副溶血性弧菌生物被膜培养条件及优化

1、副溶血性弧菌生物被膜的形成与优化渠宏雁 孟良玉 刘锦峰 蔡文倩 卢佳琨 张霞 兰桃芳 励建荣(渤海大学化学化工与食品安全学院,辽宁省食品安全重点实验室,辽宁省高校重大科技平台 “ 食品贮藏加工及质量安全控制工程技术研究中心 ” 辽宁锦州 121013摘要 本文主要探讨了各种环境因子对副溶血性弧菌生物被膜形成的影响,旨在为以后控制 细菌形成生物被膜提供依据。选用副溶血性弧菌为研究对象,采用微孔板检测法,用酶标 仪测得的 OD 630值确定副溶血性弧菌生成生物被膜的最佳条件。试验结果表明:起始细菌浓 度 7 logcfu/mL、培养温度 28、培养基 NaCl 含量 3%、培养基起始 pH 89时

2、,测得的 OD 630值最大;培养基中分别加入蔗糖、乳糖、葡萄糖, OD 630值均增加,且均在含量 2%时促进 效果最明显;培养基未稀释时,测得的 OD 630值最大,且随着培养基稀释度的增加而减小; 培养基中添加 Ca 2+促进生物被膜的形成而添加 Mg 2+、 Cu 2+、 Fe 3+对生物被膜的形成有抑制作 用。因此,副溶血性弧菌能形成稳定而明显的生物被膜,且生物被膜的形成受温度、 NaCl 浓度、 pH 值等环境因子的影响。关键词 副溶血性弧菌;生物被膜;优化细菌生物被膜 (Bacterial biofilm,BF 是指附着于生命或无生命物体表面被细菌胞外大分 子包裹的有机组织的细胞

3、群体。它们是细胞间相互协调,以多细胞群体形式组成的复杂结 构,是许多微生物适应外界环境的一种生活方式 1-4。据世界卫生组织估计,全世界每年数 以亿计的食源性疾病患者中有 70%是由于食用各种致病性微生物污染的食品和水源造成的 5。根据美国 CDC 统计,大约 65%的人类细菌性感染是由 BF 细菌引起的 6。大量研究证 实,几乎所有的细菌都可形成生物被膜。形成生物被膜被认为是导致食品加工环境中细菌 持续存在的一个主要原因 7-9。基金项目:“ 十二五 ” 国家科技支撑计划(课题编号:2012BAD29B06 ;辽宁省食品安全重点实验室暨辽 宁省高校重大科技平台 “ 食品贮藏加工及质量安全控制

4、工程技术研究中心 ” 开放课题(LNSAKF2011020 。作者简介:渠宏雁, (1988 ,女,硕士研究生*通讯作者:励建荣副溶血性弧菌(Vibrio Parahaemolyticus, VP 隶属于弧菌科弧菌属,为革兰氏阴性嗜 盐性海洋细菌 10,该菌主要存在于近海岸的养殖海域、海底沉积物和鱼、虾、贝等海产品 中,是海水养殖中的一种重要条件致病菌,也是我国沿海地区食物中毒和夏季腹泻的重要 病原 11-12,已经高居微生物性食物中毒首位 13。因此非常有必要搞清副溶血性弧菌生物被膜形成条件,可以有针对性地控制其在食品 及环境中的形成。本文通过初步探讨环境因素对副溶血性弧菌生物被膜形成的影响

5、,以期 为控制副溶血性弧菌生物被膜的形成提供一定的理论依据。1. 材料与方法1.1材料菌种:副溶血性弧菌(Vibrio Parahaemolyticus, VP :ATCC17802,购自中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心。培养基:3%氯化钠碱性蛋白胨水 (APW。主要试剂: NaCl ,冰醋酸,结晶紫, NaOH 。主要仪器:BCM-1000A 型生物洁净工作台,苏州净化过 滤设备有限公司; SC-303型电子管电热恒温培养箱,浙江省嘉兴县新腾电器厂; SLJ-I 型 中型电动离心机,沈阳市红星五金电器厂; DG5031型酶标仪,华东电子集团医疗装备有 限责任公司; DHG-907

