微生物遗传与育种(09140)

1、微生物遗传育种课程（09140）教学大纲一、课程基本信息课程中文名称：微生物遗传育种课程代码：09140学时与学分：76学时4学分（理论课52学时，实验课24学时）课程性质：专业选修课（必选）授课对象：生物工程专业二、课程教学目标与任务微生物育种学课程是为生物工程专业本科生开设的一门重要专业选修课，可在学生学习生物化学和微生物学之后选修该课程。该课程主要教授微生物育种的理论基础、诱变育种、代谢控制育种、杂交育种、原生质体融合育种、基因工程育种的原理和方法。通过本门课程的学习，学生可以掌握微生物育种的相关原理和具体方法，为从事生物工程领域的生产和科学研究打下基础。三、学时安排课程内容与学时分配表

2、章节内容课时第一章绪论1第二章遗传物质的基础2第三章基因突变3第四章工业微生物育种诱变剂4第五章工业微生物产生菌的分离筛选6第六章工业微生物诱变育种6第七章工业微生物代谢控制育种6第八章工业微生物杂交育种3第九章工业微生物原生质体育种和原生质体融合育种6第一章微生物基因组改组育种3第一一章基因工程育种3第一二章分子定向进化育种3第一三章高通量筛选技术3第一四章工业微生物菌种复壮与保3试验1细菌的原生质体融合6试验2乳酸菌筛选及抑菌作用研究6试验3香菇杂交育种6试验4细菌营养缺陷型筛选试验6四、课程教学内容与基本要求第一章 绪论教学目的：了解微生物育种在发酵工业中的地位，理解微生物育种的进展。基

3、本要求：通过教学，使学生了解本课程的研究对象和任务、微生物育种在发酵工业中的地位以及工业微生物育种的进展。重点与难点：重点：微生物育种的进展。难点：当前微生物育种的主要技术概览。教学方法：现代化教学手段，图片展示、讲述法。主要内容：第一节 工业微生物育种在发酵工业中的地位一、 微生物菌种二、 微生物菌种的重要性三、 微生物菌种特性四、 菌种来源第二节 工业微生物育种的进展一、 自然选育二、 诱变育种三、 杂交育种四、 代谢控制育种五、 基因工程育种六、 基因组改组（genome shuffling）七、 分子定向进化（molecular directed evolution of enzyme

4、）八、 高通量筛选技术(High throughput screening,HTS)第二章 遗传物质的基础教学目的：了解微生物遗传的基本知识，掌握微生物基因组的组织与结构。基本要求：通过教学，使学生回顾、了解微生物遗传的物质基础，掌握微生物基因组的组织与结构。重点与难点： 重点：微生物基因组的组织与结构。难点：微生物基因组与其他生物基因组的主要区别。教学方法：现代化教学手段，图片展示、讲述法。主要内容：第一节 染色体一、染色体形态二、原核生物及病毒染色体结构三、真核生物染色体结构四、染色体数目第二节 核酸一、核酸二、RNA三、DNA第三节 基因的组织与结构一、基因组二、基因三、遗传密码第三章

5、基因突变教学目的：了解基因突变的概念，掌握基因突变的本质和表型延迟现象。基本要求：通过教学，使学生了解基因突变的概念，掌握基因突变的规律和突变类型，理解突变型筛选的方法，理解影响因素和诱变作用的专一性，掌握表型、表型延迟的概念及突变的修复。重点与难点： 重点：基因突变的本质和表型延迟现象。难点：基因突变的规律和突变类型，突变型筛选方法。教学方法：现代化教学手段，图片展示、讲述法。主要内容：第一节 突变的分子机制一、基因突变二、染色体畸变和染色体组变第二节 突变引起遗传性状改变一、突变引起遗传性状改变二、突变型的种类第三节 突变体的形成一、突变体的形成过程二、突变的修复三、突变的表型效应四、表型

