土壤微生物多样性及其研究方法综述

1、JournalofAnhuiAgriSci2011，39（28）：1727417276，17278安徽农业科学，责任编辑金苹责任校对况玲玲土壤微生物多样性及其研究方法综述蔡晨秋，唐丽，龙春林（中央民族大学生命与环境科学学院，北京100081）摘要围绕土壤微生物多样性的内涵，可将土壤微生物多样性分为遗传多样性、功能多样性、物种多样性和生态多样性4个研究层面；另将土壤微生物多样性的主要研究方法归为3类，即：传统平板培养法、生物化学方法和分子生物学方法，并分别对各方法进行介绍和评述，最后提出该领域研究的发展趋势。关键词微生物多样性；PLFA；FISH；PCR；宏基因组学中图分类号S1543文献标识码

2、A文章编号05176611（2011）281727403SoilMicrobialDiversityandItsResearchMethodsCAIChen-qiuetal（CollegeofLifeandEnvironmentalSciences，MinzuUniversityofChina，Beijing100081）AbstractThisarticlefocusesontheintensionofsoilmicrobialdiversity，dividessoilmicrobialdiversityintofourresearchlevels：geneticdi-functionald

3、iversity，speciesdiversityandecologicaldiversityThearticledividesthemainresearchmethodsintothreecategories：con-versity，ventionalflatmethod，biochemicalmethodandmolecularbiologymethod，thenintroducesandreviewsthemrespectivelyandlooksforwardtothetrendofdevelopmentintheendKeywordsMicrobialdiversity；PLFA；F

4、ISH；PCR；Metagenomics土壤是最丰富的微生物资源库，其微生物数量庞大、生态功能活跃。近年来，由于人口的增加、自然资源的过度开发、环境污染的加剧以及外来物种的入侵，土壤微生物多样性受到强烈干扰。土壤微生物多样性的研究涉及土壤学、微生物学及生态学，该项研究能对探索自然生命机制、应对全球气候变化、治理各类环境污染及维持生态服务功能等作为整个生物多样性研究的重方面产生重要意义。然而，要组成部分，由于土壤微生物的复杂性和研究技术不完善等原因，土壤微生物多样性的全球性研究仅有不到20年的时间。从国内外研究现状来看，微生物多样性研究正处于实践积累13物的多样性在基因水平上更为突出，不同种群间

5、的遗传物质和基因表达具有很大差异10。除了组成核酸分子的碱基数DNA复制中出现的碱基量的巨大性和排列顺序的多样性外，对变化、双链/单链DNA、双链/单链RNA等多种遗传形式的存在，转导、转化和接合等微生物特有的基因重组现象，使微生物遗传多样性大大扩展11。该水平上微生物多样性的研12究要求高质量地获得生物大分子，对生物大分子进行基因层面的操作并进行精细的程序化检测12生理多样性。生理多样性可分为生理结构和生理功能的多样性。微生物的细胞组分和形态结构有广泛差异，体现了其生理结构的多样性。微生物细胞的生化组成成分或其可作为生物标志物细胞外分泌产物具有类属特异性，13和理论框架构建阶段4。随着研究方

6、法的改进，特别是分子生物学技术向生态学渗透，土壤微生物学的研究愈发深入。1土壤微生物多样性概述土壤微生物多样性指生命体在遗传、种类和生态系统层次上的变化，它代表着微生物群落的稳定性，也反映土壤生态机制和土壤胁迫对群落的影响个层次上综合表述能多样性765。而生理功能多样性则包括代谢类型和功能活性等的多样性，例如不同的微生物群落对特定底物的利用有不同的特征。该水平上微生物多样性的研究依赖于在特定条件下对微生物的观察、对细胞组分的分析以及对生化反应的程度、底物、位置等的测定。13物种多样性微生物物种多样性主要指微生物物种构成、数量的丰富性。而物种的差异主要体现在遗传物质和生理特征的差异上，所以对该层