6、5A 型电热恒温鼓风干燥箱,上海一恒科技有限公司。1.2方法将活化的菌种接种于 APW 液体培养基中, 28孵育 48h ,低温高速离心 (10000r/min, 10min 。弃去上清液,收集菌体,用无菌生理盐水保存于 4冰箱中,备用。采用平板菌落计数法统计菌落数,根据其稀释倍数和取样接种量换算出原样品中的含 菌数。制备 10倍递增稀释液,选择其中 3个适宜稀释度,分别用无菌吸量管吸取 1mL 放入 无菌平皿中与 15mL 45 3% NaCl 碱性蛋白胨琼脂培养基混合均匀, 28孵育 24h 后,选 择长有 30300个菌落的平板计数,将得到的菌落总数乘以稀释倍数,即可得到菌悬液的细菌浓度

7、。分别向培养基中加入 0%、 2%、 4%、 6%、 8%、 10%的蔗糖、葡萄糖、乳糖,测定 OD 630值,比较含不同浓度的 3种糖类时的成膜情况。分别向培养基中加入 0%、 1%、 2%、 3%、 4%、 5%、 6%、 7%、 8%、 9%、 10%、 11%的 NaCl ,测定 OD 630值,比较不同 NaCl 含量对生物被膜形成量的影响。将培养基起始 pH 设为 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11,用酶标仪法测定 OD 630值,比较 不同 pH 条件下的成膜情况。将培养基分别稀释 0倍、 20倍、 40倍、 60倍、 80倍、 100倍,测定 OD 630值,比较

8、培 养基稀释度不同时的成膜情况。将 含 量 为 0%、 0.25%、 0.50%、 1.00%、 1.50%的 Ca 2+(CaCl2 、 Mg 2+(MgCl2 、 Cu 2+(CuSO4 、 Fe 3+(FeCl3 分别加至培养基中,测定 OD 630值,比较不同浓度条件下几种金 属阳离子对成膜情况的影响。2. 结果与分析2.1细菌浓度对形成生物被膜的影响 123456780.000.050.100.150.20O D 值 细菌浓 度(logcfu/mL图 1 不同细菌浓度对形成生物被膜的影响Fig.1 Effect of bacterial concentrations on biofi

9、lm formation副溶血性弧菌生物被膜的形成与起始细菌浓度密切相关,由图 1可知,当细菌浓度为 13 logcfu/mL时, OD 630值明显增加;当细菌浓度达 3 logcfu/mL6 logcfu/mL时, OD 630值无显著差异; 57 logcfu/mL时 OD 630值逐渐升高,并于 7 logcfu/mL时达峰值; 78 logcfu/mL时试验组 OD 630值显著降低,可能是因为细菌浓度太高,导致竞争抑制所致。2.2孵育温度对形成生物被膜的影响4152837420.000.020.040.060.080.100.12O D 值 温度(图 2 不同温度对形成生物被膜的影

10、响Fig.2 Effect of different temperatures on biofilm formation由图 2可以看出,在 4和 15时, OD 630值较小,且二者差异不明显; 28时达到峰 值,显著高于其他温度组的 OD 630值;而 37和 42则不能形成生物被膜。2.3糖类对形成生物被膜的影响02468100.000.050.100.150.200.250.300.350.400.45O D 值 蔗糖含量(%图 3 不同蔗糖含量对生成生物被膜的影响 Fig.3 Effect of different sucrose concentrations on biofilm

11、formation02468100.000.050.100.150.200.25O D 值 葡萄糖含量(%图 4 不同葡萄糖含量对生成生物被膜的影响 Fig.4 Effect of different glucose levels on biofilm formation02468100.060.080.100.120.140.160.180.20O D 值 乳糖含量(%图 5 不同乳糖含量对生物被膜生成量的影响 Fig.5 Effect different lactose concentrations on biofilm formation蔗糖 葡萄糖 乳糖100200300400500提

