基础生物学实验教材-学生使用版2011

1、说明：本教材适用于生命科学类专业，课时安排为30学时加1个实验周。实验要求：1、 同学自备：实验报告本、铅笔（2B/HB/2H/3H 各一支，削尖）、削笔刀、软绘图橡皮、圆规、直尺、实验服等用具。2、 认真预习实验内容，熟悉实验目的、原理和方法。3、不迟到、不早退，保持整洁、安静、有序的实验环境。4、实验台面保持整洁，书包等物品不能放在试验台上。5、药品摆放整齐、有序，公用试剂用毕，物归原处。6、 凡挥发性、有烟雾、有毒和有异味气体的实验，均应在通风橱内进行。7、实验试剂粘到皮肤，应立即用大量水冲洗，并用棉花沾甘油涂沫，将腐蚀物吸收出来；若不慎溅入眼睛，立即报告老师，进行必要处理。8、实验废弃

2、物、毒害性实验材料应倾倒在指定地点，统一处理。9、不能在实验室内饮食，以免误食和吸入有害物质。10、实验室内的一切物品，未经老师批准，严禁携带出室外。11、实验结束，须做好仪器清洗工作，并将实验记录交给教师签字后，方可离开。12、 使用试剂和各种耗材注意节约；洗涤和使用仪器时应仔细，；面对未知正确操作的仪器，须在教师的指导下使用；仪器发现故障或损坏要及时报告，不得擅自动手检修。凡非正常使用造成的实验设备损坏均要进行等价赔偿。课 程 时 间 安 排第五周 实验一 光学显微镜使用与细胞结构观察第六周 实验二 细胞骨架的光学显微镜观察第七周 实验三 叶绿体的分离制备与观察第八周 实验四 植物原生质体

3、的分离和融合第九周 实验五 DNA的细胞化学Feulgen反应第十周 实验六 细胞水平的生物进化第十一周 实验七 减数分裂第十二周 实验八 果蝇的饲养、性状观察和雌雄鉴别第十三周 实验九 果蝇唾腺染色体的观察第十四周 实验十 鲫鱼的解剖实验周1周 组织制片技术自备教学用具：实验报告册、铅笔（2B/HB/2H/3H 各一支，削尖）、削笔刀、绘图软橡皮、圆规、直尺、实验服等用具。实验1 光学显微镜使用与细胞结构观察一、实验目的 (1)熟悉普通光学显微镜的主要结构、基本性能和维护方法；(2)掌握低倍镜、高倍镜和油镜的正确使用方法；(3)在普通光学显微镜下识别细胞和细胞器的形态结构；(4)学习和练习徒

4、手切片；掌握生物绘图的方法。二、实验原理普通光学显微镜(microscope)利用可见光作光源照明，用玻璃透镜作为成像系统，标本中各点依其光吸收(即光的振幅发生变化)的不同而在明亮的背景中成像。实验室常用的是光学复式显微镜，至少含有两组以上透镜组成，其有效放大倍数可达1,250倍，最高分辨率为0.2m。光学显微镜还包括研究用的暗视野显微镜、相差显微镜和荧光显微镜等。细胞在形态上是多种多样的，它们有共同的基本结构，都由细胞膜(动物)、细胞壁(植物)、细胞质和细胞核组成。般经过固定和染色处理后，在光学显微镜下是可以看见大多数的细胞器，如线粒体、高尔基体、中心体、核仁、染色体等。三、实验仪器、材料和

5、试剂(1)普通光学显微镜、擦镜纸、动植物组织细胞装片、香柏油、二甲苯，无水乙醇、擦镜纸(2)单面刀片、小镊子、载玻片、盖玻片、吸水纸、胶头滴管、洋葱鳞茎、马铃薯块茎、黄瓜。(3)试剂：1结晶紫水溶液、用50乙醇配制的1番红溶液、1美蓝溶液、碘液；1中性红溶液，配法：称取0.5g中性红溶于50ml Ringer液，稍加热(3040)使之很快溶解，用滤纸过滤，装入棕色瓶于暗处保存，否则易氧化沉淀，失去染色能力。临用前，取1中性红溶液1ml，加入29ml Ringer溶液混匀，装入棕色瓶。Ringer溶液：NaCl 8.5g(用于青蛙等变温动物则改为6.5g)、CaCl2 0.12g、NaHCO3

6、0.20g、KCl 0.14g、Na2HP04 0.01g、葡萄糖2.0g，加蒸馏水至1000ml。四、实验内容与方法一、观察光学复式显微镜的结构复式显微镜由光学系统部分和用以装置光学系统的机械部分组成(图1-1)。1物镜(objective)：一般在镜头上注明放大倍数和数值孔径（N.A.表示镜口率，反映了镜头分辨力的大小，其数字越大，表示分辨力越高。）2目镜(eyepiece)：安装在镜筒上端，也叫接目镜，通常由两个透镜组成，上面的透镜与眼接触，叫接目镜；下面一个靠近视野叫会聚透镜或视野透镜。目镜的作用是将物镜所成的像进一步放大。一般在目镜镜头上注明有放大倍数。3反光镜(反射镜，reflec

7、ting mirror)：常用的显微镜是在底座上安装卤钨灯光源。4聚光器(或聚光镜，condensor)：由聚光镜(几个凸透镜)和虹彩光圈(可变光栏)等组成，它可将平行光线汇集成束，集中在一点，以增强被检物体的照明。一般配合使用物镜，升降聚光器。5虹彩光圈(aperture)：装在聚光器内，由一组活动金属片组成，构成一个可开可缩的孔。拨动其外侧的一小操作杆柄可使光圈扩大或缩小，借以调节通光量。下方常装有滤光片架。 图1-1 普通光学显微镜的结构示意图(a)单目显微镜；(b)双目显微镜1目镜；2镜筒；3物镜转换器；4物镜；5通光孔；6聚光器；7光圈；8反光镜；9粗调节器；10细调节器；11镜臂；

