立方米,混合后放入容器内,即可放出氨气(也可用氨水来代替,用量按25%氨水15毫升/立方米计算。30分钟后打开空调系统对厂房进行通风,通风30 60分钟后即可进厂房进行操作。药品从配置

24、到罐装要经过多次过滤除菌,制水系统、空调送风系统也是经过过滤法进行除菌,除菌过滤是指除去流体中微生物的工艺过程,该过程不应对产品质量产生不良影响。包括液体和气体除菌过滤。药品生产中采用的除菌过滤膜的孔径一般不超过0.22 2 m(或者0. 2m , 这两种标称没有区别。过滤除菌法分为绝对过滤和深层过滤。绝对过滤是过滤介质的滤孔小于固体颗粒,把颗粒截留;深层过滤介质滤孔不一定小于固休颗粒,它是藉滤层内的曲折通道,把颗粒截留。过滤除菌的原理有惯性撞击截留作用、拦截截留作用、布朗扩散截留作用等。无菌服配液罐装系统要经过湿热灭菌法进行灭菌。不锈钢器具、玻璃器具经过干热灭菌法对其进行灭菌处理。第二节常用

25、灭菌法的选择在无菌药品的生产中,防止微生物污染、内毒素污染一直是生产企业、监管机构关注的重点。灭菌不仅要实现杀灭或除去所有微生物繁殖体和芽孢,最大限度地提高药物制剂的安全性,同时也必须保证制剂的稳定性及其临床疗效,因此选择适宜的灭菌方法对保证产品质量具有重要意义。灭菌方法可分为二大类:即物理灭菌法、化学灭菌法。物理灭菌法:利用蛋白质与核酸具有遇热、射线不稳定的特性,采用加热、射线和过滤方法,杀灭或除去微生物的技术称为物理灭菌法。1.干热灭菌法:利用高温使微生物或脱氧核糖核酸酶等生物高分子产生非特异性氧化而杀灭微生物的方法。包括火焰灭菌法、干热空气灭菌法。干热灭菌设备包括隧道式和干热灭菌烘箱。2

26、.湿热灭菌法:指物质在灭菌器内利用高压蒸汽或其他热力学灭菌手段杀灭微生物,具有穿透力强、传导快、灭菌能力更强的特点,为热力学灭菌中最有效及用途最广的方法之一。蒸汽湿热灭菌本身具备无残留,不污染环境,不破坏产品表面,容易控制和重现性好等优点。包括热压灭菌法、流通蒸气灭菌法、煮沸灭菌法、低温间歇灭菌法。3.滤过除菌法:0.22µm、G6垂熔玻璃滤器。4.射线灭菌法:辐射灭菌法、微波灭菌法、紫外线灭菌法。化学灭菌法:指用化学药品直接作用于微生物而将其杀灭的方法。灭菌剂可分为气体灭菌剂和液体灭菌剂,-杀菌剂是指对微生物具有触杀作用的化学药品。分为气体杀菌剂和液体杀菌剂。-杀菌剂只对微生物繁殖

27、体有效,不能杀灭芽孢。-杀菌效能决定于微生物的种类与数量、物体表面光洁度或多孔性以及杀菌剂的性质等。灭菌方法的选择受灭菌对象的稳定性、使用目的和具体条件等限制,可以选择不同的方法。比如,环境设施宜使用化学灭菌法处理,玻璃容器一般使用干热灭菌处理,衣物、橡胶制品等多使用湿热灭菌处理,模拟分装用乳糖等粉剂则可以选择辐射灭菌处理。制剂产品的灭菌方法通常根据产品特性进行选择。无菌产品应在灌装到最终容器内后进行最终灭菌,如果因产品处方对热不稳定不能进行最终灭菌时,则应考虑除菌过滤和(或无菌生产。对非法规规定的最终灭菌工艺,如果无菌保证水平可达到官方认可的灭菌方法,则该方法经过验证后,可以作为替代的灭菌方