6、延迟第四章 工业微生物育种诱变剂教学目的：掌握微生物育种各种诱变剂及其诱变机理，了解诱变剂处理方法。基本要求：通过教学，使学生掌握诱变剂的概念、常见诱变剂的种类和诱变机理，了解各种诱变剂在微生物育种中的处理方法。重点与难点：各种诱变剂的作用机理。重点：各种诱变剂的作用机理。难点：诱变剂作用机理及其在微生物育种中的处理方法。教学方法：现代化教学手段，图片展示、讲述法。主要内容：第一节 物理诱变剂一、物理诱变剂的生物学效应二、非电离辐射紫外线三、电离辐射四、近年来发展的新型物理诱变剂第二节 化学诱变剂一、碱基类似物二、烷化剂三、脱氨剂（以亚硝酸为例）四、移码诱变剂五、羟化剂（以羟胺为例）六、金属盐

7、类七、其他化学诱变剂八、化学诱变剂的安全操作第三节 生物诱变剂一、噬菌体二、基因诱变剂第五章 工业微生物产生菌的分离筛选教学目的：掌握微生物野生菌株的分离筛选方法。基本要求：通过教学，使学生掌微生物的取样、好氧菌的分离筛选、厌氧菌的分离筛选的基本原理和方法，了解极端微生物和生物可降解塑料生产菌的筛选分离方法。重点与难点： 重点：微生物野生菌分离筛选程序和方法。难点：各种微生物野生菌筛选的基本原理和方法。教学方法：现代化教学手段，图片展示、讲述法。主要内容：第一节 含微生物样品的采集一、从土壤中采样二、根据微生物生理特点采样三、特殊环境下采样第二节 含微生物样品的富集培养一、控制培养基的营养成分

8、二、控制培养条件三、抑制不需要的菌类第三节 好氧微生物的分离一、稀释涂布和划线分离法二、利用平皿中的生化反应进行分离三、组织分离法四、单细胞或单孢子分离法五、通过控制营养和培养条件进行分离第四节 厌氧微生物的分离一、厌氧培养中几种除氧方法二、红螺菌的分离三、反硝化细菌的分离四、脱氮硫杆菌的分离五、乳酸菌的分离第五节 野生型目的菌株的筛选和菌选鉴定一、初筛二、复筛三、菌株鉴定第六节 极端环境微生物的分离筛选一、极端环境微生物的采样、分离筛选二、极端微生物酶分子生物学研究第七节 生物可降解塑料(PHA)菌株的分离筛选一、生物可降解塑料概况二、获得生物可降解塑料的微生物途径和菌株分离方法三、PHA的

9、合成机制和发酵特点第六章 工业微生物诱变育种教学目的：掌握微生物诱变育种的基本理论和方法。基本要求：通过教学，使学生掌握诱变育种的基本步骤和方法，掌握营养缺陷型菌株、温敏突变株、抗噬菌体突变株的诱变和筛选方法，了解微生物发酵过程的正交法和响应面法试验设计。重点与难点： 重点：微生物诱变育种的原理与方法。难点：诱变育种的基本原理、各种常用突变型筛选方法。教学方法：现代化教学手段，图片展示、讲述法。主要内容：第一节 诱变育种的试验设计和准备工作一、诱变前对出发菌株的了解二、全面了解菌种特性及其与生产性能的关系二、了解影响菌种生长发育的主要因素四、了解菌种有效产物中的各种组分在代谢合成过程中与培养条

10、件的关系五、建立一个准确、简便、快速检测产物的方法六、研究最佳的菌种保藏培养基和培养条件第二节 诱变育种的步骤与方法一、出发菌株二、出发菌株的纯化三、单孢子(或单细胞)悬液的制备四、诱变剂及诱变剂量五、诱变剂的处理方式六、影响突变率的因素第三节 突变株的常规分离与筛选一、诱变育种的基本环节二、筛选的程序三、分离和筛选四、摇瓶液体培养五、产物活性测定六、摇瓶数据的调整和有关菌株特性的观察分析七、培养基和培养条件的调整八、变种的特性研究与鉴定九、诱变育种实例第四节 营养缺陷型菌株的筛选一、营养缺陷型菌株的分离和筛选二、营养缺陷型突变株的应用第五节 温敏突变株的筛选一、温敏突变株的特性二、温敏突变株

