南开大学微生物遗传学(整理于20141206)

1、基因是一个含有特定的遗传信息的核苷酸序列，是遗传物质最小的功能单位。微生物遗传学是一门以病毒、细菌、放线菌、小型真菌以及单细胞动植物为研究对象的遗传学的分支学科。基因组(Genomy) 一种生物编码所有功能所必须的基因的结合体，基因组也指单倍体生物的一套DNA。S.Cerevisiae 全基因组序列测定的意义:1、第一个真核生物基因组全序列测定 2、当时最大的基因组全序列测定3、S.cerevisiae 有16条染色体，总长度12 mb(1.2X107bp) 4、最小的染色体为1号染色体230kb ,5、最大染色体为4号染色体1532kb 6、包括: 蛋白质编码基因5885个，r-RNA编码基

2、因140个,7、t- RNA编码基因275个详细介绍见 Science， vol.274 ，1996 p.546“Life With 6000 Genes”8、原核生物已测序的基因组都小于 2mb (200万bp): 9、流感嗜血杆菌 1.8 mb(180万 bp)10、噬菌体 48.5kb 11、X174 5383 n.t.三、微生物作为遗传研究材料的优越性1为什么在基因作用的研究中采用微生物为材料？二倍体细胞中的遗传物质组成2微生物的优越性1） 独特的生物学特征：单倍体、单细胞、易培养、繁殖快 2） 便于获得营养缺陷型3） 可为高等生物的遗传学研究建立基础1转化实验（Transformat

3、ion）第一步：1928年, F.Griffith, Diplococcus pneumoniae, In vivo活的R型杀死的S型注射小鼠小鼠死亡从死亡小鼠中分离出活的S型细胞 (图)第二步：19301931年, H.P.Robert Sia,M.Dawson In vitro活的R型杀死的S型分离出活的S型细胞第三步：1933年, L.Alloway Cell frell杀死的S型石英沙磨碎过滤上清液（Cell frell抽提物）活的R型活的S型细胞第四步：19401944年, O.T.Avery 分别转化提取S型细胞的多糖、蛋白、 RNA、 DNA分别转化R型细胞只有用DNA(1.6n

4、g)转化可获得转化子 （图）2 病毒重建实验（Virus Reconstruction）1956年， Fraenkel Conrat实验材料：Tobacco Mosaic Virus (TMV和HR),94% Protein,6% RNA1) 分别提取TMV的RNA和外壳Protein分别提取 HR 的RNA和外壳Protein2）交替组装重建TMV和HR病毒3）分别感染烟草4）观察：A.病症象TMV还是HR ？B.产生的子代病毒是TMV还是HR ？病毒重建实验结果：1、RNA来自哪一个亲本，病症就象哪一个亲本2、RNA来自哪一个亲本，产生的子代病毒也同于哪一个亲本二、细菌染色体的结构1、 E

5、.coli DNA 全长约1300m，是菌体细胞的1000倍。1997年完成基因组全序列测定，大小为4.7x106 bp, 包括基因4100个。2、 超螺旋，高度折叠。3、 参与DNA折叠的类组蛋白（histone-likeprotein）种类： FIS: factor for inversion stimulation H-NS: histone-like nucleoid structory protein HU: heat-unstable nucleoid protein IHF: integration host factor特点:1 高度压缩,多层折叠 E.coli 细胞长度为35

6、 ,其DNA长约1300。2 许多基因有多个拷贝 E.coli复制DNA所需的时间长于细胞世代时间,因此当第一个复制周期尚未结速, 第二个第三个复制周期已经开始三、细菌染色体的复制1. 型复制2. 与DNA复制有关的酶和蛋白3. 染色体复制起点和复制起始阶段4. 染色体复制终止E.coli DNA 型复制E.coli DNA为环形分子 每一个相继的复制周期从一个固定的起点(oriC)开始双向复制证明: 遗传学方法, 放射自显影方法单链DNA phage 基因组复制特点:1、X174 DNA复制: SS RF, RF RF, RF SS 2、复制方式为单向不对称 3、复制是半保守的3、复制过程中

7、仅涉及两条亲链中的一条,另一条亲链始终为环状,保持一套完整的遗传信息一、组成和结构核小体（Nucleosome）:由双链DNA和组蛋白构成的染色体基本单位。中心为四种组蛋白各2分子的8聚体，外围缠绕着DNA分子，两个核小体之间的DNA与1分子的H1组蛋白结合。多个核小体连接起来形成染色质，染色质浓缩、反复折叠便成为一定形状的染色体。酵母菌核小体结构中无H1组蛋白。二、复制特点 真核生物细胞的生活周期分为4个时期：G1期： 复制预备期 S期： 复制期 G2期： 有丝分裂准备期 M期： 有丝分裂期染色体DNA复制发生在S期。 复制是通过许多独立的复制子完成的。 复制子只有起始点，无终止点，通常采取