28、法。为了保证产品的质量和安全,确保规定的无菌保证水平,可以参考欧盟的灭菌方法选择决策树,选择最佳的灭菌方法,同时控制灭菌前微生物污染水平。无菌药品的生产企业,首先应根据特定的处方选择最佳的灭菌方法,然后再选择包装材料,使用热不定的包装材料不能作为选择无菌工艺的惟一理由。某些特定产品的包装材料的选择还必须考虑灭菌方法以外的其他因素,如容器类型,给药途径和病人受益等。比如容器类型不能进行最终灭菌(如某些眼用产品,此类产品可以采用经过验证的无菌工艺生产,但药品生产企业仍有责任不断寻找可接受的替代容器,使得产品可以采用最终灭菌的方法。 生产区常见微生物:大肠埃希菌,金黄色葡萄球菌,枯草芽孢杆菌,铜绿假

29、单胞菌,白色念珠菌,黑曲霉。沉降菌:将灭菌后,装有TSA培养基的培养皿(90mm×15mm放在采样点上,打开皿盖,使培养基表面暴露在空气中。静态测试时培养皿暴露时间为0.5h,动态测试时培养皿暴露时间为4h,如生产操作时间少于4小时,单个沉降碟的暴露时间为生产开始至结束的全部时间,如生产操作时间超过4h,则每4h换1次平皿。浮游菌:浮游菌采样器检测浮游菌。表面微生物:用接触碟法或棉签擦拭法做表面微生物检测。第四章验证的需要GMP认证中涉及到到无菌验证均为微生物相关的验证,这里所说的“菌”既是微生物。微生物是药品生产过程中常见的污染,也是最易受到的污染。药品生产需要做微生物的检验。清洁

30、验证、微生物限度验证、纯化水、注射用水的验证、消毒剂消毒效果的验证、表面微生物污染棉签取样法验证方案等验证均与微生物有关。第一节法规要求产品生产操作过程中应尽量减少污染,尤其是人为因素所照成的污染,故在生产过程中生产操作人员应特别注意,在GMP中也明确规定人员的操作:第二十九条所有人员都应当接受卫生要求的培训,企业应当建立人员卫生操作规程,最大限度地降低人员对药品生产造成污染的风险。第三十四条任何进入生产区的人员均应当按照规定更衣。工作服的选材、式样及穿戴方式应当与所从事的工作和空气洁净度级别要求相适应。第三十七条操作人员应当避免裸手直接接触药品、与药品直接接触的包装材料和设备表面。生产过程中

31、,水是必须的,也是易染菌的,GMP中对制药用水也作了硬性要求:第九十六条制药用水应当适合其用途,并符合中华人民共和国药典的质量标准及相关要求。制药用水至少应当采用饮用水。第九十七条水处理设备及其输送系统的设计、安装、运行和维护应当确保制药用水达到设定的质量标准。水处理设备的运行不得超出其设计能力。第九十八条纯化水、注射用水储罐和输送管道所用材料应当无毒、耐腐蚀;储罐的通气口应当安装不脱落纤维的疏水性除菌滤器;管道的设计和安装应当避免死角、盲管。第九十九条纯化水、注射用水的制备、贮存和分配应当能够防止微生物的滋生。纯化水可采用循环,注射用水可采用70以上保温循环。第一百条应当对制药用水及原水的水

32、质进行定期监测,并有相应的记录。第一百零一条应当按照操作规程对纯化水、注射用水管道进行清洗消毒,并有相关记录。发现制药用水微生物污染达到警戒限度、纠偏限度时应当按照操作规程处理。药品生产过程中原辅料等物料是最为重要的物质,GMP中对物料与产品也有相应要求(GMP 第六章物料与产品。厂房及生产设备的清洁也是药品生产过程中避免染菌的一项重要环节,做好厂房及设备的清洁对药品的生产至关重要:第一百四十三条清洁方法应当经过验证,证实其清洁的效果,以有效防止污染和交叉污染。清洁验证应当综合考虑设备使用情况、所使用的清洁剂和消毒剂、取样方法和位置以及相应的取样回收率、残留物的性质和限度、残留物检验方法的灵敏