11、的筛选方法三、温敏突变株在发酵工业中的应用第六节 抗噬菌体菌株的选育一、烈性噬菌体及其效价的测定二、温和性噬菌体及溶源菌三、抗噬菌体菌株的选育四、抗性菌株的特性研究五、抗噬菌体菌株选育的实例第七节 微生物发酵过程优化的正交法一、正交的含义二、正交试验设计方法三、正交试验结果第八节 微生物发酵过程优化的响应面法试验设计（自学）一、微生物发酵过程优化过程概述二、响应面法三、响应面法的应用实例第七章 工业微生物代谢控制育种教学目的：掌握微生物代谢育种的基本理论与方法。基本要求：通过教学，使学生掌握初级和次级代谢的调节控制以及微生物代谢控制育种的基本原理与方法。重点与难点： 重点：组成型突变株的选育和

12、营养缺陷型突变株选育。难点：组成型突变株、营营养缺陷型突变株的选育方法。教学方法：现代化教学手段，图片展示、讲述法。主要内容：第一节 概论一、初级代谢产物和初级代谢二、次级代谢产物和次级代谢三、初级代谢与次级代谢的关系第二节 初级代谢的调节控制一、酶合成的调节二、酶活性的调节三、反馈阻遏与反馈抑制的比较第三节 次级代谢的调节控制一、次级代谢产物的诱导调节二、次级代谢产物碳源分解调节二、次级代谢产物氮源分解调节四、次级代谢反馈调节五、磷酸盐的调节六、细胞膜透性的调节第四节 代谢调节控制育种一、组成型突变株的选育二、抗分解调节突变株的选育三、营养缺陷型在代谢调节育种中的应用四、渗漏缺陷型在代谢调节

13、育种中的应用五、抗反馈调节突变株的选育六、细胞膜透性突变株的选育七、其他抗性突变株的选育第八章 工业微生物杂交育种教学目的：掌握微生物杂交育种的基本理论与方法。基本要求：通过教学，使学生掌握放线菌、霉菌和酵母菌杂交育种的基本理论和方法。重点与难点： 重点：杂交亲本的遗传标记的选择。难点：细菌、放线菌和霉菌的杂交方法。教学方法：现代化教学手段，图片展示、讲述法。主要内容：第一节 微生物杂交一、杂交的意义二、微生物杂交育种基本程序三、杂交过程中亲本和培养基的选择四、杂交育种的遗传标记五、杂交育种方法第二节 放线菌杂交育种一、放线菌细胞结构与繁殖二、放线菌杂交概况和原理三、放线菌的杂交技术第三节 酵

14、母菌的杂交育种一、酵母菌的细胞结构和菌落形态二、酵母菌的生活史和繁殖方式三、酵母茵的杂交第四节 霉菌杂交育种一、霉菌的细胞结构和繁殖二、霉菌杂交的原理和杂交技术三、高产重组体的筛选第九章 工业微生物原生质体育种和原生质体融合育种教学目的：掌握微生物原生质体育种和原生质体融合育种的基本理论与方法。基本要求：通过教学，使学生掌握放原生质体制备、再生以及融合的方法步骤。重点与难点：重点：杂交、原生质体融合的定义和原生质体融合的过程及注意事项。难点：原生质体操作过程中渗透压的控制。教学方法：现代化教学手段，图片展示、讲述法。主要内容：第一节 原生质体育种一、原生质体再生育种二、原生质体诱变育种三、原生

15、质体转化育种四、原生质体融合育种五、其他微生物原生质体育种第二节 微生物原生质体融合育种一、直接亲本及其遗传标记的选择二、原生质体制备与再生三、原生质体融合四、融合体再生五、融合重组体检出与遗传特性分析六、原生质体融合的应用第三节 细菌原生质体融合育种一、概述二、细菌原生质体融合育种一般程序三、细菌原生质体融合育种技术第四节 放线菌原生质体融合育种一、放线菌细胞壁组成、结构及水解二、放线菌原生质体融合育种技术第五节 酵母菌原生质体融合育种一、酵母菌细胞壁结构和遗传标记二、酵母菌原生质体融合育种技术第六节 霉菌原生质体融合育种一、霉菌原生质体融合育种程序二、培养基及相关溶液三、霉菌原生质体融合的