7、面的研究，在具体的试验里还需以遗传和生理多样性的研究方法作为认识工具。14生态多样性生态多样性可分为生态结构以及生态功能多样性。前者包括生境分布广泛性和种群、群落结构的多后者主要指微生物与其他生物和非生物环境间的关样性，系11，14。Delong认为生物多样遗传（基因）多样性和生态系统多样性3性应从物种多样性、。王刚等对土壤微生物群落多样性进提出3个组成要素：遗传多样性、物种多样性和功行剖析后，。林先贵等认为，土壤微生物多样性存在于基8因、物种、种群以及群落等4个层面。而Watve等则认为，土壤微生物多样性可细致划分为生长繁殖速度多样性、营养生活方式多样性、基因多样性和微生物和代谢类型多样性、

8、资源开发利用多样性等9。现综合对已有文献提出的概念的分析，从微生物生命活动层次的角度出发，笔者将土壤微生物多样性分为遗传多样性、生理多样性、物种多样性和生态多样性4个方面。11遗传多样性土壤微生物的遗传多样性是指土壤微生物在基因水平上所携带的各类遗传物质和遗传信息的总和，是微生物多样性的本质和最终反映。与高等生物相比，微生。该层面常需要研究微生物在特定时空和介质中的形态、结构、代谢和种群分布等，也即微生物在特定环境中的对原位检测有特别要求。生态多样性，221土壤微生物多样性的主要研究方法传统微生物平板培养法传统的微生物平板培养法是根据目标微生物选择相应的专性固体培养基进行分离培养，然后通过各种

9、微生物的生理生化特征、外观形态及其菌落数来该类方法中使用最多的是平板菌计测微生物的数量及其类型，落计数法。但是由于自然环境，尤其是极端环境中存在大量15，不可培养的微生物（Unculturablemicroorganisms，UCM）作者简介蔡晨秋（1988），女，河南漯河人，硕士研究生，研究方向：E-mail：xuehai0323126com。微生物生态学，06-27收稿日期2011-39卷28期蔡晨秋等土壤微生物多样性及其研究方法综述17275传统的研究方法只能反映极少数微生物的信息，所测结果误差较大，埋没了大量极有应用价值的微生物资源。因此，传并且只有与其他先进方统培养方法只能作为一种辅

10、助手段，法结合起来，才能较为客观而全面地反映土壤微生物群落结构的真实信息2216得结果需采用一定的统计方法进行分析。Biolog微平板法描述的只是土壤中快速生长型或富营而不能反映土壤中生长缓慢的微生物养微生物类群的活性，pH等方面的改信息。另外，由于培养环境如湿度、渗透压、变都可能引起微生物对碳底物实际利用能力的改变19。，而生物化学方法但由于该法可快速、造成一定的误差。尽管存在不足之处，简便地获得大量土壤微生物群落结构和功能多样性方面的仍被认为是一种较好的方法。且在使用Biolog微平板信息，法时，如结合其他方法，依然可获得较全面的结果。222磷脂脂肪酸谱图分析法（PLFA）。PLFA常被用

11、于20221Biolog微平板法。Biolog微平板法是测定土壤微生物进而用以表征土对95种不同碳源的利用能力及其代谢差异，壤微生物代谢功能多样性或结构多样性的方法。利用由95孔将土壤不同单一碳源和1个对照孔组成的Biolog微平板系统，在一定的温育时间内，由于不溶液接种到每一个微平板孔中，同的微生物对不同单一碳源利用程度和强度不同，而发生不同最终使得每一个孔的溶液呈现出不同程度的的生化代谢反应，微平板中每一孔的颜色变化可通过酶标仪测定和记录下颜色，“代谢指纹”（Metabolic来，这样便可得到土壤微生物特有的Fingerprint）17。该法最初是用作纯种微生物的鉴定18，方常用于表征土壤