8、双向复制区别1： 与原核生物不同，真核生物的复制子相对较小，复制速度慢。区别2： 真核生物染色体在全部复制结速之前，复制起点不会再开始新的一轮复制，而在快速生长的原核生物中，复制起点可以连续发动复制，而真核生物快速生长时往往采用更多的复制起点。1. 原核生物基因的结构 编码区：从起始密码子开始至终止密码子为止的一个连续编码序列，称为开放阅读框架（ORF）。 启动子（Promoter）:位于基因5末端上游的一段非编码核苷酸序列，功能是与RNA聚合酶结合，形成转录起始复合物。 10区是RNA聚合酶核心酶与DNA分子结合部位，共有序列为：TATAAT。35区是RNA聚合酶因子识别DNA分子的部位，共

9、有序列为：TTGACA。 终止子（Terminator）:位于基因或操纵子末端，提供转录终止信号的DNA区段。2. 真核生物基因的结构真核生物的蛋白质编码基因以及其它基因的编码序列中，被一种称为内含子（Intron）的非编码序列所间断。有3种RNA聚合酶，各自分工转录不同类型的基因：Pol I转录rRNA 基因（5s rRNA除外），Pol II转录蛋白质编码基因，Pol III转录编码众多小分子RNA， 包括tRNA和5s rRNA。增强子（Enhancer）：真核生物基因表达的重要调控元件。能使与其连锁的基因转录频率明显增强的DNA序列，长度一般为100200bp。具有下列特点：1. 使基

10、因转录增强10200倍，有的达上千倍。 2. 增强效应与位置和取向无关。3. 可远离转录起始点起作用。 4. 无基因的专一性，对同源、异源基因都有效。沉默子（Silencer）：属于负调控元件，对成簇基因的选择性表达起重要作用。重叠基因（Overlapping gene）一个基因的核苷酸与另一个基因的核苷酸之间存在一定程度的重叠现象。类型1：一个基因的序列完全包含在另一个基因序列之中。类型2：一个基因的末端密码区与另一个基因的起始密码区重叠出一个新的基因。噬菌体X174基因组最显著的特征是基因的重叠现象，X174共有11个基因，其中基因B,K,E 分别位于基因A,C,D中，但使用不同的阅读框架

11、，见图示。断裂基因（Split gene）基因的编码序列在DNA分子上是不连续的，被不编码的序列所隔开。编码序列称为外显子，不编码的序列称为内含子。断裂基因在表达时，先转录一条包括外显子和内含子的前体mRNA（称为核内不均一RNA），经过剪切和连接，除去内含子区域，形成成熟的mRNA，便可以翻译蛋白质了。真核生物基因多数都含有内含子，如啤酒酵母中，4的基因含有内含子。原核生物的基因一般没有内含子,但E.coli T4 phage 的胸苷酸合成酶基因中含有一个长达1017bp的内含子。断裂基因的存在，有利于生物的变异和进化，有利于储存较多的遗传物质。基因组（Genome）:一种生物编码所有功能所

12、必须的基因的结合体。基因组也指单倍体生物的一套DNA。结构基因组学（Structural Genomics）研究基因和基因组的结构、各种遗传元件的序列特征、基因组作图和基因定位。功能基因组学（Functional Genomics）研究基因不同序列结构的不同功能、基因表达的调控、基因与环境，基因与蛋白，基因与基因之间的相互作用。一般来说，在微生物中，无论原核还是真核微生物，其基因组都相对比较小，其中最小的E.coliphage MS2 只有3000bp,仅含3个基因。几种微生物及其代表生物的基因组情况见下表。突变的应用实例：青霉素诱变育种1943年，首次从一只发霉的金黄瓜上分离到青霉菌，青霉素

13、产率仅20 g/mL1948年，经多次x射线和紫外线诱变选出wis 48-701菌株，青霉素产率为900 g/mL1949年，用氮芥诱变选出wis 49-133菌株，青霉素产率为1800 g/mL1955年，用化学诱变剂处理后，青霉素产率提高为3000 g/mL1965年，青霉素产率8,000 g/mL 1972年，青霉素产率28,000 g/mL 1990年，青霉素产率300,000 g/mL1.突变的表现型1) 形态突变型: 包括菌落、孢子、荚膜、色泽、鞭毛、嗜菌斑2）生理生化突变型: 包括营养要求、代谢产物生成能力、糖分解能力、温度敏感突变型3）抗性突变型： 抗药物、抗嗜菌体、抗紫外线

14、4）条件致死突变型：营养缺陷型（X-）、温度敏感突变型( Ts )对抗生素敏感（Amps）、抑制基因突变型2. 遗传信息的改变1）同义突变（samesense mutation）2）错义突变（misssense mutation）3）无义突变（nonsense mutation）3. 遗传物质结构的改变1）遗传物质结构微小的改变（转换、颠换、移码）2）遗传物质结构较大的改变（缺失、重复、倒位、易位）基因命名的规则及要点：1.每一基因座位用3个小写英文字母表示，并用斜体。如：lysine基因为lys, proline基因为pro2)表型相同的不同基因突变，用3个小写英文字母后的大写字母表示。如：