16、关键步骤第一章 微生物基因组改组育种教学目的：了解微生物基因组改组育种的原理和意义，掌握基因组改组育种的基本方法和技术。基本要求：通过教学，使学生了解基因组改组育种的原理和意义，并通过实例，掌握基因组改组育种的基本方法和技术。重点与难点：重点：基因组改组育种。难点：基因组改组的具体原理和基本方法。教学方法：现代化教学手段，图片展示、讲述法。主要内容：第一节 微生物基因组改组育种意义和原理一、基因组改组育种概述二、基因组改组育种技术基本原理第二节 基因组改组育种技术及应用实例一、基因组改组育种技术二、基岡组改组育种技术应用实例第一一章 基因工程育种教学目的：了解基因工程在微生物育种中的应用和意义

17、，掌握基因工程的主要步骤。基本要求：通过教学，使学生了解基因工程在微生物育种中的应用前景和实际意义，基因工程载体的构建、重组体导入和重组子的筛选步骤和方法。重点与难点：重点：基因工程的主要步骤。难点：基因定位诱变方法。教学方法：现代化教学手段，图片展示、讲述法。主要内容：第一节 概述一、基因工程在微生物育种中的应用二、基因工程原理和步骤第二节 基因工程载体一、质粒载体二、入噬菌体载体三、柯斯质粒载体第三节 基因工程所用的酶一、限制性内切核酸酶二、DNA聚合酶三、依赖于DNA的RNA聚合酶四、连接酶、激酶及磷酸酶五、核酸酶第四节 基因工程的主要步骤一、DNA的制备二、目的基因的产生与分离二、DN

18、A的连接四、重组体导人大肠杆菌五、含重组质粒的细菌菌落的鉴定六、目的基因的表达第五节 基因定位诱变一、定位诱变方法二、将变异基因送回染色体第一二章 分子定向进化育种教学目的：了解微生物分子定向进化育种的原理，掌握定向进化育种的基本技术。基本要求：通过教学，使学生了解微生物分子定向进化育种的原理，分子定向进化育种的理性设计和非理性设计的基本步骤和方法。重点与难点：重点：分子定向进化育种的原理和基本技术。难点：定向进化文库的筛选方法。教学方法：现代化教学手段，图片展示、讲述法。主要内容：第一节 理性设计一、寡核苷酸引物介导的定点突变二、PCR介导的定点突变三、盒式突变第二节 非理性设计蛋白质(酶)

19、分子定向进化技术一、蛋白质(酶)分子定向进化的发展二、蛋白质(酶)分子定向进化策略三、定向进化文库的筛选方法四、酶分子工程的应用和发展前景第一三章 高通量筛选技术教学目的：了解微生物育种中高通量筛选的原理。基本要求：通过教学，使学生了解高通量筛选的基本原理，掌握高通量筛选的基本程序和方法。重点与难点：重点：高通量筛选原理。难点：高通量筛选的基本程序和方法。教学方法：现代化教学手段，图片展示、讲述法。主要内容：第一节 常用仪器设备一、微孔板二、微孔板恒温振荡培养器三、多通道移液器四、连续移液器五、多道连续移液器六、全自动移液工作站七、酶标仪(微板光度计)八、流式细胞仪九、条形码十、数据分析软件第

20、二节 高通量筛选技术中的常用一、漆酶的筛选二、OmpT蛋白酶的筛选第一四章 工业微生物菌种复壮与保教学目的：掌握菌种退化的原理和防止退化的方法。基本要求：通过教学，使学生掌握菌种退化和复壮的定义，理解和掌握防止退化及复壮的方法，掌握菌种保藏原理，理解菌种保藏注意事项，了解国内外主要菌种保藏机构。重点与难点：重点：菌种保藏的原理。难点：菌种退化的防止方法。教学方法：现代化教学手段，图片展示、讲述法。主要内容：第一节 菌种的退化与复壮一、菌种退化的原因二、菌种退化的防止三、菌种的复壮及其方法第二节 工业微生物菌种的保藏一、菌种保藏二、菌种保藏注意事项三、目前国内外主要菌种保藏机构五、课程教学方式与

