分子生物学： 遗传物质的分子结构和性质

1、第二章 染色体与DNAn 遗传物质的分子结构和性质n 基因组和染色体n DNA的复制n DNA损伤与修复n 重组和转座第一节 核酸的分子结构核酸的分子结构1869年 J.T.Miescher 发现核素核素（muclein）n米歇尔在作博士论文时要确定淋巴细胞蛋白质的组成，不想却发现了一种既不溶解于水、醋酸，也不溶解于稀盐酸和食盐溶液的未知的新物质，最终证实这种物质存在于细胞核里，便将它定名为“核质”。后由瑞典著名生化学家阿尔特曼建议将“核质”定名为“核酸”。 n18851900年间，Kossel、Johnew、Levene证实核酸由不同的碱基组成。其最简单的单体结构是碱基-核糖-磷酸构成的核苷

2、酸。1929年又确定了核酸有两种，一种是脱氧核糖核酸(DNA)，另一种是核糖核酸(RNA)。Phoebus Levene 这五种碱基的结构如图n核酸分子中还发现数十种修饰碱基（核酸分子中还发现数十种修饰碱基（the modified component),又称稀有碱基，又称稀有碱基，(unusual component)。它是指上述五种碱基。它是指上述五种碱基环上的某一位置被一些化学基团（如甲基化、环上的某一位置被一些化学基团（如甲基化、甲硫基化等）修饰后的衍生物。甲硫基化等）修饰后的衍生物。DNA中的修饰中的修饰碱基主要见于噬菌体碱基主要见于噬菌体DNA，RNA中以中以tRNA含含修饰碱基最

3、多。修饰碱基最多。 n戊糖戊糖:nRNA中的戊糖是中的戊糖是D核糖，核糖，nDNA中的戊糖是中的戊糖是D2脱氧核糖。脱氧核糖。nD核糖的核糖的2所连的羟基脱去氧就是所连的羟基脱去氧就是D2脱氧核糖。脱氧核糖。 n核苷（核苷（nucleoside)：由由D核糖或核糖或D2脱氧脱氧核糖与嘌呤或嘧啶通过核糖与嘌呤或嘧啶通过糖苷键连接组成的化合糖苷键连接组成的化合物。核酸中的主要核苷物。核酸中的主要核苷有八种。有八种。 n核苷酸核苷酸(nucleotide)：核苷与磷酸残基构成的化：核苷与磷酸残基构成的化合物，即核苷的磷酸酯。核苷酸是核酸分子的合物，即核苷的磷酸酯。核苷酸是核酸分子的结构单元。核苷酸中

4、戊糖上的所有游离羟基均结构单元。核苷酸中戊糖上的所有游离羟基均可与磷酸形成酯键，但生物体内多数核苷酸的可与磷酸形成酯键，但生物体内多数核苷酸的磷酸连接在核糖或脱氧核糖的磷酸连接在核糖或脱氧核糖的C-5上，形成上，形成5-核苷酸。核苷酸。nDNA分子中是含有分子中是含有A、G、C、T四种碱基的脱四种碱基的脱氧核苷酸；氧核苷酸；RNA分子中则是含分子中则是含A、G、C、U四四种碱基的核苷酸。种碱基的核苷酸。 5磷酸腺苷的结构式n含有含有1个磷酸基团的核苷酸称为核苷一磷酸个磷酸基团的核苷酸称为核苷一磷酸（NMP），含有），含有2个磷酸基团的核苷酸称为核苷个磷酸基团的核苷酸称为核苷二磷酸（二磷酸（ND

5、P），有），有3个磷酸基团的核苷酸称为个磷酸基团的核苷酸称为核苷三磷酸（核苷三磷酸（NTP）。如）。如AMP是腺苷一磷酸，是腺苷一磷酸，GDP是鸟苷二磷酸，是鸟苷二磷酸，CTP是胞苷三磷酸。是胞苷三磷酸。 DNA的一级结构的一级结构n四种脱氧核苷酸按一定的排列顺序，以四种脱氧核苷酸按一定的排列顺序，以3, 5-磷酸二酯键相连接，形成多聚脱氧核磷酸二酯键相连接，形成多聚脱氧核苷酸链，即苷酸链，即DNA。nDNA的一级结构是指的一级结构是指DNA分子中核苷酸分子中核苷酸的排列顺序及其连接方式。的排列顺序及其连接方式。nDNA分子中脱氧核苷酸的连接有严格的分子中脱氧核苷酸的连接有严格的方向性，前一个