15、proA, proB, lysA, lysB3)同一基因的不同位点突变，用基因符号后的阿拉伯数字表示。如：proA315, proA20334）如突变位点所属基因还不确切，则大写字母用一短线代替。如：pro-5，lys-1, 短线后的数字表示菌株序号。5）基因型的表型用大写字母表示，并加正负号。如：Pro+,Pro6）抑制基因（suppressor）突变型表示为sup+，野生型表示为sup7）F因子上的基因要用“；”或“/ ”与染色体基因分开表示，缺失用“ ”表示，并写在却失基因之前。如：uvrB 表示与紫外线修复有关的uvrB 基因缺失。基因符号实例：E.coli CSH 13 F lacZ

16、 proA+B+ ; （lacZ pro）表示：大肠杆菌CSH 13菌株染色体上的lac Z和 pro基因缺失,而该菌株的F因子上携带有这两个基因。1.随机性就微生物的某一群体而言，基因突变的发生在时间上、个体上、基因上或位点上都有明显的随机性。2.独立性一个基因突变与另一个基因突变之间是互不相关的独立事件。3.稳定性基因突变是遗传物质发生突变的结果。突变型基因与野生型基因一样具有相对稳定的结构，并可以稳定遗传。4.可逆性野生型基因突变成突变型基因，称为正向突变；突变型基因变回野生型基因,称为回复突变。回复突变原因有3种：真正的回复突变; 基因内抑制；基因间抑制。5.稀有性一般来讲，自发突变率

17、很低。通过理化因素的处理，可以提高突变的频率突变率：每一细胞每一世代或其它规定的单位时间内，发生突变的机率。可以与DNA分子发生化学反应，并使其结构发生改变的物质，统称为诱变剂。用诱变剂处理细胞得到突变型，则为诱发突变。根据突变诱发机制，化学诱变剂分为碱基置换诱变剂和移码诱变剂。碱基置换诱变剂包括碱基类似物（5溴尿嘧啶、2氨基嘌呤）和碱基改造剂（亚硝酸、羟胺、烷化剂）天然碱基结构类似物 5-溴尿嘧啶5-溴尿嘧啶是胸腺嘧啶（T）的甲基集团被溴原子取代后形成的结构类似物，通过分子的互变异构显示出其诱变活性。见图示：化学诱变剂 亚硝酸、羟胺、烷化剂(EMS)辐射诱变的特点 1. 辐射有直接作用 2.

18、 点突变出现的频率与照射剂量呈直线关系，这些剂量关系曲线都通过原点，证明任何一点辐射都足以诱发突变3. 只要总剂量不变，多次照射和一次照射的诱变效果相等。既：少量多次辐射和一次大量辐射的剂量效应相同。平均致死剂量平均每一细胞被击中一次的辐射剂量，此剂量的存活率为37 。依据:波松分布公式 P0 = em 假定一次击中就能致死，则 m = 1 P0 = e1= 1 / 2.71= 0.37四、移码突变移码突变多发生在碱基重复的DNA序列图示五、生物因子的诱变作用转座因子或称可动的遗传因子，是存在于基因中，具有特定结构的DNA片段，无固定的位置，能在基因组内或基因组间来回移动。转座因子分为3类：1

19、. 插入序列（Is）只含与转座有关的基因 2. 转座子（Tn）除转座基因外还带有抗药基因3. 转座噬菌体（Mu）结构复杂，分子量大切离转座因子从插入位置消失的过程。准确切离引起回复突变基因符号表示：双冒号表示插入lac Z 21:Tn3 , gal T 135:Is4 ,P1:Tn5, :Tn5六、诱变作用的专一性回复突变的专一性：羟胺、丫啶类、缺失突变、转座子正向突变的专一性：热点（Hot Spot）: 一个基因中突变率特别高的位点。一、证实基因突变是自发的1波动实验 S.E.Luria, M.Delbruck 2涂布实验 3影印实验 J.Lederberg二、自发突变的机制三、适应突变一、

20、证实基因突变是自发的基因突变的自发性是基因突变的第一规律1. 基因突变是遗传物质自我运动的结果，突变的发生是随机的。 2. 突变呈多方向性。3. 环境条件可以诱发突变，但突变不一定按照环境的要求而相应的改变，两者无因果关系。一、证实基因突变是自发的基因突变的传统观点1、从远古以来，人们总是观察到生物界与环境无比完美的协调和适应关系。2、细菌对抗生素惊人的“适应”现象3、从拉马克到达尔文都持有获得性遗传观点，认为生物体对环境的变化总是有适应性、定向性和可遗传性，是可累积的、渐变的。4、适应学说认为细菌是生命的特殊类型，不存在自发突变。抗噬菌体细菌的出现是自发突变还是后天获得的遗传免疫性？S.E.