8、12移片器；13载物台；14倾斜关节；15镜柱；16镜座；17标本移动器螺旋；18灯室 二、普通光学显微镜的使用方法(一)用前的准备工作1.取镜和放置打开镜箱，按固定编号(即学号对应的实验座位编号)取出显微镜。操作规范：打开镜布，右手直接握住镜臂金属部分；稍微将镜身向前推，使左手能托住镜座；均匀用力小心地把显微镜从镜箱内取出；移动过程中保持镜体直立，防止目镜从镜筒中滑出；放置显微镜时，将镜身前端轻轻接触实验桌面，移到正确位置，然后腾出左手，将镜身放平稳。一般应放在座位的左侧，距桌边约56 cm处，以便观察和防止显微镜掉落。检查显微镜的各部件是否完整和正常，如发现有部件损坏或出现故障，应立即停止

9、使用，待排除故障或修复后，才能继续操作。使用聚焦粗调节其将镜筒略升高(或将载物台下降)使物镜与载物台距离拉开，以免物镜与载物台相碰。然后旋转物镜转换器，将低倍镜对准载物台中央的通光孔(可听到“咔哒”声)。2对光 使用电光源时应接通电源，打开开关，调整电位器旋钮，使光亮合适并充满整个视场，再利用聚光镜或虹彩光圈调节光的强度，使视野内的光线既均匀明亮又不刺眼。3双目镜筒间距的调节 调节双目镜筒间距时，用10×物镜观察，双眼注视目镜，同时水平方向向外或向内拉动目镜筒，使两目镜的中心距离与观察者的瞳孔距离一致，此时两个圆形视野合二为一。(二)使用显微镜（按照物镜倍数由低到高的顺序）1低倍物镜

10、的使用 低倍镜视野范围大，容易发现目标和确定要观察的部位。操作步骤如下：(1)放标本片：标本片有样品的一侧朝上，放到载物台前方，然后推到物镜下面，用弹簧夹夹住标本片，旋转载物台定位旋钮，使玻片标本要观察的部分移到正对通光孔的中心。(2)调节焦距：接通低倍物镜(4×或10×)的光路，从显微镜侧面注视物镜镜头，缓慢旋转粗调节钮，使低倍镜的镜头端与玻片间的距离约5mm。再用左眼从目镜里观察视野，慢慢转动粗调节钮，直至视野中出现物像。转动细调节钮，使物像达到最清晰为止。根据需要移动玻片，把要观察的部分移到视野正中心，聚焦。调整聚光器、虹彩光圈和照明灯的电压，使视野的亮度既能清晰观察

11、又不造成眼睛疲劳。故障分析和处理：如果看不到物像，可能由以下原因造成： (1)转动调节钮太快，超过焦点，应按上述步骤重新调节焦距。(2)物镜光路不正确，应将镜头推出，然后再次推回，听到“咔哒”声。(3)标本偏离视野，应移动标本片寻找观察对象。(4)光线太强，尤其观察比较透明的标本或没有染色的标本时，易出现这种现象，应调节聚光器或光源强度，将光线调暗一些后再观察。2高倍物镜的使用高倍物镜(40×)只能把低倍镜视野中心的一小部分加以放大。操作步骤： (1)依照上述操作步骤，先用低倍镜找到清晰物像。 (2)将需要观察的部分移到视野的中央。 (3)眼睛从侧面注视物镜，用手移动转换器，换高倍镜

12、。 (4)眼睛向目镜内观察，同时微微上下转动细调节钮，直至视野内看到清晰的物像为止。故障分析和处理：如看不到物像时，可能由下列原因造成： (1)观察的部分没在视野内，应在低倍镜下寻找到后，移到视野中央，再换高倍镜观察。(2)标本片放反了，应把标本片放正后，再按上述步骤操作。(3)焦距没调好，应仔细调节焦距。注意事项：正常情况下，当换上高倍物镜后，只要略微调动细调节器，就可获得清晰的物像。换用高倍镜观察时，视野变小变暗，要重新调节视野亮度。有的显微镜高倍镜与低倍镜不配套，往往转不过来或撞坏标本。如遇到这种情况，可把镜筒略升高(或载物台下降)，直接用高倍镜调焦方法是：从侧面注视物镜，调节粗调节钮，

13、使高倍镜头下降至与标本片最短距离，再观察目镜视野，慢慢调节细调节钮，使镜头缓缓上升，直至物像清晰为止。如需要更换标本片时，应该先把镜筒升高(或载物台下降)，然后把标本片移到载物台前方，再取下。3油镜的使用油浸物镜也只能把高倍物镜视野中心的小部分加以放大。操作步骤：(1)先按低倍镜到高倍镜的操作步骤找到物像，把要放大观察的部分移到视野中央。 (2)把高倍镜移开，在标本片上滴一滴香柏油(镜油)，眼睛从侧面注视镜头，轻轻转换油镜，使镜面浸在油滴中。在一般情况下，转过油镜即可看到物像，如不清楚，可来回调动细调节钮，即可看清物像。如仍看不清，应按上述步骤可重复。注意事项：用油镜观察标本时，绝对不许使用粗

14、调节器，只能用细调节器调节焦点。如盖玻片过厚，则不能聚焦，应注意调换，否则就会压碎玻片或损伤镜头。 当使用高级显微镜时，某些聚光器镜口率在1.0以上，此时，还要在聚光器上面滴加一滴香柏油(油滴位于载玻片与聚光器之间)，以便使油镜发挥应有的作用。 (3)找到物像后，再调节聚光器和光圈，选择最适光线。(4)油镜使用完毕后，需立即擦净！（否则，镜油干燥后，很难清洗，甚至会使镜头报废！） 旋动粗调焦，把镜头上升约1Omm，并将物镜转到一边。用擦镜纸把镜头擦净。如果仍然擦不干净，可用擦镜纸蘸取少许擦镜水（专用的光学清洁剂是乙醚和无水乙醇的1：3混合液)或二甲苯（最好不用二甲苯，尤其是观察树胶封片的标本之