21、考核方式1教学方式课堂教授为主，辅以实践（实验）教学。2考核方式闭卷考试：成绩占70%；实验成绩占20%，平时综合成绩占10%。六、参考教材及教学参考资料参考教材：施巧琴、吴松刚，工业微生物育种学（第三版），科学出版社，2009年03月出版。参考资料：1 诸葛健，李华钟，王正祥，微生物遗传育种学（第一版），化学工业出版社，2009年02月出版。2 金志华、林建平、梅乐和，工业微生物遗传育种学原理与应用（第一版），化学工业出版社，2006年01月出版。3 汪天虹，微生物分子育种原理与技术（第一版）， 化学工业出版社，2005年08月出版。七、实验教学内容与要求（一）实验教学目的与基本要求1教学目

22、的：（1）使学生全面了解微生物遗传育种学实验的科学内容和基本原理,熟练实验的操作方法和实验中所用的仪器、设备和药品；（2）训练学生正确掌握实验的操作方法和技能,学会进行综合实验或设计的设计、准备、操作和结果分析；（3）培养学生对实验原理、方法和结果进行正确的分析、理解, 仔细观察、认真思考的科学素养和分析问题、解决问题的能力. 2基本要求：（1）以小组为单位自主设计试验； （2）按照给定的题目（或自选题目)设计试验方案；（3）按照试验方案进行试验操作；（4）实验时,实验室应保持安静,切勿高声喧哗和随意走动；（5）实验时应认真进行观察和操作,做好实验的记录,有疑难问题向老师请教；（6）实验完毕后

23、,必须将所有用过的玻璃器皿清洗干净,用过的器物放回原处，未经老师同意,实验室中的任何菌种和物品不得带出室外。（7）写出完整的试验报告。（二）实验内容与基本要求1实验项目一览表序号实验项目名称学时实验类型实验类别每组人数实验室1细菌的原生质体融合6设计型必做6微生物学实验室2乳酸菌筛选及抑菌作用研究6设计型必做6微生物学实验室3香菇杂交育种6设计型必做6微生物学实验室4细菌营养缺陷型筛选试验6设计型必做6微生物学实验室5自选6设计型必做6微生物学实验室合计4个（5选4）2实验内容及要求实验一 细菌的原生质体融合一、实验目的和要求：1. 了解原生质体融合技术在微生物基础研究和改良菌种遗传性状方面的

24、应用。2. 掌握细菌原生质体融合的操作方法。二、仪器设备： 培养皿、移液管、试管、容量瓶、锥形瓶、烧杯、离心管、吸管、显微镜、离心机、分光光度计比色计、细菌过滤器、微波炉、高压灭菌锅、等。 三、实验材料：1 菌种和培养基枯草芽孢杆菌菌株T4412 （ade- his-）和TT2 （ade- pro-）或其他具有不同选择标记的菌株（可购买或通过诱变筛选获得）。完全培养基（CM，液体和液体），基本培养基（MM），补充基本培养基（SM），再生补充基本培养基（SMR），酪蛋白培养基（测蛋白酶活性用）。2. 试剂（1）缓冲液 0.1mol/L pH 6.0 磷酸缓冲液。 高渗缓冲液：

25、于上述缓冲液中加入0.8 mol/L 甘露醇。（2）原生质体稳定液（SMM）0.5 mol/L 蔗糖、20 mol/L MgC1 、0.02 mol/L 顺丁烯二酸，调pH 6.5。（3）促融合剂40聚乙二醇（PEG-4000）的SMM 溶液。（4）溶菌酶液取酶活性为4000 U/g的溶菌酶，用SMM 溶液配制，终浓度为2 mg/mL，过滤除菌备用。四、教学方法：讲述、自查资料学习、讨论。五、实验内容提要：细菌原生质体融合（bacterial protoplast fusion）是20世纪70年代发展起来的重要的基因重组技术，现已经成为细菌遗传育种的一项基本技术。该技术不但可以改良菌种遗传性状