21、Luria通过周密的实验设计、严格的推理获得毫不含糊的结论：细菌抗噬菌体突变是基因突变的结果，可以发生在细菌接触噬菌体之前。波动实验借助于统计学原理设计。见实验过程图示：波动实验原理 适应学说预期：噬菌体的存在诱发了抗性细菌的出现。把正生长的、对T1敏感的细菌（tons）培养物与T1接触后，所出现的抗T1细菌（tonr）的数量在任何生长条件下都应该是常数，既平均数方差。 变异学说预期：抗T1细菌（tonr）是在接触T1之前的生长过程中，由于基因自发突变而产生的，则tonr出现的频率将依据1.抗性是否出现，2.出现时间的早晚而呈现巨大的波动，既平均数方差。对波动实验结果的正确解释 抗性菌落多，是

22、突变发生的早；抗性菌落少，是突变发生的晚；抗性菌落无，是没有发生突变。 结论：细菌抗性的出现与接触噬菌体无关。突变是自发的，噬菌体T1无诱发抗性细菌的作用。涂布实验思考题 经重新涂布的一组平皿，出现的抗性菌落多，是否可以理解为，经重新涂布后，细菌接触噬菌体的机会增多了，从而诱发成抗性的也多了呢？为什么？影印培养实验 J.Lederberg建立，实验证明：细菌对抗生素抗性的表型与菌体所接触的环境因素之间没有对应关系。细菌并不针对某些药物而产生抗性 细菌链霉素抗性基因str r = rps L (ribosomal protein small)编码核糖体蛋白小亚基的基因共有21个：rps A rp

23、s U , 分别编码 S1 S21 蛋白,rps L基因编码 S12蛋白。细菌对链霉素产生抗性的原理 链霉素抗性菌株 str r 的核糖体30s亚基的s12蛋白变构，不与链霉素结合，使翻译蛋白正常。 链霉素敏感菌株str s 的核糖体30s亚基的 s12蛋白是正常的，可与链霉素结合，使翻译不正常。 已知影响翻译过程的抗生素有20余种。二、自发突变的机制1. DNA分子的内部运动（碱基的互变异构） 2. DNA环出引起的缺失突变3. 细胞自身代谢物的干扰 4. 转座子三、适应突变（Adaptive mutation） 适应突变 是指微生物细胞群体，在非致死的选择条件下，处在不分裂或缓慢分裂状态时

24、延长培养时间，细胞发生的一种自发突变。 目前发现，表现适应突变的基因大多是有关碳源利用、氨基酸或核苷酸合成的营养缺陷型基因，但这些突变基因都可以自发突变成为原养型基因。适应突变实例：E.coli FC40 lac / (Flac- ) F因子上的lac基因构建成组成型表达，但该基因的第320密码子发生了移码突变，由CCC CCCC，因此表型为lac 将FC40菌株涂布在以乳糖为惟一碳源的平板上培养时，第二天出现12个lac+ 回复突变的菌落,继续培养至第7天时lac+ 回复突变的菌落就会达到40多个。见下图：适应突变的分子机制是什么？ 对早期和后期出现的lac+ 回复突变子的突变机制分析发现，

25、这两类是不一样的。 后期出现的lac+ 回复突变子被认为是适应突变所产生，大多是在lac 基因区段发生了单一碱基的缺失，既发生了1的移码突变，使原来1的移码突变得到了修正，表型为lac+ 回复子； 而早期出现的lac+ 回复突变子被认为是自发突变所产生，情况比较复杂，有缺失碱基、有添加碱基还有重复，无论是哪一种，最终都是恢复原来的读码框架，而表型为lac+。 发现与细胞中的重组蛋白有关，如recA,B,C,D四个基因。初步认为与甲基指导的DNA错配修复系统有关,更广泛深入的研究尚在进行中。DNA损伤修复Repair of DNA Damage一、光复活修复 （Photoreactivation

26、）二、甲基化引导的错配修复（MethyldirectedMismatch Repair 简称MDMR）三、切除修复 (Excision Repair) 四、重组修复 (Recombination Repair) 五、 SOS Repair光复活修复特点：1 是由可见光激活 2 酶促裂解胸腺嘧啶二聚体 3 具高度专一性甲基化引导的错配修复系统（MDMR） MDMR是E.coli 的主要修复系统之一，主要修复DNA双链中的轻微损伤，包括错配、移码、碱基类似物的替代等等，而DNA的重大损伤要靠其他的修复系统。 参与该修复系统的蛋白主要有4种：Mut S: 与错配位点结合Mut H, Mut L： 结

27、合在Mut S蛋白上，形成3种蛋白复合物，Mut H有核酸酶的作用，可切割 DNA链Dam：甲基化酶，特异识别GATC序列中的A, MDMR的修复模型见图示。切除修复 Excision Repair 参与切除修复系统的基因基因 产 物 的 功 能uvr A DNA 结合蛋白uvr B 与Uvr A结合，再结合到DNA上，造成3端切口uvr C 与Uvr B结合形成复合物，造成5端切口uvr D DNA解旋酶，帮助移去受损伤的寡核苷酸pol A DNA聚合酶I，以未损伤链为模版，填充缺口lig DNA连接酶，封合单链缺口SOS Repair是DNA分子在较大范围受到重大损伤时，诱导产生的一种修复