15、后，以免二甲苯浸入镜头，使透镜松动；而且二甲苯的味道很呛人，有毒）轻擦，然后再用干净的擦镜纸擦12遍，将镜头上残留的油迹擦去。拉纸法擦油的操作方法：先将一小张擦镜纸对折两次，在纸条的中央再滴上擦镜水或二甲苯，平拉擦镜纸，反复几次即可擦净。换用干净的擦镜纸，重复12遍。(5) 标本片也需要立即擦净！（标本片也是昂贵的教学用具。）有盖片的标本片，可用擦镜纸蘸少许擦镜水或二甲苯，把油擦净。无盖片的标本片，可用拉纸法擦油。方法是：先把一小张擦镜纸盖在油滴上，再滴上二甲苯，平拉擦镜纸，反复几次即可擦净。也可以在二甲苯中把油洗去晾干。(三)显微镜使用后的整理（请注意操作顺序）调节电压调节旋钮到最小值，然后

16、关掉电源开关。旋转粗调节器，使载物台下降到最低位置，取下标本片，将标本夹卡尺调到两端大致相等，擦干净镜体。将物镜调节器旋至两个低倍镜之间，以断开光路。然后用右手握住镜臂，左手平托显微镜底座，按号收回镜箱中并罩上防尘罩。关闭镜盒，并在登记本上记录使用前后的设备状况、签全名。三、显微镜使用练习(1)低倍镜使用练习：取一张A字片，用低倍镜观察。练习对光、调焦，并注意观察物像与玻片移动方向是否一致，镜下观察的字母是正像还是反像?(2)高倍镜使用练习：取一张标本片，先用低倍镜观察，换高倍镜观察。调节焦距，注意观察上下细胞的清晰度。(3)油镜使用练习：制一张简易涂片，先用低倍镜、高倍镜观察，再练习用油镜观

17、察。注意比较三种物镜的放大倍数和分辨率有何不同。练习擦洗油镜头和标本片。四、徒手切片技术与生物绘图（一）制作和观察一个植物细胞的临时徒手切片（新鲜材料，不必固定和染色） 徒手切片法，狭义上是指用刀把新鲜材料切成薄片的方法。广义来讲，只要不经任何处理而直接用刀或徒手切片器切新鲜材料，通称徒手切片法。方法与步骤如下：1取材和切片：切取一小段(长约2 cm)植物的茎(或其他器官)，用左手拇指、食指和中指夹住材料，材料要稍高于拇指2 mm左右，右手执双面刀片（单面刀片或解剖刀片均可），刀片要锋利，刀口向内自左向右拉刀。切时用臂力而不用腕力，用力不要太猛，不要直切。切片时只动右手，左手不动，更不要来回拉

18、切。图1-2 徒手切片切片前刀口及材料都要蘸水。每切几片后，用毛笔蘸水将材料转移到有水的培养皿中，然后选择最薄的进行染色装片。有些材料过于柔软，则需要夹入萝卜、黄瓜、胡萝卜或土豆等较硬又易切的夹持物中，将这些材料制成1cm×1cm×5cm的小长条，将待切的材料夹在中间，连同夹持物一起切。2临时装片法：先用滴管在洁净载玻片中央滴一滴清水，然后把准备好的实验材料放在载玻片上的水滴中，用解剖针或镊子将材料展开，使各部分都在同一平面上。用镊子夹起盖玻片，使盖玻片的一边接触水滴边缘，然后轻轻放下盖玻片。需要染色时，可在盖玻片一边加一滴染色剂，在盖玻片另一端用吸水纸吸水，让染色剂迅速扩

19、散，进到材料中进行染色。也可以在加盖盖玻片前加染色剂。注意事项：使用刀片时注意安全。（二）生物绘图-绘制所观察到的一个细胞首先用圆规在实验报告本上画出表示视野范围的圆，通常比实际视野的范围大，才能够清晰地表示出显微镜下观察到的结构。如果要多幅图绘在一张纸上，绘图前应合理布局，力求页面整齐。画图时要用左眼投向显微镜视野，一边用左眼看所要绘制部分的构造，一边用右眼看着手中铅笔进行描绘（实际上两个眼睛是同时开着的，需要不断练习才能掌握）。用绘图专用的硬铅笔和软橡皮，笔尖要削得尖而适当，以保证图面清晰。图应画在布局范围内稍偏左侧的位置；图中各部分构造的图注应放在右侧，用平行线引出，平行线末端要齐；注字

20、要工整，一般用阿拉伯数字标注；在图的正下方第一行安排图号、名称，第二行开始标注阿拉伯数字具体指代的结构名称，最后一行安排放大倍数和处理方法（多使用括号）。 图各部分的位置和比例必须与显微镜中实际观察的各部分位置及比例相一致。本实验只要求绘制一个完整的细胞（实际工作中，多数情况下要求突出所观察结构中最典型的部分，或实验观察的重点部分）。同时，绘出与该细胞接触的其它细胞的部分轮廓，表明所绘制的细胞处于一个群体中。图1-3 显微结构图的绘制步骤1细胞质 2核仁 3细胞核 4液泡 5细胞膜6细胞壁以小点描绘显微构造中所观察到的内容物，点的密集与稀少表示内容物的稠密与稀疏。这些点是用铅笔尖垂直于图纸所绘

