中和抗体识别短肽对IFN-α生物学活性的影响

1、    中和抗体识别短肽对IFN-生物学活性的影响        【摘要】目的研究合成肽WLDPRH的免疫反应性和对干扰素 (IFN)诱导的生物学活性的影响。方法根据我们早先的研究，已用中和抗体从噬菌体展示6肽库中筛选出了两个与IFN-有同源性的肽片段,将其中之一进行了人工合成(WLDPRH), 并进行了同源性比较分析, 体外竞争酶联免疫吸附实验(ELISA), 体外IFN诱导抗病毒和抗增殖分析。结果计算机分析表明,人工合成肽WLDPRH与推理的I型IFN受体结合区LoopA

2、B(29-35位)有相当的同源性。体外竞争ELISA实验表明,合成肽在25 g/ml浓度时能特异性抑制IFN-与中和抗体4C1结合。体外抗病毒结果显示,干扰素在亚保护剂量时(2070 pg/ml)时,合成肽能提高IFN-作用细胞后的抗病毒活性,并且合成肽WLDPRH在 1.4 g/ml时, IFN-抗病毒保护率从40%提高到86%，为最高保护率的最低剂量，但合成肽为1.4 g/ml, IFN浓度为555 ng/ml时,对IFN-诱导的抗增殖作用不明显。结论用中和抗体筛选的短肽WLDPRH能影响IFN 分子作用模式，并且有可能模拟IFN 分子LoopAB的结构和功能,这为免疫治疗及IFN的小分子

3、模拟设计奠定基础。【主题词】合成肽干扰素中和抗体Influence of the synthetic peptide recognized by neutralizing antibody on IFN-induced biological responses HU Rong, MA Xuejun, WEI Kaikun ,et al. National Laboratory of Molecular Virology and Genetic Engineering,Beijing 100052【Abstract】ObjectiveThe influence of synthetic pept

4、ide WLDPRH on IFN-induced biologic activity was studied.MethodsBased on our earlier studies in which two peptides were recognized by neutralizing antibody from the hexapeptide library displayed on the phage, one of the peptides synthesized, with amino acid sequence WLDPRH.ResultsComputer-building ap

5、proach showed that the synthetic peptide WLDPRH exhibited structural homology with LoopAB (29-35), the binding domain of type I IFN receptor. In the competitive ELISA studies, the synthetic peptide WLDPRH in 25 g/ml could inhibit IFN binding neutralizing antibody 4C1. IFN-induced antiviral assay sho

6、wed that the protective effects of suboptimal dose (20-70 pg/ml) of IFN were increased from 40% to 86% in the presence of the synthetic peptide WLDPRH and 1.4 g/ml of the synthetic peptide WLDPRH was the lowest dose with the best protection. But potentiating effect on IFN-induced growth inhibition w

7、as fewer noticeable in 1.4 g/ml of synthetic peptide.ConclusionThe results indicated that synthetic peptide WLDPRH can mimic the structure and activity of Loop AB in the IFN molecule and can be applied to immunotherapy as well as the mimic minimolecular design of IFN.【Key words】Synthetic peptideInte

8、rferonNeutralizing antibodyI型IFN介导靶细胞的生物学活性是通过与细胞表面特异性受体结合而产生的。最新的IFN分子结构模式显示, IFN 分子由五个-螺旋和四个环状结构组成,它们是A(残基12-24),B-(51-67),C(80-99),D(115-132)和E(141-165)螺旋,AB环(29-35),BC环(68-78),CD环(100-114),DE环(133-140)。许多文献报道AB环(LoopAB)是IFN分子的一个共同的重要的受体结合域1，2。 IFN分子诱导产生两类抗体即中和抗体和非中和抗体,中和抗体可分为两种,一种能阻止IFN分子受体识别表位与

9、受体的高亲合性结合,另一种能阻止信号传导1。不难推导,中和抗体识别表位与IFN分子的受体识别位点有关，或者说与引起信号传导的IFN分子表位有关。IFN分子的不同受体识别域和受体成分的不同位置相互作用, 产生细胞内信号传导, 发挥生物学活性。高浓度的受体和配体能进一步增强二者相互作用的动力学过程，并且决定了复合结构的亲合性。我们用中和抗体从噬菌体展示6肽库中筛选出的短肽3,经计算机软件分析与IFN分子受体区域LoopAB有相当的同源性,因此我们将合成肽WLDPRH放入IFN作用模式中,在细胞表面受体有限和亚保护剂量干扰素存在的情况下,通过增加合成肽的流量来增加配体和受体成功碰撞的机遇,以研究合成