33、度等因素。无菌药品的生产对生产工艺、环境、人员的操作等均有特殊要求(药品GMP指南无菌药品。第二节操作规范无菌药品的风险相对来说是比较大的。无菌药品质量保证的重点在于无菌保证、细菌、内毒素和微粒污染的控制。同时,也应特别关注防止混淆和交叉污染。产品无菌或其他质量特性绝不能只依赖于任何形式的最终处理或成品检验。应对无菌药品生产与质量管理的全过程进行良好的控制。人员、物料的进出,环境的监测,设备的清洁等都要有相应的操作规范并在生产过程中要严格按操作规范进行。对于无菌药品的生产来说,人员对最终产品质量的影响尤其大。一个设计、维护及运行良好的无菌药品生产工艺能最大限度地消除人员的影响。随着无菌药品生产

34、操作人员的增加,最终产品无菌的风险也会增大。为确保产品的无菌,无菌药品生产操作人员始终按无菌技术操作至关重要。人员在无菌药品生产时发现异常情况应该及时采取应急措施并向主管人员报告。从事无菌药品生产的人员应清醒地认识到无菌操作的高风险性,并在日常操作中努力降低风险。在无菌生产部门的管理人员应该对洁净区和洁净空气装置技术有所理解,对在该部门的特殊设计,如通风系统,H E P A 过滤器的位置和级别,工作台类型,隔离系统设计等有详尽的知识。在无菌生产工序中工作的人员应该对无菌技术有特别的能力和技能。他们的无菌技术应该通过执行例如培养基模拟灌装试验等来定期地评估。洁净室内操作人员快步行走时产生的微粒远

35、大于静止时产生的微粒;咳嗽会增加发菌量;而打一次喷嚏也会大大增加发菌量。无菌生产洁净区的良好行为规范要求应包括:( 1 尽量减少进人无菌生产洁净区的人数和次数进人无菌生产洁净区的人员应保持工作需要的最低人数。检查和控制都要尽可能在无菌生产洁净区外进行,辅助人员尽量靠单向流区域外侧,生产无关人员尽量不进人无菌生产洁净区。进人无菌生产洁净区的人数应通过验证来确定。( 2 人员在进入无菌生产洁净区应用无菌的消毒剂(如酒精消毒双手,待消毒剂挥发干后方可进人无菌生产洁净区。( 3 仅用无菌工器具接触无菌物料在处理巳灭菌物料时,须始终使用无菌工器具。在每次使用期间,无菌工器具应保存在 A 级环境中,保存方

36、式应能避免污染(如放在无菌容器中。在操作过程中,在必要时应更换工器具。首次更衣后,应在必要时将所戴的无菌手套消毒或更换,以最大限度地降低污染的风险。人员不应将衣着或手套的任何部位直接接触无菌产品、无菌容器、无菌密封件及关键表面。所有掉落或接触到地上的工具、仪器及物品在该批生产过程中不得用手触摸,更不能再次捡起使用;生产结束后才能对地上的工具、仪器及物品进行必要的处理,并妥善存放。( 4 缓慢和小心移动快速移动会破坏单向流,产生紊流,造成超越洁净厂房设计及控制参数的不良状况。缓慢和小心移动是人员在无菌生产洁净区内应始终遵循的基本原则。动作应尽量平缓,双手不得下垂、叉腰、夹在腋下或高举超过肩部,应

37、放在胸前(包括静止时。尽量避免下蹲动作,更不应躺在地面或坐在地面上。如果因为维修不可避免这些动作时,维修后应立即更换衣服,并避免交叉污染。( 5 保持整个身体在单向气流通道之外采用单向流设计是为了保护无菌设备的表面、容器、密封件以及产品。对高风险操作区单向流保护的破坏会增加产品污染的风险。(6 用不危害产品无菌性的方式进行必要的操作为保持无菌物料附近的无菌状态,应在适当的侧面进行操作,在垂直单向流条件下,不得在产品上游方向进行无菌操作。( 7 在高风险操作区的任何情况下,人员间应保持一段距离,人员的着装(包括无菌手套不奇相互接触。操作人员尽可能不说话,必要时,可先退出该区域后再与其他人员交谈。