12、 升 率 (% 糖类图 6 含量 2%时不同糖类对生物被膜生成量的影响Fig.6 Effect of three types of sugar with a density of 2% on biofilm formation由图 3图 5可知,培养基中添加蔗糖、葡萄糖、乳糖均可促进生物被膜的形成,并 且均在含量为 2%时促进效果最明显。将含量为 2%的蔗糖、葡萄糖、乳糖对形成生物被膜 的提升率进行比较,由图 6可知,蔗糖的提升率最高,促进作用显著,葡萄糖和乳糖次 之。0.000.020.040.060.080.140.160.180.20O D 值 NaCl含量(%图 7 不同含量 NaCl

13、 对生成生物被膜的影响Fig.7 Effect of different concentrations of NaCl on biofilm formation由图 7可以看出, NaCl 含量显著影响副溶血性弧菌生物被膜的形成。 NaCl 含量为 1%3%时,生物被膜的形成量逐渐增加,并且在 3%时达最大;随后,生物被膜的形成量 反而随着 NaCl 别喊了的升高呈下降趋势,有可能是渗透压太高不利于细胞生长的缘故。 因此,可以确定副溶血性弧菌在形成生物被膜时最佳 NaCl 含量为 3%。2.5 pH对形成生物被膜的影响0.000.020.040.060.080.140.160.18O D 值

14、pH值图 8 不同 pH 对生成生物被膜的影响Fig.8 Effect of various pH on biofilm formation由图 8可以看出,在起始 pH 为 45时,副溶血性弧菌不生长,生物被膜不能形成; pH 68时, OD 630值逐渐增高,且在 pH 为 8时达峰值,差异极显著;随后, OD 630值随 pH 的升高而下降;培养基 pH 为 8和 9时, OD 630值差异不显著。2.6 培养基稀释度对形成生物被膜的影响 0204060801000.000.020.040.060.120.140.16O D 值 稀释倍 数图 9 不同稀释度的培养基对生成生物被膜的影响F

15、ig.9 Effect of different concentrations of the culture media on biofilm formation由图 9可以看出,培养基未稀释时,测得的 OD 630值最大,生物被膜的形成量最多; 当培养基稀释 20倍时,测得的 OD 630值减少了一半;稀释 40100倍时, OD 630值随培养 基稀释倍数的增加而逐渐减少。2.7金属阳离子对形成生物被膜的影响0.000.050.100.150.200.25O D 值 Ca 2+含量(%图 10 Ca2+对形成生物被膜的影响Fig.10 Effect of Ca2+on biofilm fo

16、rmation00.250.020.040.060.080.100.120.140.16O D 值 Mg 2+含量(%图 11 Mg2+对形成生物被膜的影响Fig.11 Effect of Mg2+0.000.020.040.060.080.100.120.140.16O D 值 Fe 3+含量(%图 12 Fe3+对形成生物被膜的影响Fig.12 Effect of Fe3+ on biofilm formation0.000.020.040.060.120.140.16O D 值 Cu 2+含量(%图 13 Cu2+对形成生物被膜的影响Fig.13 Effect of Cu2+ on bi

17、ofilm formation在培养基中添加 Ca 2+可促进生物被膜的形成,且加入量不同,促进效果不同;而 Mg 2+、 Fe 3+和 Cu 2+对生物被膜的形成有抑制作用,且添加浓度为的 1.00%的 Mg 2+、 0.25%的 Fe 3+和或 0.25% Cu 2+均可对副溶血性弧菌生物被膜的形成产生良好的抑制效果。由图 10可以看出,培养基中 Ca 2+含量为 0.25%时, OD 630值无明显变化; Ca 2+含量为 0.50%时,OD 630值增加最显著; Ca 2+含量为 1.00%时,对生物被膜的形成促进作用不明显; Ca 2+含量 为 1.50%时, OD 630值与空白组