21、出的点，切勿带出尾巴。例子（图中省略了表示视野范围的圆）：描绘一个洋葱细胞的构造。选定所描绘的细胞后，首先要在显微镜中目测出细胞长度和宽度比例，并在图纸上草拟出长与宽的大抵界限(图2-1A)，再以轻线条草拟出细胞的一般形状及与相邻细胞间的联系(图2-1B)，进一步以轻线条绘出细胞核、核仁、液泡所在部位的轮廓图(图2-1C)；最后对照显微镜下所观察到的实际图，检查初步草拟轮廓图所规定的各部分比例，看看图像是否接近实际并做最后的修正，用坚定、准确、清晰的线条做最后的描绘，并予以正确的图注(图1-3D)。五、作业 绘制所观察到的一个细胞；反复练习徒手切片操作，直到获得一片较好的临时装片。实验2 细胞

22、骨架的光学显微镜观察一、实验目的 了解细胞骨架的结构特征及其制备技术。二、实验原理 细胞骨架(cytoskeleton)是由蛋白质丝组成的复杂网状结构，根据其组成成分和形态结构可分为微管、微丝和中间纤维。它们对细胞形态的维持，细胞的生长、运动、分裂、分化，物质运输，能量转换，信息传递，基因表达等起到重要作用。当用适当浓度的Triton X-100处理细胞时，可将细胞质膜中和细胞质中的蛋白质和全部脂质被溶解抽提，但细胞骨架系统的蛋白质不受破坏而被保存，经用戊二醛固定，考马斯亮蓝R250染色后，可在光学显微镜下观察到由微丝组成的微丝束为网状结构，就是细胞骨架。三、实验仪器、材料和试剂1 仪器、用具

23、：普通光学显微镜、50ml烧杯、玻璃滴管、容量瓶、试剂瓶、载玻片、盖玻片、镊子、小剪刀、吸水纸、擦镜纸。2 材料：洋葱鳞茎。3 试剂：（1） M-缓冲液：咪唑3.40g、氯化钾3.70g、氯化镁(MgCl2·6H2O) 101.65mg、EGTA(乙二醇双醚四乙酸) 330.35mg、EDTA(乙二胺四乙酸) 29.22mg、巯基乙醇(1 mol/L) 0.07ml、甘油(4mol/L) 292ml、蒸馏水加至1000ml。 （2） 磷酸缓冲液(PBS，pH=7.2)：氯化钠8.0g、氯化锌2.0g、磷酸二氢钾0.2g、磷酸氢二钠、1.15g、蒸馏水1000ml。（3） 1Trito

24、n X-100：取1ml Triton X-100原液，加入99ml用M-缓冲液，混匀时注意控制泡沫的产生。（4） 0.2考马斯亮蓝R250：考马斯亮蓝R250 0.2g、甲醇46.5ml、冰醋酸7ml、蒸馏水 46.5ml。其溶剂为：甲醇46.5ml、冰醋酸7ml、蒸馏水46.5ml。（5） 3戊二醛：25%戊二醛 3ml、磷酸缓冲液（pH7.2）97ml。使用前配制。四、方法与步骤(1) 撕取洋葱鳞茎内表皮若干片(每片约1cm×1cm大小，每人至少准备5片)；(2) 用小烧杯取混匀的pH7.2酸缓冲液的2050ml，将洋葱内表皮浸入，用小镊子或载玻片使其下沉，保持10 min。（

25、避免样品打卷，注意用小镊子夹住样品搅动）(3) 用另一个小烧杯装入1020ml的1Triton X-100，将样品用小镊子捞起、吸水纸吸去样品表面的磷酸缓冲液，放入，处理2030 min。（关键步骤一，注意适当搅动和防止样品卷曲）(4) 吸去Triton X-l00，用M-缓冲液洗3次，每次10min。（新鲜缓冲液洗2次即可）（关键步骤二，适当搅动和避免样品卷曲可以更有效地去除细胞膜和细胞质中的蛋白质）(5) 3戊二醛固定0.51h。（关键步骤三，至少20min才能保证骨架蛋白的完全变性）(6) pH7.2磷酸缓冲液洗三次，每次10min。（关键步骤四，对实验结果的影响最大。用新鲜缓冲液洗2次

26、即可，搅动时要减少样品卷曲和破坏）(7) 0.2考马斯亮蓝R250染色2030min。（新鲜染液作用15min即可）(8) 用蒸馏水洗12次（关键步骤五，可以准备两个烧杯或培养皿，分别装入蒸馏水，用小镊子夹住样品浸入第一份蒸馏水中，迅速搅动几次，洗去所有的染料，再转入另一份蒸馏水中浸泡，装片时再捞出。）。(9) 将材料捞出置于载玻片上的水滴中，小心展开平整，加盖玻片，于普通光学显微镜下观察（评价标准：没有蓝色背景，表明细胞膜处理完全；丝状的骨架蛋白从细胞核延伸到细胞膜，表明细胞质处理得当）。多观察几片材料，选择最满意的一个细胞请老师观察和评分。五、作业 绘出植物细胞骨架微丝结构图。实验3 叶绿

27、体的分离制备与观察一、实验目的学习分离与纯化叶绿体的方法，了解细胞器分离制备的一般原理和程序。二、实验原理 将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的粘度有关。在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部分批收集即可获得各种亚细胞组分。叶绿体是比较大的细胞器，在叶肉细胞中含量丰富，用新鲜的植物叶片匀浆后使用普通离心机进行离心也能得到良好分离效果。叶绿体得率可通过检测叶绿素含量

28、来确定。叶绿体的分离应在等渗溶液（0.35mol/L NaCl或0.4mol/L蔗糖溶液）中进行，以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。同时，叶绿体的酶系对热敏感，在室温下容易失活。如要得到功能完整、能保持其酶系的活性的叶绿体，在实验中所需基本仪器和药品都必须保持在冰箱中，而且整个操作过程都应在04条件下完成；如果在室温下，要迅速分离和观察。三、实验仪器、材料和试剂1、仪器、用具：显微镜、镜油、擦镜纸、载玻片、盖玻片、离心机、瓷研钵、盘式天平、剪刀、纱布、玻璃漏斗、烧杯、量筒、玻棒、滴管、吸水纸、分光光度计、水浴锅。2、材料：新鲜的菠菜叶或豌豆叶。3、试剂：STN缓冲液： 0.4M蔗糖，0.01M