38、( 8 每次接触物品后应对双手进行消毒,晾干后进行下一步操作。即使没有接触任何物品,也应定期(如每隔10到20分钟对双手进行再次消毒。如果在高风险操作区内进行关键操作(如涉及所有灌装部件、悬浮颗粒及浮游菌取样口操作等之前进行了其他操作,则应退出该区域重新消毒双手后方能进人该区域进行关键操作。( 9 进入高风险操作区后应定期检査着装,尤其在进行动作幅度较大的操作之后应确认头套、脚套是否穿戴紧密。(10在无菌生产洁净区中的任何时候,双手都不应接触地面。如果不小心接触了地面,那么必须立即返回更衣室内更换手套后方可进人该区域。(11无菌生产洁净区内所有开、关门的操作,应尽量避免用手直接接触,宜使用肘部

39、、前臂、背部等身体部分来完成,避免交叉污染。无菌操作前及无菌操作全过程中,操作人员的活动应注意避免衣着遭受不必要的污染。无菌生产洁净区行为规范的观察体系由于无菌生产工艺过程人员操作是主要微生物污染来源之一,建立良好的现场观察体系能够有效督促现场工作人员培养良好的操作习惯,改善无菌保证水平。现场观察的方法可以是多样化的,例如通过观察视窗,通过监控录像系统甚至委派人员进行现场观察。观察的范围可以包括:个人卫生习惯及着装过程无菌操作习惯清洁和消毒规程的评估具体进行评估时企业可以参照自己制定的S O P 条款进行对照,也可以根据GMP 条款或本章描述的一些良好行为规范进行考核,并通过考核记录定期反馈给

40、一线员工。对于现场观察中发现的一些共性不良习惯,需改进的操作流程,或进行整改。整改时可以通过更新培训资料和SOP,重新进行培训等,通过现场观察问题记录问题反馈更新文件加强培训现场观察的持续改进体系,不断提高无菌操作的规范性。A 用接触碟法取样进行更衣确认程序的表面监控取样点如下: 双手手指 头部 口罩 肩部前臂 手腕 眼罩在设计这些取样点的位置时应充分考虑实际生产过程中整个人员着装被微生物污染的可能性大小,以及着装的残存微生物对于产品的污染风险的高低。 所有取样点都在身体的正面(迎风面,因为操作人员在洁净区内工作时大部分时间都是往前走的,所以正面被空气中微生物污染的概率更高,需要重点监控。 强

41、调了双手的取样,因为操作时大部分的动作都通过双手完成;引起污染的概率更高,尤其是手腕处。关注手腕和口罩、眼罩的取样,因这些部位更靠近人体皮肤,容易在运动中污染。车间的环境对无菌药品的生产至关重要:药品生产必须保持清洁卫生环境,不同洁净区对生产环境、设备和人员等有不同的清洁卫生要求(无菌药品第三章。只有环境达到相应要求才能保证药品生产的安全无菌。物料工具等进入洁净区时易将外界污染源带入洁净区,造成药品生产的污染,故物料工具等的进出洁净区应遵循相应操作规程(附录1。清洁是药品生产的重要环节。药品生产必须保持清洁卫生环境,为了保证整个生产过程严格执行卫生标准,防止对药品产生污染,必须建立卫生制度和清

42、洁规程,明确生产环境、设备和人员的清洁卫生要求(无菌药品第四十三至四十五条,并掌握清洁、消毒的验证方法,从而建立一个有效的清洁消毒体系来确保药品质量。各级别洁净区清洁消毒操作规程见附录2。第五章无菌药品中微生物鉴别一、微生物鉴别方法传统方法4在传统的分类鉴定中,微生物分类鉴定的主要依据是形态学特征、生理生化反应特征、生态学特征以及血清学反应、对噬菌体的敏感性等。在鉴定时,我们把这些依据作为鉴定项目,进行一系列的观察和鉴定工作。1、形态学特征3 A, y. R2 t/ U0 x5 q(1细胞形态4 c& a: t( u( s' o, 5 z在显微镜下观察细胞外形大小、形状、排列等

43、,细胞构造,革兰氏染色反应,能否运动、鞭毛着生部位和数目,有无芽孢和荚膜、芽孢的大小和位置,放线菌和真菌的繁殖器官的形状、构造,孢子的数目、形状、大小、颜色和表面特征等。(2群体形态群体形态通常是指以下情况的特征:在一定的固体培养基上生长的菌落特征,包括外形、大小、光泽、黏稠度、透明度、边缘、隆起情况、正反面颜色、质地、气味、是否分泌水溶性色素等;在一定的斜面培养基上生长的菌苔特征,包括生长程度、形状、边缘、隆起、颜色等;在半固体培养基上经穿刺接种后的生长情况;在液体培养基中生长情况,包括是否产生菌膜,均匀浑浊还是发生沉淀,有无气泡,培养基的颜色等。如是酵母菌,还要注意是成醭状、环状还是岛状。