12、微生物群落的功能潜力，即被法被改进后，用于估计诸如碳源利用模式等功能多样性。当作此用途时，接种物是来自土壤微生物群落的混合物（而不是纯培养），所表1Table1研究复杂群落中微生物的多样性，表征在数量上占优势的土壤微生物群落，包括不可培养微生物。磷脂是所有活而PLFA是磷脂的组分，其具有细胞的细胞膜的基本组分，因此，总PLFA谱中某些结构多样性和高的生物学特异性，特征脂肪酸分别对细菌、真菌和放线菌特异，是特别有效的可用于了解微生物群落结构。PLFA或酯链生物标记物，PLFA（EL-PLFA）的总量亦被用作土壤样品中微生物生物量的指示物。PLFA方法表征几大类微生物的重要脂肪酸见表1。2122表

13、征微生物的磷脂脂肪酸谱图分析法（PLFA）PLFAsignaturesofmicrobesi、cy和Me分别表示反异（anteiso）、注：a、异（iso）、环丙基（cyclopropyl）和甲基（methyl）分枝脂肪酸。Note：a，i，cyandMestandforanteiso，iso，cyclopropylandmethyl23231分子生物学方法基于核酸分子杂交技术的方法。核酸分子杂交技术样品中的微生物进行原位检测23221。基于PCR技术的方法。PCR是1985年由Mullis发是20世纪70年代发展起来的一种新的分子生物学技术，它是根据核酸分子碱基互补配对的原理，用特异性探针（

14、用放射性同位素和荧光染料标记）与待测样品的DNA或RNA形成杂交分子，结合了标记探针的细胞就可通过放射自显影或荧光显微镜被检测出来23明的一种聚合酶链式反应技术，主要特点是短时间内在实验室条件下人为地控制并特异扩增目的基因或DNA片段，以便于对已知DNA片断进行分析。几种基于PCR技术的微生物多样性研究方法如下。2321扩增核糖体基因限制性分析法（ARDAR）。ARDAR23SrD-是基于PCR反应选择性扩增rDNA片断（如16SrDNA、NA、16-23SrDNA片断），再对扩增的rDNA片断进行限制性酶切片断长度多态性分析，进而对微生物的多样性进行分析。该项技术是从环境样本中获得高质量的微

15、生物总DNA，以总DNA为模板，根据微生物rDNA序列的保守性设计引物，采用PCR技术将目的rDNA片断扩增出来；选择25种4碱基识别位点的限制性内切酶，对扩增产物进行限制性酶切；选用合。由于它的高度特异性和灵敏24性，近年来被广泛应用于土壤微生物多样性的研究。该类方法中，荧光原位杂交技术（FISH）是研究环境中不可培养微生物群落多样性最为常用和有效的手段。该技术是根据已知微生物不同分类级别上种群特异的DNA序列，以荧光标记的特异寡聚核苷酸片段作为探针，与环境基因组中DNA分子杂交，检测该特异微生物种群的存在与丰度25。FISH技术使直接显现土壤栖息地微生物成为可能，可用于对土壤17276安徽

16、农业科学2011年适浓度的琼脂糖凝胶溶液，进行酶切的16SrDNA片断的电泳，通过酶切图谱分析菌间的多样性。如果得到的电泳图谱中条可以应用计算机软件（如GelCompar软件）进行聚类带较多，分析，得到反映菌株间系统发育关系的聚类分析树状图谱。由于此方法不受菌株是否纯培养的限制，不受宿主的干扰，具有特异性强、效率高的特点，因此被广泛用于微生物，尤其寄生菌的多样性研究是共生菌、232226（CommunityGenomies），由Handelsman等于1998年提出，定“利用现代基因组技术直接研究自然状态环境中的微生义为而不需要经过分离、培养单一种类的微生物有机体群落，物”其最初用来定义土壤细