29、 NaCl，0.005M MgCl2 溶于0.05M三羟甲基胺基甲烷（Tris）-HCl缓冲液，调pH7.6。 配制方法：6g Tris,136.9g蔗糖，0.58g NaCl, 0.29g MgCl2加入蒸镏水750ml  混合后用1N HC1调pH至7.6，然后用蒸馏水稀释到1升。80%丙酮四、方法与步骤（一）叶绿体的制备1 菠菜或豌豆叶片洗净，吸干表面水滴，贮在4冰箱中备用（最好使用浓绿的新鲜叶片）。2取10ml分离介质（STN缓冲液）分两次放入研钵中。3去掉叶柄和主脉，称取5克叶片并把叶片剪成12cm2小块和介质一起在钵中研磨，磨成匀浆为止（可添加少许石英砂，避免过度匀浆及产

30、生泡沫）。4将匀浆液用二层纱布过滤到烧杯中。5滤液用1000rpm离心8分钟，弃去沉淀，留上清液。6上清液中加入介质5ml，混匀，再以1000rpm离心8分钟，弃去沉淀，留上清液。7上清液用2500rpm离心1020分钟，弃上清液，留下沉淀的叶绿体小球。8加入适量（0.20.5ml）冷却的STN缓冲液，将沉淀的叶绿体全部悬浮，将叶绿体悬浮液贮存于冰箱中。9转移出0.5ml叶绿体悬浮液到另一支干净试管中，在60水浴中保持5分钟，然后取出试管，贴上标签再贮存于冰箱中。10分别在两张载片上各滴一滴加热和未加热的叶绿体悬浮液，用盖片盖起来，在油镜下观察这两种叶绿体的形态。（二）检测叶绿素含量1、 5&

31、#181;l叶绿体悬液与995µl的80丙酮在微量离心管中混匀。2、 13 000g，室温离心2min。3、 取溶液在663nm及645nm处检测吸光值。4、 计算：叶绿素含量（mg/ml）=(8.02 A663 + 20.2 A645) /5 五、作业观察经过加热和未加热这两种叶绿体在形态上的区别，并绘出草图。实验4 植物原生质体的分离和融合一、实验目的 学习植物原生质体的分离制备与原生质体融合技术。二、实验原理植物原生质体是去除了细胞壁的裸露的细胞。纤维素酶能消化除去细胞壁，从而可从植物组织中分离出大量具有生理活性的原生质体。原生质体可从培养的单细胞、愈伤组织和植物器官(叶、下胚

32、轴等)获得。但一般认为从叶肉组织分离原生质体是理想的材料，其优点是材料来源方便，供应及时，而且遗传性较为一致。而从单细胞和愈伤组织分离到的原生质体，由于受培养条件的和继代培养的影响，易使细胞间发生遗传和生理差异。所以，从培养的单细胞和愈伤组织中获得的原生质体不是十分理想的材料。植物原生质体的融合又称体细胞杂交技术。它是以原生质体分离、培养技术为基础，借助动物细胞融合方法发展和完善的一门新型生物技术，通过细胞融合技术可以克服种、属以上植物有性杂交不亲和性障碍。诱导融合的方法有物理法、化学法。物理法常用电场、显微操作、离心、振动等机械力促使原生质体融合。化学法是用不同的试剂为诱导剂诱导融合。目前常

33、用和较为有效的化学方法是PEG（聚乙二醇）与高PH-高Ca结合法。本实验采用PEG（聚乙二醇）与高PH-高Ca结合法来处理两亲本原生质体的混合悬浮液，诱导原生质体聚集，继之发生融合，最后合并成双核或多核细胞。可用于测定原生质体活力的方法：方法一：染色法。可用荧光素双醋酸盐(fluorescein diacetate，FDA)、酚藏花红、伊文思蓝等染料对原生质体染色后，显微镜检查原生质体的活力。FDA染色后，在荧光显微镜下检查，活的原生质体发出黄绿色的荧光。0.01酚藏花红染色后，光学显微镜检查，活的原生质体染成红色。用0.25伊文思蓝染色，染成蓝色的原生质体为无活力。方法二：胞质环流法。在显微

34、镜下观察，凡具有胞质环流者，为代谢旺盛的原生质体。原生质体的产量和活力与所用酶的质量和处理时间有关，每克材料大约加10ml酶液。原生质体培养的密度是影响培养成功与否的重要因素，起始密度一般为104105个/ml。三、实验仪器、材料和试剂1、仪器、用具：离心机、天平、剪刀、水浴锅、带盖离心管（10ml）、300目镍丝网（或尼龙网）、解剖刀、镊子、滴管、吸管、显微镜、盖玻片、培养皿、烧杯等。2、材料：烟草叶片(如果不需要培养杂合细胞，可以选用其他浓绿色的蔬菜叶片)、胡萝卜、西红柿。3、试剂（选择粉末状酶制剂，并保存在-20；用之前再配制溶液，并且4保存。）纤维素酶、果胶酶、甘露醇、甘氨酸、CaCl

35、2·2H20、葡萄糖硫酸钾、KH2P04、PEG（6000）（一）酶液制备 （1）洗涤液：甘露醇06molL，CaCl2·2H2O 35mmolL，KH2P04 0.7 molL，(pH5.6)， （2）混合酶液：2纤维素酶、1果胶酶溶于洗涤液中(pH5.6)，需过滤除菌。 （二）诱导液制备 （1）PEG溶液: 100ml水中含PEG 50g，CaCl2·2H20 150mg，KH2P04 10mg，可加热帮助溶化。 （2）高PH-高Ca溶液A液：100 ml水中含有葡萄糖5.4g，甘氨酸0.75g ，用NaOH调PH至10.5，置4黑暗处保存。B液：100ml