10、肽WLDPRH对IFN生物学活性的影响。1材料和方法1.1主要试剂IFN1b为深圳科兴公司产品, IFN1b半成品由上海生物制品研究所童葵塘教授惠赠。 IFN1b 中和抗体4C1由安徽安科公司惠赠。合成肽试剂是美国ABI公司提供，阴性(TLDYPARAHTFDDFCPECRPLGCQGCAFQSTVAAELQRLRMKV)由本室王海林博士惠赠,人传代羊膜细胞(WISH)和滤泡口炎病毒(VSV)由本室提供,人宫颈癌细胞(HeLa)由本室舒跃龙博士惠赠。96孔酶标板为Nunc公司产品,3-(4.5-dimethylthiazol-2-yl)-2.5-diphenyl tetrazolium bro

11、mide(MTT)为Sigma公司产品。1.2计算机同源性分析用PROSIS对人工合成肽WLDPRH和I型IFN进行同源性比较。1.3合成肽的竞争ELISA ABI公司431A型多肽合成仪合成多肽，经HPLC反向柱层析后，溶于0.1%TFA(三氟乙酸)并定量。 0.1 g IFN1b包被后, 分别加入合成肽或阴性对照肽(HE)和2.5 ng 4C1中和抗体混合物, HRP标记的羊抗鼠IgG加入反应体系，OPD显色, 酶标仪测492 nm光吸收值。14体外抗病毒活性分析主要参考文献4。将生长在10%FCS Eagle培养基的WISH细胞以1.5×105/ml的密度接种到96孔板,每孔2

12、00 l，加梯度稀释亚保护浓度的IFN(含和不含合成肽)及40 pg/ml浓度的IFN(含和不含合成肽),处理24小时,去除培养液,加入104pfu VSV及含2%FCS的 Eagle 培养液, 37培养24 小时。细胞用95%乙醇固定, 结晶紫染色, 脱色, 用酶标仪监测570 nm光吸值。1.5体外抗增殖活性分析按文献操作5, Hela细胞以5×103/ml接种96孔板, 孵育6小时,加梯度稀释的IFN(含和不含合成肽), 37 培养96小时后,每孔加含5 mg/mlMTT的PBS溶液10 l, 37孵育4小时, 加酸化异丙醇100 l/每孔,混合至溶解所有结晶, 1小时后,酶标

13、仪测570 nm光吸收值。2结果2.1计算机同源性分析1显示人工合成肽WLDPRH与推理的I型IFN受体结合区LoopAB(29-35位)有相当的同源性。     <"30-1 (4286 bytes)" src="/med/cano/201003/20100319180922265" 302 104>1合成肽WLDPRH与IFN 1C/86D的序列同源性比较Fig.1PROSIS used for homogeneous analysis of syntheticpeptide WLDPRH sequ

14、ence and IFN 1C/86Damino acid sequence2.2合成肽WLDPRH的竞争ELISA检测结果 我们分析了合成肽的免疫反应性， 2.表明合成肽WLDPRH在25 g/ml时可以完全抑制2.5 ng/ml的 4C1与IFN a1b(0.1 g)结合, 对照肽HE(42肽)在30 g/ml时对A值无影响。     <"30-2 (2944 bytes)" src="/med/cano/201003/20100319180922754" 300 218>浓度(g/ml)Concn

15、tration(g/ml)2合成肽(WLDPRH)的竞争ELISAFig.2Competitive ELISA with synthetic peptide WLDPRH2.3抗病毒活性体外分析 我们检测了经合成肽处理以后IFN诱导抗病毒生物活性的效果。3A.描述了IFN在亚保护浓度（20-70 pg/ml）时,合成肽(1.4 g/ml)能加强细胞的抗病毒能力。3B显示 IFN在40 pg/ml合成肽在0.17-5.6 g/ml时，对IFN 抗病毒活性的影响，并且表示了合成肽在1.4 g/ml时，IFN抗病毒百分保护率从40%提高到86%, 为最高保护的最低浓度。合成肽单独使用时没有抗病毒活性

16、。     <"31-1 (2610 bytes)" src="/med/cano/201003/20100319180922951" 300 180>3A不同浓度合成肽对WLDPRH亚保护浓度IFN诱导抗病毒活性的影响Fig.3AInfluence of synthetic peptide on IFN-inducedantiviral activity     <"31-2 (4688 bytes)" src="/med/c

17、ano/201003/20100319180922914" 320 212>3B不同浓度合成肽WLDPRH对IFN诱导抗病毒活性影响1：IFN-a. 2: IFN+0.17 g/ml 3:IFN+0.35 g/ml 4:IFN+0.7 g/ml 5. IFN+1.4 g/ml. 6. IFN+2.8 g/ml 7. IFN+5.6 g/mlFig.3BInfluence of different concentrations. of synthetic peptideWLDPRH on IFN-induced antiviral activity1: IFN-a 2:IFN+