18、相较明显增加,可促进生物被膜的形成。由图 11可以看 出,培养基中 Mg 2+含量为 0.25%1.00%时, OD 630值随添加量的增加而下降,并于 1.00%处降至最低; Mg 2+含量为 1.00%1.50%时, OD 630值差异不显著。由图 12可以看出,培养 基中 Fe 3+含量为 0.25%时, OD 630值下降极明显, Fe 3+含量为 0.50%1.50%时, OD 630值随 Fe 3+添加量的增加而下降,但差异不显著。由图 13可以看出,培养基中 Cu 2+含量为 0.25%时, OD 630值显著下降; Cu 2+含量为 0.50%1.50%时, OD 630值随含

19、量增加而下降,但是差 异不显著。3. 讨论Leah 等 14认为细菌的黏附能促进生物被膜的形成,细菌的黏附量会随着菌浓度的升高 而增加,因此较高的菌浓度有利于生物被膜的形成,这与本文的结果类似。副溶血性弧菌在低温下 (低于 15 生长迟缓,这可能是低温下生物被膜发育缓慢的主 因之一; 3740副溶血性弧菌虽能维持生存,但不能形成生物被膜,这可能是胞外酶类物 质对温度敏感的原因所致,另外, Ulitzur 15认为高温抑制鞭毛的生成,而鞭毛的运动会促 进生物被膜的形成 16。副溶血性弧菌在稍高温度下形成生物被膜的特性也可以从一个侧面 说明为什么由副溶血性弧菌引发的疾病多发生在水温较高的季节。本试

20、验显示副溶血性弧 菌在 NaCl 含量为 1%6%时生物被膜形成较好, Na +能够驱动海洋菌鞭毛的运动,当 NaCl 含量过高时,副溶血性弧菌不能生长,故而不能形成生物被膜,这与本试验结果相符。本 实验显示副溶血性弧菌形成生物被膜量较多的 pH 范围为 89, pH 过低引起的酸化作用可 导致细菌胞外分泌物质的变性 17,而 pH 过高抑制细菌鞭毛的合成,不利于菌体聚集,从 而影响生物被膜形成 15。试验结果显示 Ca 2+能促进副溶血性弧菌形成生物被膜,这与 Ca 2+能促进霍乱弧菌形成生物被膜相似 18。 Banin 19等认为 Ca 2+在不同程度上维护铜绿假单胞 菌生物被膜的结构,而

21、加入 Mg 2+、 Cu 2+、 Fe 3+后的培养液具有亲水性,生物有机体分散生 长,这可能是其显著抑制副溶血性弧菌生物被膜形成的原因。4. 结论副溶血性弧菌能形成稳定的生物被膜,且其生物被膜的形成与温度、 NaCl 含量、 pH等环境因子有着密切关系。副溶血性弧菌生物被膜形成的最佳细菌浓度为 7 logcfu/mL,最 佳培养温度为 28,最佳 NaCl 含量为 3%。培养基起始 pH 对生物被膜的形成有很大的影 响,最适 pH 范围是 89,培养基中适当添加糖类 (葡萄糖、乳糖、蔗糖 可增加生物被膜的 形成量,并且最适浓度均为 2%;向培养基中添加 Ca 2+可以增加生物被膜的形成量,添

22、加 Mg 2+、 Fe 3+、 Cu 2+会抑制生物被膜的形成;当培养基未稀释时,生物被膜的形成量最多, 随着稀释倍数的增加,形成量逐渐减少。参考文献1 Costerton J W, Lewandowski Z, Caldwell D E, et al. Microbial biofilmJ. Annual Review of Microbiol, 1995, 49(6:711-745.2 Costerton J W. Introduction to biofilmJ. International journal of antimicrobial agents, 1999, 217-221.3

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