28、机制。借用国际通用的紧急呼救信号“SOS”(save our soul)来命名，表示细胞处于危机状态。1953年 Jean J. Weigle 发现：噬菌体被uv照射后，感染E.coli，多数噬菌体死亡，存活的少数噬菌体中，突变型很少； 如噬菌体被uv照射后，感染uv照射的E.coli，存活的噬菌体数大大增加，而且有较多的噬菌体突变。因此前一现象称为W-复活效应（W-reactivation）,后一现象称为W-诱变效应（W-mutagenesis）。SOS修复开始，错配碱基增加DNA polymerase III 的校正功能失活！SOS修复中重要的基因据2002年文献报道，SOS修复中应答基因

29、超过40个。Cell有一类基因称为din基因(damage inducible gene) ，都在DNA损伤后才大量表达，许多din基因参与SOS修复，但多数基因的功能尚不清楚。recA和 lexA是SOS中重要的调控基因对recA lexA 两个基因的作用机制的了解，来自下面几个实验结果：1 recA lexA 菌株均不呈现W-效应 2 E.coli recA+（ + ） uv 释放E.coli recA （ + ） uv 不释放3 recA+ 细菌在释放 之前， C1蛋白被降解 4 1978年分离出RacA蛋白, MW. = 40,000 d.1979年分离出LaxA蛋白, MW. = 2

30、4,000 d. 5 RacA蛋白有蛋白酶活性，使LaxA蛋白发生自我切割，证明RacA蛋白是SOS中正控蛋白。6 lexA / lexA+ 局部二倍体细胞中，lexA 呈显性，细胞无SOS应答能力，证明lexA基因是负控调节基因，编码阻遏蛋白。调节机制 见图219umuC 和 umuD 基因与SOS诱导的突变有关1. 灵敏度能将少数突变型选择出来，将多数未突变类型淘汰掉。回复突变比正向突变更容易选择：CM MM正向突变 X+ X 筛选困难回复突变 X X + 筛选容易2.代表性 对于一种生物具有诱变作用的药物，对其它生物是否同样有诱变作用？ 对某一基因有较强诱变作用的药物，对其它基因是否也有

31、同样的作用3.方法要简便爱姆斯测验（Ames Test）1972年由Bruce Ames 建立，使用一套突变型的沙门氏菌：TA1535 rfa uvr B his G 46 碱基置换 TA1536 rfa uvr B his C 207 移码突变GC缺失TA1537 rfa uvr B his C 3076 移码突变GC增加 TA1538 rfa uvr B his D 3052 移码GC/CG双缺理论依据：认为细胞癌变是某些体细胞基因发生突变的结果。菌株的特点：1. 均为组氨酸缺陷型，但突变类型不同，不但可以证明诱变作用，还可以检测诱变机制。2. 除组氨酸缺陷型外，又引入2个突变基因：rfa

32、: 深度粗糙突变型，加强细胞表面透性，使诱变效果提高几十倍。uvr B：丧失切除修复功能，使诱变效果提高十倍。菌株的特点使得Ames Test灵敏度高,代表性强Ames Test 实验过程：1可疑致癌物鼠肝匀浆 保温 吸入滤纸片2. 基本培养基（MM）108 his 系列菌株混合均匀倒平板3. 放上第1步制备的滤纸片 4. 370C培养后观察5. 长出的菌落均为his 的回复子菌株 6. 可观察致癌物的作用强弱一、诱变育种 二、突变型的筛选诱变剂1. 亚硝基胍（NTG）： 超诱变剂，不能接触皮肤2. 甲基磺酸乙脂（EMS）： 诱变效率高，毒性小3. 紫外线（UV） ： 诱变谱广，损害眼角膜染色

33、体组饱和：长期使用同一种诱变剂致使诱变效果低的现象。剂 量 每一种诱变剂对于每种生物有着特定的最适剂量。 可以用一个便于测定的突变来测定最适剂量。 剂量的选择与诱变目的有关，若是质量性状，由单基因控制，可采用高剂量；若是数量性状，由多基因控制，不能采取过高的剂量。 确定最适剂量的曲线：诱变产量性状时诱变剂及剂量的特点 诱变剂的作用不是提高绝对产量，而是增加变异幅度。 最适剂量处理，变异幅度最大。 高剂量处理，首先消失高产菌株。 产量性状频率分布曲线：（一）高产菌株的筛选1. 此类突变的特点： 渐进式，引起表型变异的基因数量多。 高产、低产菌株与出发菌株在形态上无明显的区别。 易受环境条件的影响