26、、提高有用代谢产物产量，还可以综合不同菌株代谢特征，产生新的有用代谢产物，在工业生产和遗传育种上展示出美好的应用前景。同转化、接合、转导、杂交和转染等传统基因重组方式相比有以下优点：具有广泛适应性和随机性，能够打破菌株的种属界限，实现远缘菌株间的融合；可以使遗传物质传递更为完整，获得更多基因重组机会；可以和其他育种方法相结合，综合双亲的多种优良性状；在工业菌株的选育过程中，可以实现定向育种；能够用于遗传分析等基础理论研究等。细菌原生质体融合技术的整个过程包括：亲本菌株选择、原生质体的制备、原生质体融合、原生质体再生及融合子检出等主要步骤。亲本注意选择有不同标记的菌株，包括表型标记、生化标记、抗

27、药性标记、遗传标记等。原生质体的制备主要通过利用蜗牛酶或溶菌酶消化细胞壁获得。原生质体融合常采用诱导法，当前常用的方法主要有化学法、物理法和生物法等，其中化学诱导法主要采用聚乙二醇（PEG）接合高Ca2+进行诱导。原生质体再生后融合子的筛选主要是参照亲本菌株不同标记型进行，通过设计实验，淘汰亲本菌株，获得融合子。实验二 乳酸菌筛选及抑菌作用研究一、实验目的和要求：1. 掌握乳酸菌分离纯化的方法，并筛选1-2株具有广谱抑菌效果的菌株。2. 了解乳酸菌的抑菌作用。二、仪器设备： GL-20G- 11冷冻离心机、万分之一电子天平、不锈钢手提式压力蒸汽灭菌器、冷藏冷冻箱、数显恒温水浴锅、振荡

28、培养箱、电热恒温培养箱(20-600C)、电热恒温培养箱(5-600C)、超净工作台、DM型电热套、数码相机 三、实验材料：1样品来源 以市售新鲜大白菜叶片或其他含乳酸菌材料为样品来源。2培养墓采用改良的M17G培养基:胰蛋白陈5g，大豆蛋白陈5g,牛肉青5g，酵母膏，蔗糖5g，抗坏血酸, lmol/L硫酸镁1mL,蒸馏水1000mL, pH6.8-7.0, 121灭菌15min。若配制固体培养基则向其中加入1.5%琼脂。 另外，根据实际需要，需加入0.004%澳甲酚紫和15001U/mLJL酸链球菌素。乳酸乳球菌富集、发酵及斜面保藏：均采用改良的M17G培养基。指示菌培养基: 细菌

29、培养采用1.0%K2HP0;牛肉膏蛋白陈培养基:牛肉膏3g，蛋白陈log, NaCl 5g, K2HP04109，琼脂15g,蒸馏水1000mL，自然pH, 121 0C灭菌20min；酵母菌培养采用1.0%K2HP04 YPG培养基:酵母膏log蛋白陈20g;葡萄糖20g,K2HP04 log，琼脂15g,蒸馏水1000mL, pH 7.0, 121 C灭菌20min；真菌培养采用1.0%K2HP04 PDA培养基:马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g,K2HP04 log，自来水1000mL, pH自然，121灭菌20min。3指示菌金黄色葡萄球菌、单核增生李斯特氏菌、枯草芽饱杆菌、蜡

30、状芽抱杆菌、苏云金芽抱杆菌,嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、大肠杆菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌、酿酒酵母,热带假丝酵母、绿色木霉、番茄煤污尾孢霉等，选择其中23种。4主要试剂抗坏血酸、胃蛋白酶、胰蛋白酶，蛋白陈，胰蛋白膝、牛肉膏、酵母膏、葡萄糖、磷酸氢二钾、盐酸，琼脂，澳甲酚紫，七水硫酸镁，氧化钠、蔗糖、氢氧化钠，乳酸链球菌素四、教学方法：讲述、自查资料学习、讨论。五、实验内容提要：乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）是存在于人和动物肠道、许多食品、物料及少数临床样品中的一大类能发酵碳水化合物（主要为葡萄糖）产生大量乳酸的兼性厌氧菌。这是一群相当庞杂的细菌，目前至少可分为18个