44、2、生理生化反应特征(1利用物质的能力包括对各种碳源利用的能力(能否以CO2为唯一碳源、各种糖类的利用情况等、对各种氮源的利用能力(能否固氮、硝酸盐和铵盐利用情况等、能源的要求(光能还是化能、氧化无机物还是氧化有机物等、对生长因子的要求(是否需要生长因子以及需要什么生长因子等。! + b a( B4 v& _. z3 v" |(2代谢产物的特殊性这方面的鉴定项目非常多,如是否产生H2S、吲哚、CO2、醇、有机酸,能否还原硝酸盐,能否使牛奶凝固、冻化等。(3与温度和氧气的关系" X, P5 ?9 D( M- _. v" W/ 测出适合某种微生物生长的温度范围

45、以及它的最适生长温度、最低生长温度和最高生长温度。对氧气的关系,看它是好氧、微量好氧、兼性好氧、耐氧还是专性厌氧。: T$ _33、生态学特征生态学特征主要包括它与其他生物之间的关系(是寄生还是共生,寄主范围以及致病的情况。在自然界的分布情况(pH情况、水分程度等、渗透压情况(是否耐高渗、是否有嗜盐性等。4、血清学反应很多细菌有十分相似的外表结构(如鞭毛或有作用相同的酶(如乳酸杆菌属内各种细菌都有乳酸脱氢酶。虽然它们的蛋白质分子结构各异,但在普通技术下(如电子显微镜或生化反应,仍无法分辨它们。然而利用抗原与抗体的高度敏感特异性反应,就可用来鉴别相似的菌种,或对同种微生物分型。用已知菌种、型或菌

46、株制成的抗血清,与待鉴定的对象是否发生特异性的血清学反应来鉴定未知菌种、型或菌株。该法常用于肠道菌、噬菌体和病毒的分类鉴定。利用此法,已将伤寒杆菌、肺炎链球菌等菌分成数十种菌型。5、生活史生物的个体在一生的生长繁殖过程中,经过不同的发育阶段。这种过程对特定的生物来讲是重复循环的,常称为该种生物的生活周期或生活史。各种生物都有自己的生活史。在分类鉴定中,生活史有时也是一项指标,如黏细菌就是以它的生活史作为分类鉴定的依据。& p Q% s/ x. b- r3 i$ c6、对噬菌体的敏感性4与血清学反应相似,各种噬菌体有其严格的宿主范围。利用这一特性,可以用某一已知的特异性噬菌体鉴定其相应的

47、宿主,反之亦然。二、微生物鉴别方法新技术新方法1、细胞壁组分分析细胞壁组分分析首先应用于放线菌分类中,把它作为区分“属”的依据之一。它比单纯用形态进行分类更全面。近年来,有人对18个属的放线菌的细胞壁进行了分析,根据细胞壁的氨基酸组成,将其分为6个细胞壁类型,又根据细胞壁的糖的组成分成4个糖类型,在此基础上,结合形态特征提出了相应的科属检索表。2、红外光谱IR一般认为,每种物质的化学结构都有特定的红外光谱。若两个样品的吸收光谱完全相同,可以初步认为它们是同一种物质。因此,红外光谱技术被应用到微生物的分类中。它先后对芽孢杆菌、乳酸菌、大肠杆菌、酵母菌进行分类,近年来又应用于放线菌分类中。根据有关

48、学者的试验表明,这种方法简便快速,样品少,结果较好,不仅可以初步了解各属菌的细胞成分的化学性质,同时也有助于微生物间系统发育关系的探索。但是它也有不足之处,借助于红外线光谱区分属内的种和菌株是困难的,但可以作为“属”的分类特征。3、气相色谱GC4、高效液相色谱HPLC5、质谱分析MS三、微生物鉴别方法分子生物学方法1、DNA碱基比DNA碱基比(G+Cmol%,以G+C物质的量分数(mol%表示:(G+Cmol%=(G+C/(A+T+G+C%该比值的变化范围很大,原核生物变化范围是20-78%,真核生物的变化范围为30%-60%。目前已经测定了大量生物的DNA碱基组成,从中可以发现一些带有规律性