34、，高产菌株在一定条件下才表现。2. 如何提高初筛效率？ 对产酸菌，初筛时加酸碱指示剂 对水解酶类产生菌，加底物观察水解透明圈 对抗生素产生菌，用敏感细菌观察抑菌圈3. 筛选多少单菌株？ 取决于突变频率（二）营养缺陷型的筛选所用培养基：1 完全培养基 CM () 能满足任何缺陷型的需要，由有机成分组成。2 基本培养基 MM () 能满足野生型需要，由无机成分组成。3 限制培养基 LM () 在基本培养基中加入完全培养基成分。4 补充培养基 （met）（his） 在基本培养基中加入某一类营养物质，满足某一种营养缺陷型的要求，如补加蛋氨酸或组氨酸。1营养缺陷型的浓缩 青霉素浓缩法原理：青霉素只能杀死

35、生长繁殖的细菌，不能杀死停止分裂的细菌。在MM中，只有野生型能生长，则被杀死，而营养缺陷型由于不能生长而被保护下来，得以浓缩。 青霉素浓缩法过程： 诱变剂处理 培养46h,离心 氮饥饿46h, 离心菌种-置完全培养基-无氮基本培养基-含青霉素培养68h 培养的基本培养基-取样分别涂布CM和MM-观察效果若CM、MM上菌数接近，效果不明显若CM菌数多,MM 上菌数少,效果明显-分离鉴定青霉素浓缩法主要步骤的原理：第2步：使DNA复制、转录和表达得以进行，顺利的修复，以使前突变事件固定下来；克服延迟现象。第3步：耗尽体内的代谢库，否则在青霉素处理时会因为生长而死亡第4步：野生型继续生长，细胞壁合成

36、受到抑制，细胞死亡；突变型不能生长，固免于死亡，保存下来。2 营养缺陷型的检出 逐个测定法：浓缩后的菌液接种完全培养基，长出菌落后，将每一菌落分别接种基本培养基和完全培养基，凡是在前者上不长的就是营养缺陷型。 夹层培养法：在培养皿制备三层基本培养基，中间一层含细菌，待长出菌落后做标记，再倒一层完全培养基，再出现菌落则为营养缺陷型。 影印培养法：见下图3 营养缺陷型的鉴定 生长谱法 将待测细菌（106108）混进基本培养基，倒入培养皿，凝固后在标定位置放置少量的氨基酸、碱基等粉末。经培养后可以看到营养缺陷型在所需要的化合物周围出现生长现象。生长谱法优点：1. 方法简便，1个培养皿上可检测多个化合

37、物 2. 污染和回复突变均不影响测定结果3. 不必考虑浓度，化合物可以扩散，自然形成浓度梯度（三）其它突变型的筛选1 抗药性突变菌株的筛选梯度平板法图示：2 温度敏感突变型的筛选E.coli, Streptomyces, 30380C 生长，39430C不长。Yeast 2336 0C 生长，39430C不长。 3发酵突变型 lac1）用乳糖EMB平板（含有伊红、美兰酸碱指示剂）lac：分解乳糖，产酸，菌落呈深紫色 lac : 分解含氮化合物，产碱，指示剂无色，菌落呈白色2）用IPTG X-gal平板IPTG：一种硫代半乳糖苷，可作为诱导物X-gal：被 半乳糖苷酶分解后形成蓝色不溶性色素，l

38、ac白色菌落，lac蓝色菌落一、T4噬菌体基因组的特点 T4噬菌体DNA为dsDNA，线形分子，由1.6X106个核苷酸组成。基因组中135个基因是已知的，另外70个基因是未知的。1 DNA分子中的胞嘧啶（C）是由羟甲基胞嘧啶（HMC） 代替，但碱基配对原则没有变化，只是后者可以进一步糖基化。 2 DNA分子具有环状排列和末端臃余的结构。什么是环状排列和末端臃余？环状排列是指T4phage DNA分子的核苷酸排列顺序虽然是不变的,可是每一个phage从哪一个核苷酸开始则有种种可能。末端臃余是指T4phage DNA分子的两端有相同核苷酸序列的重复。噬菌体T2的基因组是200kb,末端多余的碱基

39、约12kb，为其基因组的0.5-3 %。噬菌体T4的基因组是169kb,末端多余的碱基约3.38kb，为其基因组的2 %。末端臃余和环状排列的形成机制1 phageDNA在寄主中合成时，形成1个包括多个单位长度的、连在一起的dsDNA分子：abcdefgabcdefgabcdefgabcdefg.2 Phage头部蛋白包装DNA时，被切割的DNA长度总是固定的，而不管序列如何，比完整的基因组长一些，形成了具有可变序列的T4DNA分子。对于1个phage来讲其基因组是末端臃余，对于群体phage来讲则为环状排列。二、T4噬菌体的基因重组S.Benzer 对T4噬菌体的rIIA和 rIIB2个基因

40、进行了结构分析，证明1个基因内有大量的突变子和重组子。遗传重组可以发生在基因内部。S.Benzer实验：E.Coli B E.coli KWild type T4 + +T4rII + -S.Benzer 巧妙的利用野生型和突变型T4对寄主的要求不同，设计了实验：1. 2个不同的rII 噬菌体共感染E.coli B菌株， 2. 释放出子代噬菌体，3. 再感染E.coli K菌株, 4. 观察出现野生型T4的数量，5. 计算重组频率。不同突变的噬菌体混合感染时，两个亲本噬菌体的基因组全部参与重组。因此同高等生物一样，可以利用重组值计算连锁图距：重组噬菌体数重组频率（图距） - X100噬菌体总数