36、水中含有葡萄糖5.4g， CaCl2·2H2O 1.47g。A液、B液临用时等量混合 （三）等渗溶液（0.35mol/L NaCl或0.4mol/L蔗糖溶液）或原生质体培养基。四、方法与步骤（一）原生质体分离制备1、称取0.5g生长良好，60100d苗龄的烟草（蚕豆）植株中上部的叶片，用自来水洗净。吸干表面水滴，用镊子小心撕去叶片下表皮（如为胡萝卜，用解剖刀切去表皮和中柱，取用皮层部；西红柿直接取果肉），将叶片切成小片（或胡萝卜切成薄片）浸入盛有5ml 混合酶液的小三角瓶中，盖后置2830保温23小时，其间轻轻摇荡几次。2、取少量悬液于载玻片上，在显微镜下检查原生质体分离情况。去壁完

37、全而活性正常的原生质体应呈球形，边缘光滑，质体内部较透明，在高倍镜下可观察到原生质体环流运动。3、将酶解后的原生质体悬液，用300目镍丝网（或尼龙网）过滤到10ml 离心管中，以除去未酶解完全的组织。4、将滤液用600r/min的速度离心5min，使原生质体沉淀，用吸管除去上层酶液。5、加入约5ml洗涤液，小心将原生质体悬浮起来，待悬液充分混匀后，再一次离心。这样反复操作洗涤23次，洗净酶液与残余的细胞碎片。6、加入约5ml 0.8mol/L甘露醇溶液，用吸管将原生质体轻轻冲起制成密度约105 个/ml的原生质体悬浮液备用，（必要时取少量用血球 计数板计数后统计密度，计算血球计数板上四角的四大

38、格内的细胞总数，按下列公式即可算出每毫升悬浮液中的细胞数。 细胞数ml =（四大格的细胞总数/4 ）×10 000×稀释倍数）7、用胞质环流的方法测定原生质体的活力。 （二）原生质体的融合1. 离心融合法(注意滴管口产生的剪切力对原生质体的损伤，操作要慢而均匀。)(1)将两种来源的原生质体悬液各2.5ml，在离心管中等量混合。500r/min 离心5分钟，使原生质体沉淀，吸去上清液。(2)加入约3倍量的PEG溶液，用吸管将原生质体重新悬浮混匀，在2530水浴锅中保温2030分钟。(3)用细吸管吸取0.5ml高PH-高Ca2+溶液，缓慢从一边或四周滴入原生质体与PEG的混合液

39、中，约10分钟滴完。然后再吸取0.5ml高PH-高Ca2+溶液，约10分钟滴完(滴加速度过快可能会导致局部的高PH-高Ca2+ ，使细胞损伤。)(4)将离心管500r/min 离心3分钟，使原生质体沉降浓缩，再将离心管置37水浴中保温。(5)每隔10min取样，置载玻片上，加盖盖玻片后在显微镜下观察聚集和融合情况，记录每次观察到的聚集程度和融合率。(6)保温约40分钟后，取出离心管，加洗涤剂5ml，静置30分钟。(7)如需培养，用相应的培养基洗两次后，即可接入培养基中，送入培养室。2玻片融合法(1)取一带凹槽的玻片(普通载玻片也可以)，洗净，烘干、（灭菌）。(2)将两种来源的原生质体

40、悬液等量混合在一个干净的小离心管中。(3)用干净吸管取23滴混合后的原生质体，放于载玻片上，静置15min，使原生质体贴在玻片上。(4)用另一支吸管将23倍体积的PEG溶液缓慢滴加在原生质体上，2730温育20min。(5)用另一支吸管吸取0.5ml高PH-高Ca2+  溶液，缓慢加到原生质体上，静置510min。（可以覆盖盖玻片，以方便清洗步骤）(6)将玻片稍微倾斜，小心用吸水纸吸去上清，再将少量等渗溶液或培养基滴到原生质体周围，小心用吸水纸将液体吸去，重复12次，以洗涤原生质体。(7)镜检观察。 注意事项：1. 为便于观察和识别融合体，常选择两种带有不同色素和形态结构的原生质体作

41、为亲本，如用绿色的叶肉细胞和黄色的胡萝卜肉质根细胞等2. 原生质体的质量会影响融合的效果，最关键的是脱壁完全，否则不能做融合亲本。3. 有的原生质体会很快长出细胞壁，因此洗去酶液后应立即进行融合。4. 如融合原生质体不做继续培养，实验步骤至3就就可结束。如需长期培养，实验操作应在无菌条件下进行。五、作业1. 根据实验结果写一份实验报告，要求用流程图说明实验过程及注意事项。绘图表示原生质体聚集和融合的图像。2. 如作长期培养，整个实验应作如何修改？有那些注意事项。实验5 DNA的细胞化学Feulgen反应一、实验目的 了解Feulgen反应的原理，掌握有关的操作方法。二、实验原理DNA经1mol

42、/L盐酸水解，其上的嘌呤碱和脱氧核糖之间的键打开，使脱氧核糖的第一碳原子上形成游离的醛基，这些醛基与Schiff试剂反应。Schiff试剂是由碱性品红和偏重亚硫酸钠作用，形成无色的品红液，当无色品红与醛基结合则形成紫红色的化合物。因此凡有DNA的地方，都能显示紫红色。紫红色的产生，是由于反应产物的分子内含有醌基，醌基是个发色基团，所以具有颜色。材料不经过水解或预先用热的三氯醋酸或DNA酶处理，得到的反应是阴性的，从而证明了，Feulgen反应的专性。图5-1 Feulgen反应 三、实验仪器、材料和试剂 (1)仪器、用具：显微镜、恒温水浴箱、温度计、解剖针、酒精灯、试管、烧杯、载玻片、盖玻片、