6、脱氧核苷酸的方向性，前一个脱氧核苷酸的3-羟基（羟基（-OH）下一个脱氧核苷酸的）下一个脱氧核苷酸的5-磷酸形成磷酸形成3，5-磷酸二酯键，从而构成一个没有分支磷酸二酯键，从而构成一个没有分支的线性大分子，其两个末端分别是的线性大分子，其两个末端分别是5-末末端（游离磷酸基）和端（游离磷酸基）和3-末端（游离羟末端（游离羟基）。基）。 n寡核苷酸（寡核苷酸（oligonucleotide)：这是与核酸有关的文献：这是与核酸有关的文献中经常出现的一个术语，一般是指二至十个核苷酸残基中经常出现的一个术语，一般是指二至十个核苷酸残基以磷酸二酯键连接而成的线性多核苷酸片段。以磷酸二酯键连接而成的线性多

7、核苷酸片段。n但在使用这一术语时，对核苷酸残基的数目并无严格规但在使用这一术语时，对核苷酸残基的数目并无严格规定，在不少文献中，把含有三十甚至更多个核苷酸残基定，在不少文献中，把含有三十甚至更多个核苷酸残基的多核苷酸分子也称作寡核苷酸。的多核苷酸分子也称作寡核苷酸。n寡核苷酸目前已可由仪器自动合成，它可作为寡核苷酸目前已可由仪器自动合成，它可作为DNA合合成的引物（成的引物（primer)、基因探针（、基因探针（probe)等，等， 核酸链的简写式n字符式：字符式：n用英文大写字母缩写符号代表碱基，用英文大写字母缩写符号代表碱基，n用小写英文字母用小写英文字母P代表磷酸残基。代表磷酸残基。n核

8、酸分子中的糖基、糖苷键和酯键等均省略不写，将碱核酸分子中的糖基、糖苷键和酯键等均省略不写，将碱基和磷酸相间排列即可。基和磷酸相间排列即可。n简写式中出现就视为简写式中出现就视为DNA链，出现则视为链，出现则视为RNA链。链。n以以5和和3表示链的末端及方向，分别置于简写式的左表示链的末端及方向，分别置于简写式的左右二端。右二端。 n5ppppppppp3DNA5ppppppppp3RNAn此式可进一步简化为：此式可进一步简化为：n5p35p3n上述简写式的上述简写式的5 末端均含有一个磷酸残基（与末端均含有一个磷酸残基（与糖基的糖基的5 位上的羟基相连）位上的羟基相连）,3 末端含有末端含有一

9、个自由羟基（与糖基的一个自由羟基（与糖基的3 位相连）位相连）,若若5 端不写，则表示端不写，则表示5 末端为自由羟基。末端为自由羟基。n双链双链DNA分子的简写式多采用省略了磷酸残基分子的简写式多采用省略了磷酸残基的写法，在上述简式的基础上再增加一条互补链的写法，在上述简式的基础上再增加一条互补链（complentary strand)即可，链间的配对碱基即可，链间的配对碱基用短纵线相连或省略。用短纵线相连或省略。n5335n 线条式：在字符书写线条式：在字符书写基础上，以垂线（位基础上，以垂线（位于碱基之下）和斜线于碱基之下）和斜线（位于垂线与之间）（位于垂线与之间）分别表示糖基和磷酸分别

10、表示糖基和磷酸酯键。酯键。n斜线与垂线部的交点斜线与垂线部的交点为糖基的为糖基的3位，位，斜线与垂线下端的交斜线与垂线下端的交点为糖基的点为糖基的5位。位。 DNA的一级结构的一级结构nDNA的一级结构是指的一级结构是指DNA分子中核苷酸的排分子中核苷酸的排列顺序，列顺序，DNA顺序（或序列）是这一概念的简顺序（或序列）是这一概念的简称。由于核苷酸之间的差异仅仅是碱基的不同，称。由于核苷酸之间的差异仅仅是碱基的不同，故可称为碱基顺序。故可称为碱基顺序。 nDNA分子中不同排列顺序的分子中不同排列顺序的DNA区段构成特区段构成特定的功能单位，这就是基因，不同基因的功能定的功能单位，这就是基因，不