49、的结论:亲缘关系密切而表型又高度相似的微生物应该具有相似的DNA碱基比;不同微生物之间的DNA碱基比差别很大,则表明它们之间亲缘关系疏远。DNA碱基比相同或相似的微生物并不一定表明它们之间的亲缘关系就一定相近,这是因为DNA碱基比只是指DNA中4种碱基的含量,并未反映出碱基在DNA分子中的排列顺序。一般认为,DNA碱基比相差超过5%就不可能是属于同一个种,DNA碱基比相差超过10%可考虑是不同属。DNA碱基比可用化学方法或物理方法测定。由于化学方法比较费时,而且误差也较大,因此目前比较常用物理方法进行测定,尤其是热变性温度法。该法操作比较简便,重复性较稳定,常被作为首选而采用。该法是用紫外分光

50、光度计测定DNA的熔解温度(Tm。它的基本原理是:首先将DNA溶于一定离子强度的溶液中,然后加热。当温度升到一定的数值时,两条核苷酸单链之间的氢键开始逐渐被打开(DNA开始变性分离,从而使DNA溶液365紫外吸收明显增加;当温度高达一定值时,DNA完全分离成单链,此后继续升温,DNA溶液的紫外吸收也不再增加。DNA的热变性过程(即增色效应的出现是在一个狭窄的温度范围内发生的,紫外吸收增加的中点值所对应的温度称为该DNA的热变性温度或熔解温度。在DNA分子中,GC碱基对之间有3个氢键,而AT碱基对只有2个氢键。因此,若细菌的DNA分子G+C含量高,其双链的结合就比较牢固,使其分离成单链则需较高的

51、温度。在一定离子浓度和一定pH的盐溶液中,DNA的Tm值与DNA的G+C含量成正比。因此,只要用紫外分光光度计测出一种DNA分子的Tm值,就可以计算出该DNA的G+C 含量。2、核酸的分子杂交前面已经谈到,亲缘关系相近的微生物,其DNA碱基比相同或相近。反之则不然,也就是说,DNA碱基比相同或相近的微生物,其亲缘关系并不一定相近。这是因为DNA 碱基比的相同或相近并不反映碱基对的排列顺序相同或相近,而微生物间的亲缘关系主要取决于它们碱基对的排列顺序的相同程度。因此,要确定它们之间的亲缘关系就要进行核酸的分子杂交试验,以比较它们之间碱基对序列的相同程度。核酸的分子杂交试验在微生物分类鉴定中的应用

52、主要包括DNA-DNA分子杂交和DNA-rRNA分子杂交等方法。DNA-DNA分子杂交:该方法的基本原理是利用DNA双链解离成单链(变性,单链结合成双链(复性,碱基配对的专一性,将不同来源的DNA在体外解链,并在合适的条件下使单链中的互补碱基配对结合成双链DNA。然后根据能生成双链的情况,测定杂合百分比。如果两条单链DNA的碱基序列完全相同,则它们能生成完整的双链,即杂合率100%;如果两条链的碱基序列只是部分相同,则它们生成的“双链”含有部分单链,其杂合率小于100%。因此,杂合率越高,表示两个DNA之间碱基序列的相似性越高,说明它们之间的亲缘关系也就越近。许多资料表明,DNA-DNA杂交最

53、适合于微生物种一级水平的研究。根据约翰逊1981年的试验指出,DNA-DNA杂交同源性在60%以上的菌株可视为同一个种,同源性低于20%者为不同属的关系,同源性在20-30%之间可视为属内紧密相关的种。核酸的分子杂交的具体测定方法很多。按杂交反应的环境可分为液相杂交和固相杂交两大类,前者在溶液中进行,后者在固体支持物上进行。在这些方法中,有的需要用同位素标记的DNA,有的则用非同位素标记。在细菌分类中,常用固相杂交法进行测定。这种方法的大致做法是:将未标记的各微生物菌株的单链DNA预先固定在硝酸纤维素微孔滤膜(或琼脂等上,再用经同位素标记的参考菌株的单链DNA小分子片段在最适复性温度条件下与膜