43、吸水纸、微量移液器及配套吸头。 (2)材料：洋葱鳞茎或根尖。 (3)试剂 1) 1molL盐酸的配制：取82.5ml密度1.19gml的浓盐酸加蒸馏水至1000ml。 2) Schiff试剂的配制及保存：称取0.5g碱性品红加入到100ml煮沸的蒸馏水中(用三角烧瓶)，时时振荡，继续煮5min(勿使之沸腾)，使之充分溶解。然后冷却至50时用滤纸过滤，滤液中加入10ml 1molL HCl，冷却至25时，加入0.5g Na2S205(偏重亚硫酸钠)，充分振荡后，塞紧瓶塞，在室温暗处静置至少24h(有时需23d)，使其颜色退至淡黄色，然后加入0.5g活性炭，用力振荡1min，最后用粗滤纸过滤于棕色

44、瓶中，封严瓶塞，外包黑纸。滤液应为无色也无沉淀，贮于4冰箱中备用。如有白色沉淀，就不能再使用，如颜色变红，可加入少许偏重亚硫酸钠或钾，使之再转变为无色时，仍可再用。 3)亚硫酸水：取200ml自来水，加10m1 10偏重亚硫酸钠(或偏重亚硫酸钾)水溶液和10ml 1mol/L HCl，三者于使用前混匀。四、方法与步骤 (1)将洋葱根尖或鳞茎内表皮放在1 moL/L HCl中，加热到60水解810min。 (2)蒸馏水水洗。 (3)Schiff试剂遮光染色30min。 (4)用新鲜配制的亚硫酸水溶液洗3次，每次1 min。 (5)水洗5min。 (6)将根尖放在载玻片上，镊子捣碎，盖上盖玻片，压

45、片(洋葱表皮可省去压片这一步)。 (7)显微镜检查，细胞中凡有DNA的部位应呈现紫红色的阳性反应。对照片 方法一：先将材料放在5三氯乙酸中90水浴15min，主要把DNA抽提掉，然后按步骤(1)(7)制片观察。 方法二：材料不经1 mol/L HCl水解，直接放在Schiff试剂中染色，然后按步骤(4)(7)制片观察。 五、作业 (1)简述Feulgen反应的原理和实验的关键步骤。 (2)绘图示洋葱根尖细胞或鳞茎表皮细胞DNA的分布部位。普通遗传学部分实验6 细胞水平的生物进化一、实验目的 1、 比较真核细胞和原核细胞结构的异同，了解线粒体来源的内共生学说，了解原核细胞和真核细胞在进化上的关系

46、，建立细胞进化的概念。2、 了解植物细胞和动物细胞结构的异同点。3、 初步掌握常规的细胞活体染色技术。二、实验原理地球上现存的有记载的生物种类大约200多万种，还有许许多多种生物没有被发现，没有发现的生物数目可能要比已经发现的多10倍，更何况已经绝灭的生物比现存的还要多得多。据估计，曾在地球上生活过的生物种数可能多达5亿10亿。这么多的生物从无到有，从少到多，从简单到复杂，从低等到高等，一批又一批地“踏上”地球，又“远离”地球走向灭亡，进行着自然界的“新陈代谢”，这就是生物的进化。19世纪，达尔文提出的以自然选择学说为核心的生物进化论，已被广大学者所承认，任何理论通常都要随着知识的增加而改进，

47、随着遗传学和生态学等现代生物科学的发展和深入到生物进化理论的研究，使达尔文进化理论不断完善和发展，形成了以自然选择学说为基础的现代生物进化理论。地球上现存的种类繁多的生物与构成生物的各种细胞器是几亿年漫长岁月的进化产物，但是这些不同种类的生物与细胞在进化上都相互联系，他们都是由共同的祖先原始细胞经过长期的进化与演变而来的。在地球发展的某个时期，大约在30亿年前，产生了原始细胞，从此才有了独立的生命。    真核细胞由原核细胞进化而来，这是对细胞进化的一种合乎逻辑的解释。原核细胞与真核细胞的亲缘关系应该表现在他们所共有的结构体系与功能体系。有无细胞器是区别原核细胞与

48、真核细胞的重要标志（图1），既然真核细胞是由原核细胞进化而来，那么真核细胞的一系列重要细胞器如何起源于演化必然是问题的核心。由于线粒体DNA与叶绿体DNA的发现，以及线粒体与叶绿体的起源问题展开了一场相当深入的辩论，这是建立在细胞生物学与分子生物学实验基础上的一次相当有益的争论。线粒体与叶绿体的内共生起源学说占有明显优势，根据这一学说，线粒体是起源于一种细菌类的原核细胞，而叶绿体是起源于蓝藻类的原核细胞，他们最早被原始的真核细胞吞噬进细胞内，与宿主进行长期的共生，而演化为重要的细胞器。  图1 真核细胞（左）与原核细胞（右）    1970年Margul

49、is在分析了大量资料的基础上提出了一种设想，认为真核细胞的祖先是一种体积巨大的，具有吞噬能力的细胞。而线粒体的祖先原线粒体则是一种革兰氏阴性菌，它们不仅能进行糖酵解，而且能利用氧气，把糖酵解的产物丙酮酸进一步分解获得更多能量。当这种细菌通过吞噬作用进入真核细胞后，不仅没有被消化，而且真核细胞利用这种细菌（原线粒体）充分供给能量，而原线粒体也更多的依赖宿主细胞获得更多的原料，这种共生开始显然是“互利的”，逐渐的原线粒体失去了原有的一些特征，关闭与丢失了很多基因，但至今还保留着很多祖先的基本特征。     细胞内的结构在自然状态下近于无色，一般要经过染色后方