11、同基因的功能各异，各自分布在各异，各自分布在DNA的一定区域。的一定区域。 DNA的二级结构的二级结构双螺旋结构双螺旋结构n(1)主链主链(backbone)：由脱氧核：由脱氧核糖和磷酸基通过酯键交替连接而糖和磷酸基通过酯键交替连接而成。主链有二条成。主链有二条,它们似它们似“麻花麻花状绕一共同轴心以右手方向盘旋状绕一共同轴心以右手方向盘旋, 相互平行而走向相反形成双螺旋相互平行而走向相反形成双螺旋构型。主链处于螺旋的外侧构型。主链处于螺旋的外侧,这这正好解释了由糖和磷酸构成的主正好解释了由糖和磷酸构成的主链的亲水性。链的亲水性。 所谓双螺旋就是所谓双螺旋就是针对二条主链的形状而言的。针对二条

12、主链的形状而言的。n(2)碱基对碱基对(base pair)：碱：碱基位于螺旋的内则基位于螺旋的内则,它们以它们以垂直于螺旋轴的取向通过糖垂直于螺旋轴的取向通过糖苷键与主链糖基相连。同一苷键与主链糖基相连。同一平面的碱基在二条主链间形平面的碱基在二条主链间形成碱基对。配对碱基总是成碱基对。配对碱基总是A与与T和和G与与C。碱基对以氢键。碱基对以氢键维系，维系，A与与T 间形成两个氢间形成两个氢键。键。n(3)大沟和小沟：大沟和小沟：n a 核苷酸间磷酸二酯键的核苷酸间磷酸二酯键的走向决定多核苷酸的方向，走向决定多核苷酸的方向，一条从一条从5-3，一条从，一条从3-5。链间有螺旋型的凹槽，其中链

13、间有螺旋型的凹槽，其中一条较浅叫小沟，一条较深，一条较浅叫小沟，一条较深，叫大沟，叫大沟，nb 大分子物质可到大沟中识别信息，主要是蛋白质结合的大分子物质可到大沟中识别信息，主要是蛋白质结合的部位。部位。nc 小沟可进入水分子，维持小沟可进入水分子，维持DNA结构的稳定性。结构的稳定性。n(3)大沟和小沟：大沟和小沟：B型型DNA仅仅是仅仅是众多众多DNA双螺旋双螺旋构象中的一种。构象中的一种。在外界条件的改在外界条件的改变下，双螺旋的变下，双螺旋的构象也会改变。构象也会改变。双螺旋结构的构象变异双螺旋结构的构象变异nDNA的构象现已知有:A，B，C，D，E，L，P, S, Z 9种。n引起D

14、NA双链构象改变有以下因素：（1）核苷酸顺序；（2）碱基组成；（3）盐的种类；（4）相对湿度。P-DNADNA结构的多态性结构的多态性nA-DNA和和B-DNA结构的多态性结构的多态性 n 1.在溶液中，在溶液中，DNA为为B型，当水合的型，当水合的B-DNA脱水，或由于脱水，或由于加入乙醇或盐而使水的活度降低时，就转变为加入乙醇或盐而使水的活度降低时，就转变为A型。型。n 2. B-DNA中，中，2-脱氧核糖的构象出现了变化，使同股多核脱氧核糖的构象出现了变化，使同股多核苷酸链中相邻磷酸基间的距离缩短苷酸链中相邻磷酸基间的距离缩短0.1nm，使每匝螺旋的碱，使每匝螺旋的碱基对数由基对数由B-