17、菌混合基因组34。目前，宏基35因组主要指环境样品中全部微小生物遗传物质的总和。应用于土壤微生物多样性研究是通过直接提取土壤样品总DNA，并进行限制性内切酶酶切，获得大片断的DNA后直接然后对文与特定的载体连接构建克隆文库（如BAC文库），库进行筛选或者直接进行高通量测序的分析技术（如454测序技术）3637。限制性片段长度多态性技术（RFLP）。RFLP是利用限制性内切酶特性及电泳技术，对特定的DNA片段的限根据片段的大小以及标记片段种制性内切酶产物进行分析，评价微生物的群落结构及多样性。该法与类和数量的不同，ARDRA法一样，都是基于DNA多态性研究微生物多样性的方法27。Rondon等利

18、用插入大片段DNA的BAC载体，构建了270、445和980kb等大小不同的土壤宏基因组文库，对文库16SrRNA基因序列的系统发育学分析，其结果表明，文库中的DNA包含来源于不同系统分类单位下的许多微生物，揭示了微生物极广泛的多样性38，是ARDRA法的进一步发展，可用来分析复杂群落。RFLP反映了DNA水平上的变异，任何DNA序列的改变（如插入、重排、缺失等）都会改变原有酶切位点所在位置，从而26使两酶切点间的DNA片段长度发生变化。该技术可以。Treusch等从沙地生态系统和森林土壤中提取DNA构建了3个大片段福斯（Fosmid）质粒基因库；对古细菌存在更丰富的微生物资源；同时，该研究还

19、发多样性研究发现，现，对古细菌的研究可以利用除16SrRNA基因以外的功能基因39（如mcrA，amoA，nirk）进行分类学上的研究。是研究微生物多样性的有效工具。对大量土样进行分析，2323变形梯度凝胶电泳（DGGE）/温度梯度电泳（TGGE）。DGGE和TGGE是相关联的技术，二者工作原理是根据PCR扩增的基因或基因片段核苷酸序列的不同进行片段的分离。DGGE根据DNA在不同浓度的变性剂中解链行为的不同而从而将片段大小相同而碱基组成导致电泳迁移率发生变化，不同的DNA片段分开；而TGGE使用固定浓度的尿素和甲酰胺以促进DNA解链，电泳时PCR产物是在以线性温度梯度的凝胶中迁移，而造成不同

20、DNA片段解链时间的差异283小结土壤微生物作为稳定生态系统、监测土壤质量变化的敏其多样性研究在评价生态系统、维护生态平衡中发感指标，随着土壤学、分子生物学、生态学及其挥了巨大作用。近年来，他相关学科理论、技术和方法的不断完善，土壤微生物多样性研究得到了快速发展，并获得了一些极有价值的研究成果。该合理开发利研究成果为推动土壤微生物生态学的进一步发展，也为实现土壤资源的持续用土壤生物资源开创了广阔的前景，利用提供科学依据。而土壤微生物区系及多样性在土壤生态土壤微生物多样性的功能与生理生态学过系统过程中的作用、土壤微生物多样性与生态系统功能的关系、土壤微生程研究、物多样性对环境变化的响应以及土壤微

21、生物多样性的丧失机制与恢复研究等将成为该领域的研究热点。另外，随着微生物多样性研究向微观和宏观2个方向拓展，各种研究方法在微生物多样性各层面的研究中都得到广基因测序技术及宏基因组分析技术是土壤微泛应用。其中，生物多样性研究的前沿。通过对基因组文库中的基因序列的系统化研究，使土壤微生物的多样性分析趋于完整客观。应用免培养的新方法和新技术，可绕过微生物菌种分离培养直接在基因水平上研究、开发和利用无法培这一技术难关，养的微生物资源，有利于揭示不可培养微生物的基因多样为研究土壤微生物复杂群落结构提供了重要工具。性，参考文献1FANGH，DAMODARANPN，CAOMArbuscularmycorrh