50、可在普通光学显微镜下显示得较为清楚。不同的细胞组分对各种染料的亲合力不同。两者间亲和力强，染色就深，否则，染色就浅或无，这样便能形成足够的反差以区分细胞的组分。一般生物染料不能穿透细胞膜，只有用化学试剂或物理方法固定细胞，破坏细胞膜结构后，染料才能进入细胞内部发挥其染色作用。有些染色剂对细胞无毒或毒性很小，并能进入活细胞内染色，显示活细胞的某些结构，称为活体染色，活体染料多为碱性染料（解离后带正电），如中性红，詹纳斯绿、次甲基蓝、甲苯胺蓝等。它们能使细胞中某些特定结构着色，如中性红可以染色细胞质中的液泡，詹纳斯绿则染色线粒体等。本实验正是从染料对细胞及其结构的染色特点这一角度来验证线粒体的内共

51、生学说。三、实验仪器、材料和试剂4 实验材料：大肠杆菌、人体口腔粘膜细胞、新鲜菠菜叶5 实验试剂：0.02詹纳斯绿染色液（生理盐水配制）、清水（置于滴瓶中）；6 仪器设备：光学显微镜载玻片，盖玻片，消毒牙签，吸水纸，镊子；试剂的配制（1） 0.5g詹姆斯绿(Janus green)溶解于50ml生理盐水中1%詹姆斯绿染液（2） 配制0.9%的生理盐水200ml。称取1g詹姆斯绿，溶于50ml生理盐水中，再用生理盐水稀释100倍，得0.02%詹姆斯绿染液装入棕色瓶备用。（3）0.05g 詹姆斯绿溶解于5ml Ringer液。（4）Ringer液（复合生理盐水）：0.25g kcl+0.85gNa

52、cl+0.03gCacl 加入100ml水） 四、方法与步骤1、 大肠杆菌菌体染色观察在玻璃片中央滴加一滴0.02%詹姆斯绿染液，用牙签从新鲜生长的大肠杆菌菌落中挑取牙签头大小的菌体，在染液中涂展开来，使之分布均匀，染色3分钟后加上盖玻片，在显微镜下由低倍镜到高倍镜再用油镜进行观察。细菌细胞被染成蓝绿色，杆状，活细菌在显微镜下可以观察到运动状态。2、观察人口腔上皮细胞线粒体线粒体是广泛存在于动、植物细胞中的重要细胞器。它呈短棒形，长0.43微米，宽0.30.8微米，光学显微镜刚好能看清它的轮廓(光学显微镜分辨率在0.2微米)。线粒体是细胞内糖、氨基酸、脂肪酸最终氧化的场所，所以有“动力工厂”之

53、称。利用这个性质，线粒体可使特异性染料詹姆斯绿(Janus green B)保持氧化状态，呈蓝绿色，线粒体周围的细胞质中的詹姆斯绿被还原成无色状态，从而显示线粒体。实验步骤：(1)把清洁的载玻片平放在桌上，滴上数滴詹姆斯绿染液于载玻片中央。(2)用消毒牙签的钝端在自己口腔颊粘膜处稍用力刮取口腔上皮细胞，均匀地涂到载玻片的染液中。盖上盖玻片，四周溢出的染液用吸水纸吸干。(3)5分钟后用高倍镜或油镜观察，可以看到在接近无色的口腔上皮细胞的细胞质中，特别是在细胞核周围，散布着许多被染成蓝绿色的短棒状或颗粒状结构，即为线粒体。观察人体口腔黏膜细胞中线粒体的形态及染色情况，比较其与大肠杆菌形态与染色的相

54、同之处。2、 菠菜叶片表皮细胞的观察先取洁净的载玻片，在上面加滴一滴清水。取新鲜菠菜叶片，用刀片在叶片背面横切一条裂口，自裂口处与表面平行插入镊子撕取表皮。表皮撕下后面朝下立即放入载玻片的水滴中，盖上盖玻片，用吸水纸吸取多余水分，即可观察。在显微镜下观察植物细胞的形态和结构，以及叶绿体和液泡等结构。比较植物细胞和动物细胞的不同之处。注意事项： 詹姆斯绿染液浓度不宜过高，染色时间不宜太长，否则细胞质会重新氧化成有色状态而不能充分还原染料成无色状态。配制时间：詹姆斯绿染液宜在使用时配制新鲜液，不可久存。分析与讨论 真核细胞内一般都存在线粒体，但存在的数量相差较大。动物细胞中的心肌细胞和肝脏细胞中线

55、粒体数量最多；植物细胞中幼苗和贮藏组织的细胞中线粒体较多。选取植物细胞的材料应该避免组织坚硬、细胞壁厚老及富含叶绿体的材料，宜选黄化幼苗或新鲜、生长势旺的组织。五、作业 绘出大肠杆菌、人口腔上皮细胞、菠菜叶片表皮细胞图。实验7 减数分裂一、实验目的、通过实验，了解植物花粉形成过程中的减数分裂的过程，并观察染色体的动态变化。、通过实验，学会和掌握细胞染色体的一般压片、染色、制作等基本方法和技术。二、实验原理减数分裂是在配子形成过程中所发生的一种特殊的有丝分裂。一个花粉母细胞连续进行两次的分裂，而染色体只真正的分离了一次。因此，一个含有2n染色体的花粉母细胞，经过连续的两次分裂后，便形成了四个子细胞，而每一个细胞中只含有单倍数的染色体（n），即染色体为母细胞中的一半。在适当的时候，采集植物花穗，进行固定、染色、压片，即可在显微镜下观察到减数分裂的分裂相。三、实验材料及采集1、材料: 玉米雄花序2、材料的采集玉米为雌雄同株的植物，玉米雄花序位于植物的顶端。在雄花序的尖端露出前710天，这时，顶叶尚未抽出，用手由喇叭口顺序向下挤捏叶鞘，捏及松软感时，这就是雄花序所在部位，然后以刀片纵向划开茎叶，取出幼穗即可。3、固定、保存取下的幼穗，立即置于刚配好的卡诺氏固定液中，进行固定，可