31、属，共有200多种，主要包括乳杆菌（Lactobacillus）、乳球菌（Lactococcus）、明串珠菌（Leuconostoc）、片球菌（Pediococcus）、链球菌（Streptococcus）、肠球菌（Enterococcus）、双歧杆菌（Bifidobacterium）和肉食杆菌（Carnobacterium）等属。许多乳酸菌除产生乳酸、乙酸和双乙酰外，还可产生多种抑菌活性物质，包括细菌素，PHA，环肽化合物等，特别是乳酸菌细菌素以其安全、高效、无毒副作用和无抗药性等优点，广泛用于食品、医药、饲料等工农业生产。如在乳制品中，乳酸链球菌素已用于干酪、巴氏灭菌干酪、巴氏灭菌奶、罐藏

32、浓缩牛奶、高温灭菌奶、高温处理风味奶、酸奶等；在肉制品中，使用乳酸链球菌索的有罐装火腿、熏猪肉、成猪肉、香肠、真空包装的新鲜牛肉等；在啤酒中，乳链球菌素在低pH值、含酒花物质的环境下，活性不受影响，却能够有效的抑制啤酒中已发现的几乎所有的革兰氏阳性腐败菌，从而提高啤酒的生物稳定性。在医药应用方面，乳酸菌素具有：抑菌作用，用于治疗临床上因消化不良引起的腹胀、腹泻、胃肠炎等；改善肠道环境，能选择性杀死肠道致病菌，保护和促进有益菌的生长，调节肠粘膜电解质、水分平衡，调节胃肠道菌群平衡；提高免疫力，具有免疫调节作用，增强机体的特异性与非特异性免疫能力，激活吞噬细胞酶，刺激肠道产生IgA，增强机体的细胞

33、免疫和体液免疫，提高肠道免疫力；妇科阴道用药，含乳酸菌活菌的阴道用制剂，其代谢产物乳酸和过氧化氢等物质能保持阴道正常酸性环境乳酸菌可直接补充阴道内正常生理细菌，调节阴道内菌群平衡，抑制并消除阴道中的有害细菌的生长，故可用于由菌群紊乱而引起的细菌性阴道病的治疗。基于乳酸菌细菌素上述特点，已经引起广大从事乳酸菌、食品添加剂、益生素及开发新药等领域研究人员的极大兴趣，出现了研究热潮。目前的研究主要集中于新菌株和高产菌株的筛选以及对已知乳酸菌细菌素遗传因子的鉴定及结构基因的克隆和排序上。我国是一个乳酸菌资源非常丰富的国家，但对乳酸菌细菌素的研究起步较晚，除乳链球菌素（Nisin）外，对其他乳酸菌细菌素

34、还没有进行很好的基础研究和开发应用研究，因而大力进行乳酸菌细菌素的研究尤其是生化、遗传特性及基因调控方面的研究不仅具有重要的理论意义，且具有广阔的应用前景。乳酸菌主要从其自然生境（如各种泡菜、动物肠道、自然发酵饲料和奶制品等）中分离。分离时首先取样，稀释，涂布于乳酸菌分离培养基（BCP培养基），培养后挑取颜色变黄特征性菌落，多次划线纯化后保存于乳酸菌筛选培养基（改良MRS培养基）斜面试管中，然后通过菌落培养、镜检、生理生化及分子生物学实验做鉴定，获得纯菌株。做抑菌测验时，首先要进行液体培养获得乳酸菌发酵液及指示菌菌悬液，然后选择不同的方法如纸片法、牛津杯法及打孔法等测定抑菌作用。对于抑菌物质的

35、初步鉴定，需要先排除酸和过氧化氢的干扰，可以采用过氧化氢酶、pH改变、碳酸钙中和等方法进行。该实验涉及到菌株的分离、纯化与鉴定、菌株发酵条件优化、抑菌作用检测、抑菌物质初步鉴定等内容，可利用所学知识灵活设计。实验三 香菇杂交育种一、实验目的和要求：1掌握杂交育种的方法和技术 2了解香菇育种的基本知识与内容二、仪器设备： 培养皿、试管、容量瓶、锥形瓶、烧杯、离心管、吸管、显微镜、冰箱、细菌过滤器、微波炉、高压灭菌锅、超净工作台等。三、实验材料：1菌种和培养基两个不同交配型香菇菌株。可通过香菇子实体分离。PDA培养基，CYM培养基。2. 试剂琼脂、酵母粉、蛋白胨、KH2PO4、K2HPO