41、上述方法称为重组测验，灵敏度非常高。实际测出rII突变型之间的重组频率最小值为0.01%(万分之一)！相当于2.5个碱基对！T4噬菌体的遗传重组特点1 重组发生在噬菌体DNA复制后，故参与重组的亲本不局限于侵染时的2个。2 基因重组可重复发生：T4-1 A-BC , T4-2 AB-C , T4-3 ABC-经 1次杂交后，可出现基因型为A- B- C- 的子代噬菌体。3 细胞裂解早，重组体少，细胞裂解晚，重组体多。这些特点说明，噬菌体基因组在细菌细胞中是重复进行基因重组的。直到包装成完整的噬菌体颗粒，重组才结束。 因此噬菌体杂交子代的重组频率，并不代表真正的基因图距，而只是一个相近的数值。三

42、、互补测验和顺反子 互补测验（Complementary Test）：是一种对基因进行功能等位性测定的实验。 功能等位性：对于基因等位性的判断不来自基因位置的测定，而来自基因功能的测定，这种等位性称为功能等位性。 互补测验的基本要求：1. 能使2个突变型的基因同处1个细胞，形成二倍体获局部合子。2. 同处1个细胞的2个突变型的基因不可以重组。可用于互补测验的系统1. 沙门氏菌的流产转导 2. HFT中的杂基因子： gal - / dgal 3. F 转导： lac - / F-lac - 4. 异核体5. 噬菌体的共感染在1个杂合二倍体中，2个突变位点在同一染色体上，而另一染色体是功能完全的，

43、则称为顺式结构（cis-position）。 若2个突变位点位于2条染色体上，则称为反式结构(trans-position)。 顺式结构的遗传效应不同于反式结构的现象称为顺反位置效应。 表现顺反位置效应的2个突变是同一基因突变，不表现顺反位置效应的2个突变不是同一基因突变。 r106和r51顺式和反式结果一样，证明是不同的基因。 r106和r47顺式可互补，反式不能互补，证明是同一基因。S.Benser 通过T4 rII突变型的互补实验，将rII区域分为2个功能区，即2个基因：rIIA, rIIB。 S.Benser将一系列不同位点突变没有互补功能的区域称为顺反子（Cistron）,一个Cis

44、tron就是功能意义上的基因，但Cistron与Gene相比更加具体精确。 rIIA是一个顺反子，rIIB是另一个顺反子，每一个顺反子在染色体上的区域就是一个基因座位，而每一个基因座位中有若干个突变位点，它就是在一个基因内部发生突变的最小单位。四、缺失作图 原理：凡是能和某一缺失突变型发生重组的，其突变位置一定不在缺失区域内；凡是不能重组的，其突变位置一定在缺失区域内。 缺失定位非常准确，但是需要一系列的缺失突变株作为工具。（见教材图310、311）噬菌体 基因组只有48.502kb,仅有T4基因组的30分之一。是双链线形DNA分子。 其DNA分子的特征是：在2个5端各有一条12个碱基的单链序

45、列，彼此完全互补，这种特殊的结构称为粘性末端（Cohesive end）。 双链线形DNA分子进入细菌细胞后，迅速通过粘性末端的互补作用形成环状的分子。 由粘性末端形成的双链区段称为cos位点。一、噬菌体的生活周期 感染寄主后，其DNA整合进寄主染色体，整合形式的称为 原噬菌体。 整合原噬菌体的细菌称为 溶源细菌，这一过程称为溶源途径。 溶源细菌一般不被同种噬菌体感染，这种现象称为免疫性。 溶菌途径也称为噬菌体的营养生长。 诱导溶源细菌特点1.能自发释放和诱导释放噬菌体 2.对同一种噬菌体具有免疫性3.溶源细菌表示：菌株后加括号，括号内为噬菌体。如:E.coli K12 ( )E.coli K

46、12（P1）二、噬菌体的溶源化及诱导释放机制1 噬菌体的整合及溶源化 2 噬菌体的诱导和切离反转录病毒（Retroviruses）反转录病毒的重要性 是最早被发现与癌症有关的病毒，还引起白血病、淋巴瘤及其肉瘤。致癌机制已被广泛研究。如：HIV引起人类的获得性免疫缺陷综合症（艾滋病）。RSV引起禽类的肉瘤。MLV引起小鼠白血病。 反转录病毒基因组可以通过DNA中间体整合进宿主基因组，可利用这种整合作用进行“基因治疗”。 反转录酶已经成为基因工程的重要工具。重要的反转录病毒有： HIV：人类艾滋病病毒 RSV：禽类劳斯肉瘤病毒 MLV：小鼠白血病病毒一、结构和生活周期：结构 脂质包膜，外膜蛋白，跨

