荧光PCR检测原理2

1、荧光基团通常各自拥有单一的光吸收峰。在光的刺激下，荧光基团吸收光的能量后通常以三种方式释放出能量：1) 光能 许多荧光基团吸收光能后仍旧以光能形式释放能量，并且发射光的峰值大于吸收峰。2) 热能 某些荧光基团吸收光能后，能量转换为热量扩散到环境中，如 Dabcyl。3)转移给临近的分子 当 临近 的 分子 满 足发 生 能量转移的要求时，能量从荧光基团传递到临近的分子。 荧光标记信号的产生荧光标记信号的产生 荧光染料直接结合扩增产物荧光染料直接结合扩增产物SYBR green ISYBR green I特异性结合双链，释放荧光信号特异性结合双链，释放荧光信号 荧光标记引物荧光标记引物 特异性荧

2、光探针特异性荧光探针TaqmanTaqman双荧光标记探针双荧光标记探针molecular Beaconmolecular Beacon荧光标记探针荧光标记探针荧光标记杂交双探针荧光标记杂交双探针SYBR GREEN ISYBR GREEN I 特异性荧光特异性荧光双标记探针双标记探针 Taq酶酶 5353外外切酶活性切酶活性l灵敏度高灵敏度高l特异性强特异性强l全封闭全封闭PCRPCR过程，无需后处理过程，无需后处理l采用采用dUTPdUTPUNGUNG酶的防污染系统，有效降低污染机会酶的防污染系统，有效降低污染机会l即时反映扩增过程，摒弃终点数据，更适用于定量即时反映扩增过程，摒弃终点数据

3、，更适用于定量l定量范围宽，可达到定量范围宽，可达到1010个数量级，无须稀释样品个数量级，无须稀释样品l可实现一管多检可实现一管多检l仪器自动分析，更快获得结果仪器自动分析，更快获得结果 原理原理 针对同种样本，不同的引物分别扩增不同的针对同种样本，不同的引物分别扩增不同的靶靶DNADNA，并分别被不同的特异性探针所识别，并分别被不同的特异性探针所识别，通过探针的不同荧光标记实现区分。通过探针的不同荧光标记实现区分。 特点特点 一次性处理样品一次性处理样品 一次性反应一次性反应 一次性给出一次性给出2 2种或种或2 2种以上病原体检测结果种以上病原体检测结果 两套或两套以上扩增体系相互无信号

4、干扰两套或两套以上扩增体系相互无信号干扰竞争性荧光内标竞争性荧光内标(IC)定量定量PCR技术技术Internal controlInternal control简称简称ICIC，通常是指与靶序列十分相，通常是指与靶序列十分相似的一段似的一段DNADNA序列，两者在相同的条件下可被同一对引序列，两者在相同的条件下可被同一对引物扩增，具有相同的扩增效率；区别在于两者的探针物扩增，具有相同的扩增效率；区别在于两者的探针结合区，可分别被不同序列的探针识别，通过探针的结合区，可分别被不同序列的探针识别，通过探针的不同荧光标记实现区分。不同荧光标记实现区分。 监控监控PCRPCR反应，避免样本抑制物、反

5、应，避免样本抑制物、DNADNA（RNARNA）提取过程）提取过程的丢失、误操作等造成的假阴性结果；并对以上原因的丢失、误操作等造成的假阴性结果；并对以上原因造成的定量误差进行修正。造成的定量误差进行修正。荧光定量荧光定量PCR的临床应用的临床应用 免疫学诊断主要是抗原抗体反应，应用于临床通常在免疫学诊断主要是抗原抗体反应，应用于临床通常在体内产生抗体以后，而许多病原体的免疫学检测存在体内产生抗体以后，而许多病原体的免疫学检测存在较长的较长的“窗口期窗口期”，比如，比如HCVHCV的的“窗口期窗口期”平均长达平均长达7070天，不利于对疾病的早期诊断；天，不利于对疾病的早期诊断；PCRPCR方

6、法直接检测病原方法直接检测病原体的体的DNA/RNADNA/RNA，能大大缩短，能大大缩短“窗口期窗口期”，其，其高灵敏度的高灵敏度的检测检测显然也有利于疾病的早期诊断显然也有利于疾病的早期诊断。通过定量检测病毒滴度可以间接评估受侵器官或组织的炎症发生程度以及是否发生病变；长时间机体病毒高水平的患者尤其是慢性病患者往往预后不好。因此对病原体的定量PCR检测对病情和预后评估均有参考意义。 对病毒感染的药物治疗中，免疫学指标的变化通常比较滞后出现，且受个体差异影响较大，从而对临床判断难以及时提供直接证据；而荧光定量PCR检测可直接反映病原体滴度是否受药物治疗发生变化，从而为药物疗效观察提供直接依据