22、izalstatusofGlomusplantsintropicalsecondaryforestofXishuangbanna，SouthwestChinaJActaEcologicaSinica，2006，26（12）：417941852CHENZ，WANGXK，DUANXNOzoneeffectsonwheatrootandsoilmicrobialbiomassanddiversityJActaEcologicaSinica，2007，27（5）：180318083KONDAKOVAGV，VERKHOVTSEVANV，OSIPOVGAInvestigationofmicrobialdi

23、versityofundergroundwatersinmonitoringdeephorizonsofscrustJMoscowUniversityBiologicalSciencesBulletin，theEarth2007，62（2）：6975。这2种方法中，同样大小但来自不同微生物PCR产物会在凝进而被分开。DGGE和TGGE已广胶的不同位置停止移动，群落动态、混合种群中的泛用于微生物群落的遗传多样性、基因表达和细菌分离中特殊物种多度检测等的研究中2932。实际应用中，通常用PCR扩增SSUrDNA，扩增产物用凝胶电泳分离并进行分析。目前最常用的分析方法的基本步骤如下：抽提土壤DNA；

24、PCR扩增SSUrDNA（16SrD-NA或18SrDNA）；PCR产物的DGGE或TGGE分离及带谱分析；回收电泳片段；DNA序列测定；将测得的SSUrDNA序列与rDNA序列数据库中已知微生物的rDNA序列相比较；获得土壤中可能含有的微生物的信息。2324单链构象多态性技术（SSCP）。SSCP是一种基于DNA构象差别而进行快速、灵敏、有效检测基因点突变的方经高温法。经PCR扩增的片段在变性剂或低离子浓度下，DNA单链可折叠成一定处理使之解链并保持在单链状态下，在不含变形剂的中性聚丙酰胺凝胶中电泳时，的空间构象，相同长度DNA单链因其碱基序列不同，甚至单个碱基不同，导致形成的构象不同，而且

25、单链DNA构象的变化就引起了迁移率的改变，每条单链处于一定的位置，靶DNA中若发生插入或单个碱基置换时，就会出现脉动变位，通过碱基缺失、显色或显影后在凝胶上就会显示出带型的差别，即多态性33。SSCP方法已被成功用于研究根系微生物和高温堆肥宏基因组学（Metagenomics）技术。宏基因组学也称的微生物群体组成以及污染条件下的微生物生态多样性。233为环境基因组学（EnvironmentalGenomies）或群落基因组学（下转第17278页）17278安徽农业科学2011年39%、13%、20%、87%。这说明与处理相比，处理能形成更多的有效分蘖，也有明显的增产效果。各处理的结实率大小顺序

26、为处理处理处理。222湿谷产量。研究表明，处理湿谷产量分别为95520、98490、10641kg/hm2，处理、分别比处理31%，增产113%、处理与处理、之间差异达到001显著水平，处理与处理之间差异不显著。由此可知，处理增产效果明显。223干谷产量。从湿谷重、干谷重的对比来看，处理186%、181%，水分系数分别为189%、以处理最小，且处差别很小。处理干谷产量分别为77475、理、80175、87150kg/hm2，处理、分别比处理增产125%、31%，处理比处理增长84%。方差分析结果表明，处理与处理、之间达到001水平显著差异，处理、之间差异不显著。这说明处理与处理、间有005水平

27、显著的处理与处理相比增产效果不太明显。由此可增产效果，处理在提高籽粒的千粒重等方面具有一定的作用。知，224效益比。由于3个处理中其他成本都一样，只分析3个处理的单位面积使用成本，将产量折算成现金计算效结果表明处理益比。按粮食市场的中准收购价进行计算，284元，、分别比处理增收1061、增长率分别为114%、30%；处理比处理增收837元，增长率为87%。这说明稀土多元水稻分蘖肥有较好的经济效益及应用前景。3小结与讨论田间肥效试验表明，稀土多元水稻分蘖肥含速效氮（氨速效钾，可直接满足水稻分蘖期间对氮、钾养分的需态氮）、对各种元素的释放起到长久、求；制成的颗粒外包裹一层辅料，23；由于稀土多元分