54、上的DNA单链杂交;杂交完毕后,洗去滤膜上未配对结合的带标记的DNA 片段;然后测定各菌株DNA滤膜的放射性强度。以参考菌株自身复性结合的放射性计数值为百分之百,即可计算出其他菌株与参考菌株杂交的相对百分数。这些百分数值即分别代表这些菌株与参考菌株的同源性或相似性水平,并以此数值来判断各菌种间的亲缘关系。DNA-rRNA分子杂交:DNA中(G+Cmol%测定和DNA-DNA分子杂交方法为微生物种和属的分类鉴定研究开辟了新的途径,解决了以表型特征为依据所无法解决的一些疑难问题。但是对许多属以上的分类单元的正确关系仍不能解决。因为许多研究表明,当两个菌株的DNA配对碱基少于20%时,DNA-DNA

55、分子杂交往往不能形成双链,因而限制了DNA-DNA分子杂交方法在微生物种以上单元分类中的应用。要解决这个问题,就要研究RNA的碱基序列,需要用rRNA与DNA进行杂交。RNA是RNA转录的产物。在生物进化过程中,其碱基序列的变化比基因组要慢得多,保守得多,它甚至保留了古老祖先的一些碱基序列。因此,当两个菌株的DNA-DNA杂交率很低或不能杂交时,用DNA-rRNA 杂交仍可能出现较高的杂交率,因而可以用来进一步比较关系更远的菌株之间的关系,进行属和属以上等级分类单元的分类。DNA-rRNA杂交和DNA-DNA杂交的原理和方法基本相同,都是利用核酸复性的规律。但两种方法也有差异:A. 在DNA-

56、rRNA分子杂交中,同位素标记部位在rRNA。B.B. DNA-rRNA分子杂交结果是以Tm值来表示。Tm值越高,表示亲缘关系越近。核苷酸序列分析从本章第一节可以看出,16SRNA大分子在生物进化研究中起着重要的作用。伍斯就是根据对60株细菌的16SRNA的核苷酸序列分析研究后,提出了生命的第三种形式-古细菌。16SrRNA序列同源性的应用不仅发现了古细菌,同时还揭示了细菌域各群间的系统发育关系,修正了许多细菌的分类地位,提出了不同于传统细菌分类体系的新的分类系统。新的分类系统体现了微生物分类的研究从表观特征向系统发育体系的发展。新的细菌分类系统与传统的细菌分类体系相比,也存在较多的差异,这主

57、要表现在:A、改变了细胞壁结构作为亲缘关系划分的标志之一,如无细胞壁的支原体,实际是革兰氏阳性的芽孢梭菌的一个后代分支。B、改变了营养类型作为种系发生的特征,如光合细菌并非是独立于非光合种群的进化分支,而是每种光合种群都代表了一个高阶的分类单元,其后代分支包括非光合细菌。C、尽管革兰氏阳性细菌是系统发育关系密切的一群细菌,但革兰氏阴性菌却包括了10个亚群。应用16SrRNA核苷酸序列分析法进行微生物分类鉴定,首先要将微生物进行培养,然后提取并纯化16SrRNA,进行16SRNA序列测定,获得各相关微生物的序列资料,再输入计算机进行分析比较,由计算机分析微生物之间系统发育关系并确定其地位。16SrRNA核苷酸序列测定和分析方法可分两类:16SrRNA寡核苷酸编目分析法和16SrRNA全序列分析法。16SrRNA寡核苷酸编目分析法的大致做法如下:从培养的微生物中提取并纯化16SrRNA,再将纯化的16SrRNA用核糖核酸酶(如T1核酸酶处理,水解成片段,并用同位素体外标记(也可以在培养微生物时进行活体标记,然后用双向电泳层析法,分离这些片段,用放射自显影技术确定不同长度的寡核苷酸斑点在电泳图谱中的位置,根据寡核苷酸在图谱中的位置,小片段的寡核苷酸分子序列即可确定。对于不能确