7、，以供治疗方案参考。同时对不同治疗时间的用药剂量和用药时间提供依据。ALTAnti-HBsMonths after Start of Therapy0Normal AltBeforetherapy1234561224 DNAHBe AgHBs AgALTMonths after Start of Therapy0Normal Alt治疗前治疗前1234561224HBV DNAHBe AgHBs Ag 不同剂量IFN-a 单次给药后HCV-1型病人 病毒滴度变化的定量监测（N=32）Lam et al - Hepatol 26: 226, 1997Baseline24 hours48 hour

8、sgenomes/ml x1million0246810121410 MIU5 MIU3 MIU 0-20-40-60-80-100治疗周数拉米夫定安慰剂血清HBV DNA;中位%变化0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52n=192n=404n=171n=359III期临床研究的综合数据 荧光PCR可实现对点突变、缺失突变、插入突变、多基因突变等的检测。对产前诊断具有其他方法不可比拟的优势，有利于优生优育，提高人口素质。 锚探针 突变探针突变探针Tm值较锚探针低5不完全配对完全配对不完全配对完全配对温度低中高Factor V 点突变检测ForwardFor

9、wardPrimerPrimerReverseReversePrimerPrimerDNADNACGCCGCCGCCGCLC Red 640 LC Red 705 扩增子扩增子Hybprobe Pair 1Hybprobe Pair 1Hybprobe Pair 2Hybprobe Pair 2双点突变的检测原理双点突变的检测原理双位点双色检测Without cccWithout cccWith cccWith cccMut 1 + Mut 2WT1 + WT2Het 1 + Het 2H20F2F2F3F3 荧光PCRPCR可对病原体的母婴传播进行有效的监控，可对病原体的母婴传播进行有效的监

10、控，为确定宫内感染、围产期感染或哺乳期感染等提供为确定宫内感染、围产期感染或哺乳期感染等提供依据，为母婴传播的阻断等提供参考。依据，为母婴传播的阻断等提供参考。荧光PCR的作用： 可对原癌基因的突变和易位等作出检测。 可对原癌基因的mRNA进行定量分析。 有利于肿瘤的早期诊断，甚至癌前诊断。 探索癌变发生机理的研究提供参考。 区别肿瘤的良性和恶性以及炎症反应。荧光PCR在血液筛查中的应用 NAT应用于血液筛查的意义应用于血液筛查的意义血液筛查现状血液筛查现状筛查方法：免疫学筛查方法：免疫学输血危险性来源：输血危险性来源：窗口期献血，病毒变异，非典型免疫应答和实验室检测的失误窗口期献血，病毒变异

11、，非典型免疫应答和实验室检测的失误 NAT可显著缩短窗口期，提高输血安全性可显著缩短窗口期，提高输血安全性HBV：缩短6-15天HCV：缩短41-60天HIV：缩短10-15天病毒颗粒DNARNAFQ-PCRRT-FQ PCR裂解荧光信号检测核酸纯化系统多通道荧光多通道荧光PCR自动检测系统自动检测系统自动加样多样本混合（多样本混合（Mini pool）规格：规格：16-96donations“Pool”是为了加快筛查的进度和降低成本，将多袋血浆进行混合后进是为了加快筛查的进度和降低成本，将多袋血浆进行混合后进行检测。行检测。“Pool”的规格取决于临界阳性和所用的规格取决于临界阳性和所用NA

12、T试剂的检测限度试剂的检测限度。(据文献，PEI要求欧盟所有原料血浆必须进行HCV-RNA的NAT检测，单份血源的检测限度应达到5000 IU/ml，约1.352.4104geq/ml;目前FDA要求单份血源的RNA（HIV/HCV）检测限度应达到5000 copies/ml)筛查方法：筛查方法：递减法递减法矩阵法矩阵法递减法矩阵法前提：前提：试剂盒灵敏度（试剂盒灵敏度（500 copies/ml)24 minipool（矩阵法筛选）（矩阵法筛选）阳性检出率阳性检出率=1/10000以以10000 donars 为例：为例：试剂用量试剂用量:473每份筛查成本每份筛查成本=473*每份试剂费用每份试剂费用/10000=0.0473*每份试剂