28、蘖肥含水稻专用稀土均衡、平稳的作用微肥成分，能提供锌、硼、镁、稀土等活性成分，促进水稻根叶早提高各种酶活性和光合效率，增强抗逆性，从而增加结生快发，提高单位产量。试验结果还表明，稀土多元水实率和千粒重，稻分蘖肥可满足水稻分蘖期甚至整个营养生长期对各种营养形成根叶繁茂植株体，进而提高水稻的抗逆性，元素的需求，达到明显的增产效果。因此，该专用肥料的应用具有比较广阔的市场前景，值得推广。参考文献1徐小华，吾建祥水稻不同施肥方式对养分吸收和肥料利用率的影响J安徽农业科学，2002，30（2）：2642652盛海军，钱晓晴，王小治集成化肥增效剂对水稻群体质量及产量的影J扬州大学学报，2002，23（4）

29、：4750响3王娟娟，钱晓晴，荆国芳，等集成性化肥增效剂与复合肥混施的增产J江苏农业研究，2001，23（3）：2629效果研究檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪（上接第17276页）4GREENJ，BOHANNANBJSpatialscalingofmicrobialbiodiversityJTrendsinEcologyEvolution，2006，21（9）：5015075杨海君，J南肖启明，刘安元土壤微生物多样性及其作用研究进展2005，19（4）：2131华大学学报：自然科学版，6DELONGEFMicrobialdiver

30、sityintimeandspaceMNewYork：Ple-num，1996：1251337WANGG，JIAGM，CHENJAreviewofmethodsforstudyingmicrobialJPedosphere，2006，16（1）：1824diversityinsoils8林先贵，J胡君利土壤微生物多样性的科学内涵及其生态服务功能2008，45（5）：892899土壤学报，9WATVEMG，GANGALRMProblemsinmeasuringbacterialdiversityandapossiblesolutionJEnvironMicrobiol，1996，62（11）：4

31、299430110李顺鹏环境生物学M北京：中国农业出版社，2002：788611张薇，魏海霄，高洪文，等土壤微生物多样性及其环境影响因子研究J生态学杂志，2005，24（1）：4852进展12陈敏玲，J生态李伟华陈章和不同层面上微生物多样性研究方法2008，28（12）：62646271学报，13DEMOLINGF，NILSSONLO，BTHEBacterialandfungalresponsetoni-trogenfertilizationinthreeconiferousforestsoilsJSoilBiologyandBio-2008，40（2）：370379chemistry，14阎

32、章才，J微生物学通报，东秀珠微生物的生物多样性及应用前景2001，28（1）：9610215王海舟，J萍乡高等张小波分子生物学在微生物生态学中的应用26（3）：7275专科学校学报2009，16黄艳霞土壤微生物多样性分析技术研究进展J安徽农业科学，2009，37（32）：159241592517章家恩，蔡燕飞，高爱霞，等土壤微生物多样性实验研究方法概述J土壤，2004，36（4）：34635018廖敏，曾路生，陈承利污染土壤微生物群落结构多样性及功能多样性J2006，26（10）：34043412生态学报，测定方法19焦晓丹，J土壤通报，吴凤芝土壤微生物多样性研究方法的进展2004，35（6）

33、：78979220PONDERFJ，TADROSMPhospholipidfattyacidsinforestsoilfouryearsafterorganicmatterremovalandsoilcompactionJAppliedSoilE-2002，19：173182cology，21钟文辉，应用生态学报，蔡祖聪土壤微生物多样性研究方法J2004，15（5）：89990422INSAMHDevelopmentinsoilmicrobidogysincethemid1960sJGeo-derma，2001，100：38940223MEDEIROSPM，FERNANDESSF，DICKRPSeasonalvariationsinsugarcontentsandmicrobialcommunityinaryegrasssoilJChemo-2006，65（5）：832839sphere，24张旭霞，J安徽农业刘左