47、膜蛋白，核衣壳， 2条正链RNA，核蛋白，反转录酶，整合酶，蛋白酶等等。生活周期：病毒感染寄主- 核衣壳进入细胞质-核衣壳裂解-释放RNA和反转录酶-合成dsNDA整合 成为原病毒-转录mRNA和基因组RNA-翻译病毒蛋白-包装病毒颗粒以出芽方式分泌-获得包膜-病毒粒子二、反转录病毒基因组1 基因组为ssRNA，但病毒颗粒中有2条各自独立的ssRNA，5端有典型的真核生物mRNA的帽子结构，3 端有多聚腺苷（poly A）。2 所有的反转录病毒都含有的基因区域是：gag,pol, env, 致癌病毒含有scr, 参与细胞转化和癌变。3 重复序列在反转录过程中起重要作用。4 引物为 tRNA，各

48、种病毒不同，都是从寄主细胞带入病毒粒子。5 长末端重复序列（LTR）在反转录过程中形成，在整合和转录过程中起重要作用。6 反转录酶主要是RNA聚合酶，但实际有3种酶活性： 反转录，由RNA合成DNA DNA聚合酶，由DNA合成DNA RNase H活性，降解RNA三、反转录过程中DNA双链的合成和LTR的产生 反转录病毒RNA基因组U5的内侧有一个位点称为PBS,是tRNA引物结合位点。 RNA基因组就是以与tRNA互补配对的形式包裹在病毒颗粒内的。 病毒粒子进入细胞质以后， RNA基因组被释放出来，同时释放的还有反转录酶。四、病毒线性DNA整合到寄主细胞基因组 反转录病毒的线形双链DNA分子

49、合成以后，进入细胞核。 有的DNA分子呈线型，有的呈环状。近些年研究证明，反转录病毒是以线形DNA分子整合的。 体外实验证明，整合过程可以被单一的病毒整合酶所催化，转录病毒DNA的末端序列非常重要，如该序列有突变，则不能整合。五、原病毒的基因表达1 病毒基因的转录 只有整合进宿主基因组中的病毒DNA（原病毒）才可以持续的表达。 LTR不但提供了整合所需的末端序列，而且也提供了转录及转录后加工的信号。 图330 由原病毒DNA转录的RNA既可以作为mRNA进一步合成病毒的蛋白质，也可以作为子代病毒的RNA基因组。2 转录后加工 反转录病毒RNA基因组以及大多数病毒mRNA并非一次合成的，而是经由

50、1个初级转录本加工而成。 所有的反转录病毒RNA基因组和mRNA都具有相同的5端。在5端形成cap结构:m7GpppGmp 。 初级转录本在3端的R序列中含有加尾信号：AAUAAA,在3端生成poly(A) 尾巴。 加工后的RNA转移到细胞质中，一些作为基因组RNA，一些作为mRNA，翻译产生病毒所需的蛋白质。 反转录病毒属于正链病毒（plas strand virus）。3 病毒mRNA的翻译六、反转录病毒基因组及其复制特点 反转录病毒基因组由2个独立的RNA分子组成，5端有真核生物mRNA的典型帽子结构， 3端是多聚腺苷。但这一RNA分子并不直接用作mRNA。 所有的反转录病毒基因组都包括

51、这样几个区域：gag, pol, env 。 末端重复序列在复制过程中起着重要的作用。 反转录酶主要是一种RNA聚合酶，但实际上它有3种酶活性：1 反转录酶活性 2 DNA聚合酶活性 3 RNase H 活性 引物 反转录酶也需要引物，引物是一种特异的tRNA，这种tRNA依据病毒种类而不同，但都是从前一个寄主细胞带入病毒粒子的。一、转化因子的特性及感受态特性: 转化因子必需是双链DNA(证明见下图) 单链DNA可使细胞转化(证明) 转化因子的大小从0.515 kb单链DNA可使细胞转化的证明：非转化因子DNA对于转化因子DNA的转化有干扰作用。如：strs DNA 对 strr DNA。如果

52、将两种DNA 混合在一起，加热使其变性，逐渐冷却复性，形成strs DNA 和 strrDNA杂合的双链分子，对转化不再有干扰作用。证明：转化因子的单链可以使受体细胞转化。感受态（Competence） 感受态是指细胞能够接受转化DNA的生理状态 感受态可以诱导产生流感嗜血杆菌， 大肠杆菌 感受态因子1. DNA结合蛋白（细胞膜） 2. 细胞壁自溶素 3. 单链DNA结合蛋白（ Competence-Specific ）4. 多种核酸酶 感受态细胞特征1. 细胞表明正电荷增加 2. 细胞壁通透性加大 3. 细胞表面分解DNA的能力加强 这些特征均由感受态因子引起，使细胞有利于吸收外源DNA。二、转化DNA的进入 革兰氏阳性菌转化（图914）1）细胞分泌感受态因子，出现感受态， 2）双链DNA吸附细胞表面特异受体，3）双链DNA被内切酶切成45MD的片段，外切酶将一条链降解。4）另一条链与感受态蛋白接