36、4、MnSO4、葡萄糖、蔗糖、青霉素等。四、教学方法：讲述、自查资料学习、讨论。五、实验内容提要：香菇的育种离不开性和交配型。香菇的有性生殖(Sexuality)是双因子控制的、异宗结合的。香菇的交配型由两个不亲和因子A和B控制着有性生殖的过程，其担孢子具有四种交配型：A1B1、A2B2、A1B2和A2B1。只有A和B因子完全不同的单核体才能交配形成可育的双核体菌株。香菇杂交育种方法包括：（1）香菇亲本的选择。待选择的双亲必须同时具有较多的优良性状、较少的缺点。这样杂交后，由于优势性状的互补性，所得后代性状易超出双亲性状。杂交亲本在来源上和生态型上要有较大的遗传差异。这是因为亲缘关系较远的、不

37、同地理条件来源的亲本杂交后，后代出现优势的机会大，易发生基因重组，出现超越双亲且适应性更强的品种。双亲要具有较好的亲和力，否则不能进行正常杂交。双亲之一最好是当地栽培种之一而另一个亲本最好为野生亲本。这样的双亲性状优势互补，杂交后抗杂性也会大大增强。（2）孢子的收集。亲本选定后，在大型的出菇场选择菇形完整的子实体，可采取弹射法或其他方法收集孢子。孢子收集后，稀释分离于PDA培养基上，2周左右可见孢子萌发，这时挑出单个孢子置于试管中。（3）孢子的镜检。挑取的担孢子培养一段时间后，挑取少许菌丝放在显微镜上检查，无锁状联合的菌丝为单孢子萌发的菌丝，挑出备用。淘汰有锁状联合的菌丝。（4）单孢子的交配。

38、将双亲的单孢萌发得到的单核菌丝进行杂交，在PDA培养基平板上，接种块相距左右。培养2周左右，见双亲菌丝己经融合，挑出融合处菌丝进行镜检，有锁状联合的双核菌丝。再将双核菌丝培养1周后，与双亲做拮抗试验，培养一段时间后，见与双亲拮抗且拮抗处有明显红褐色的隔离带的试管挑出。这个与双亲拮抗的菌丝即所得的杂交后代。（5）出菇试验。将杂交后代母种扩繁成一、二级种，进行锻木或代料栽培。观察子实体出现的时间、大小、性状、产量，随时详细记录。每个杂交后代都有自己的生理特性和形态特征，例如对温度、湿度、光照,pH等因素的关系，以及对木材的腐蚀性、出菇早晚、菇体大小等。通过对性状调查和比较，选出综合性状超过CK(对

39、照)的杂交后代，经过23年的重复试验，产量性状相对稳定后，就可以请专家进行现场测试和审定，命名后就可以应用于生产。实验四 细菌营养缺陷型筛选一、实验目的和要求：2.学习并掌握酵母菌氨基酸营养缺陷型的诱变、筛选及鉴定方法。二、仪器设备： 离心机，紫外线照射箱，冰箱，恒温箱，高压灭菌锅；三角烧瓶，试管，离心管，移液管，培养皿，接种针等。三、实验材料：1菌种和培养基大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或酵母菌。2试剂肉汤液体培养基，LE肉汤液体培养基，基本固体培养基，基本液体培养基，无N基本液体培养，2N基本液体培养基(成分及配制方法见后)。 20种基本氨基酸，7种微生素(硫胺素，核黄素，吡哆醇，泛酸，对氨基苯甲酸，烟碱酸，生物素)，嘌呤，嘧啶；亚硝酸钠，青霉素钠盐，冰乙酸，乙酸钠，氢氧化钠，硫酸镁，蔗糖；生理盐水，0.1mol/L醋酸缓冲液(pH=4.0)，0.1mol/L NaOH。 混合氨基酸(包括核苷酸)共分7组：其中第到第VI组各有6种氨基酸(包括核苷酸)，每种氨基酸(包括核苷酸)等量研细充分混合；第VII组为脯氨酸，因容易潮解，故单独组成。各组具体组成如下： I. 赖氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、嘌吟 II. 组氨酸、精氨酸、苏氨酸、谷氨酸、天冬氨酸(或甘氨酸)