18、WLDPRH 0.17 g/ml 3: IFN+ WLDPRH 0.35 g/ml 4: IFN+ WLDPRH 0.7 g/ml 5. IFN+ WLDPRH 1.4 g/ml 6. IFN+ WLDPRH 2.8 g/ml 7.IFN+ WLDPRH 5.6 g/ml2.4体外抗增殖分析4显示了合成肽的浓度为1.4 g/ml,IFN在555 ng/ml时, 对Hela细胞抗增殖作用的影响, 结果显示了IFN抗增殖活性在有合成肽存在和没有合成肽存在的情况下均没有明显差异。合成肽的浓度在132 g/ml, 也没有明显影响(资料没显示)。单独使用合成肽显示无抗增殖活性。  &

19、#160;  <"31-3 (4371 bytes)" src="/med/cano/201003/20100319180922411" 320 229>4合成肽对IFN抗增殖作用的影响Fig.4Influence of synthetic peptide on IFN-inducedantiproliferative activity3讨论IFN分子受体结合区通过与细胞相应受体结合,激活受体磷酸化,引起胞内蛋白激酶的活化和磷酸化,导至活化IFN激活基因因子3(ISGF-3)复合物形成,并与IFN诱导基因启动子内的干扰素刺激反应元件

20、(ISRE)结合,启动IFN诱导基因的转录,发挥IFN的抗病毒,抗增殖及免疫调节作用4,6,7。竞争ELISA实验结果表明,中和抗体筛选的短肽 (WLDPRH) 人工合成后仍然保留良好免疫反应。并能抑制IFN中和抗体 4C1与IFN a1b结合, 提示了WLDPRH有可能模拟IFN 分子LoopAB的结构,导致中和抗体不能和IFN有效结合。IFN诱导的抗病毒活性结果表明, 合成肽WLDPRH有加强IFN诱导的抗病毒活性的作用, 但单独使用合成肽WLDPRH无抗病毒作用。由于只有多个IFN受体结合位点(配体)与受体多个相应结合域同时结合形成配体-受体复合物, 才能引起第一信号和辅助信号传导，发挥

21、生物学效应，因此单一的合成肽是不能代替完整IFN分子与受体结合形成复合物引起信号传导, 发挥生物学活性的。当合成肽WLDPRH放入IFN作用体系中,表现出能提高IFN的抗病毒作用,这可能是影响了配-受体之间的动力学作用,如减少了配体的解离, 提高了IFN分子与受体亲合性, 参与和增加了IFN分子的受体占有强度。对IFN-来说，受体占有强度, 直接与ISGF3活化程度有关, 有证据表明IFN诱导产生活化ISGF3的程度与IFN诱导抗病毒应答有良好相关性。4 合成肽能加强IFN诱导的抗病毒活性，但在浓度为1.4-32 g/ml( IFN浓度为555 ng/ml)时,对IFN诱导的抗增殖均无明显加强

22、作用。这提示了WLDPRH能模拟LoopAB与受体结合的部分功能, 与文献报道一致。IFN分子表位与其受体结合模式的不同，即IFN分子不同表位与细胞表面不同受体成分形成复合物，导致胞内信号传导的差异,引起细胞对IFN的不同应答8, Fish曾报道4,6在信号传导通路中ISGF3活化程度与IFN诱导抗病毒应答有良好相关性, 但与IFN诱导的抗增殖4，6在信号传导通路中ISGF3活化程度与IFN诱导抗病毒应答有良好相关性，但与IFN诱导的抗增殖强度关系不明显。合成肽WLDPRH对IFN诱导的抗病毒和抗增殖活性不同的影响也提示,这两种活性引发的机制不同。本文结果说明了中和抗体识别短肽WLDPRH有可

23、能模拟IFN 分子LoopAB的结构和部分功能，同时，通过合成肽来研究IFN分子与其受体之间的相互作用，确定IFN分子上直接与受体胞外区不同链结合的特异性氨基酸残基, 对免疫治疗及IFN的小分子模拟设计都有重要意义。本文受国家863高科技生物技术领域基金资助(项目编号：863-102-08-01-02)作者单位：116000大连医科大学, 病毒基因工程国家重点实验室联合培养博士生(胡荣)；大连医科大学病生理教研室(钱振超)；100052北京病毒基因工程国家重点实验室(马学军魏开坤王虹侯云德)参考文献1Viscomi G C. Structure-activity of types I interferons. Biotherapy 1997, 10:59-86.2Wallter M R.Three-dimensional models of interferon-a subtype IFN-con1, IFN-8 and IFN-a1 d