15、DNA的的10（溶液中为（溶液中为10.5）转变为）转变为A-DNA的的11。n3.在在B-DNA中，碱基对集中于螺旋轴，在中，碱基对集中于螺旋轴，在A-DNA中，碱基对中，碱基对向大沟方向移动了向大沟方向移动了0.5nm，从而改变了，从而改变了B-DNA的外形和沟的的外形和沟的尺寸。由于大沟、小沟是尺寸。由于大沟、小沟是DNA行使功能时蛋白质的结合位点，行使功能时蛋白质的结合位点，所以由所以由B-DNA变为变为A-DNA后后Pr对对DNA分子的识别也发生了相分子的识别也发生了相应的变化。应的变化。n4.A-T丰富的丰富的DNA片断常呈片断常呈B-DNA，若，若DNA双链中双链中一条链被相应的

16、一条链被相应的RNA所替换，会变构成所替换，会变构成A-DNA。n5.当当DNA处于转录状态时，处于转录状态时，DNA模板链与由它转录模板链与由它转录所得的所得的RNA链间形成的双链就是链间形成的双链就是A-DNA，故，故DNA的构象对基因表达有重要意义。的构象对基因表达有重要意义。n6. B-DNA双链都被双链都被RNA所取代而得到由两条所取代而得到由两条RNA链组成的双螺旋结构也是链组成的双螺旋结构也是A-DNA。Z-DNA的发现n1972年, Pohl et al 发现 poly(dG-dC)在高盐下旋光性发生改变；n1979年, Wang A.H-J(王惠君), A.Rich对d(CG

17、CGCG)单晶作X衍射分析提出ZDNA模型.左旋左旋DNA（一）Z-DNA的结构特点：n糖磷骨架呈“之”字形（Zigzag）走向。n左旋。nG残基位于分子表面。n分子外形呈波形。n大沟消失，小沟窄而深。n每个螺旋有12bp。 Z-DNA B-DNA ZDNA存在的条件：(1)高盐：NaCl2 Mol/L, MgCl20.7 Mol/L(2)Pu, Py相间排列：(3)在活细胞中如果m5C,则无需嘌呤-嘧啶相间排列，在生理盐水的浓度下可产生Z型。(4)在体内多胺化合物，如精胺和亚胺及亚精胺和阳离子一样，可和磷酸基因结合，使B-DNA转变成 Z-DNA。(5)某些蛋白质如Z-DNA结合蛋白带有正电

18、荷，可使DNA周围形成局部的高盐浓度微环境。(6)负超螺旋的存在生物学意义(1)(1)可能提供某些调节蛋白的识别。啮齿类动物病毒的可能提供某些调节蛋白的识别。啮齿类动物病毒的复复制起始部位制起始部位有有d d（GCGC）有交替顺序的存在；）有交替顺序的存在；(2)(2)在在SV40SV40的增强子中有三段的增强子中有三段8bp8bp的的Z-DNAZ-DNA存在。存在。(3)(3)原生动物纤毛虫，它有大、小两个核，大核有转录活原生动物纤毛虫，它有大、小两个核，大核有转录活性，小核和繁殖有关。性，小核和繁殖有关。Z-DNAZ-DNA抗体以萤光标记后，显抗体以萤光标记后，显示仅和大核示仅和大核DNA

19、DNA结合，而不和小核的结合，而不和小核的DNADNA结合，说明大结合，说明大核核DNADNA有有Z-DNAZ-DNA的存在，可能和转录有关。的存在，可能和转录有关。引自 ：.徐晋麟，徐沁，陈淳。（2005） 现代遗传学原理 （第二版）。科学出版社。 DNA的三级结构的三级结构n所谓所谓DNA的三级结构，是指在一二结构基础上的多的三级结构，是指在一二结构基础上的多聚核苷酸链上的卷曲。在一定意义上，是指双螺旋聚核苷酸链上的卷曲。在一定意义上，是指双螺旋基础上的卷曲基础上的卷曲n三级结构包括三级结构包括链的扭结链的扭结和和超螺旋超螺旋或者是单链形成的或者是单链形成的环或是环状环或是环状DNA中的中

20、的连环体连环体n超螺旋：由于组成超螺旋：由于组成DNA双螺旋的两条链没有按照理论数双螺旋的两条链没有按照理论数值互相盘绕，从而在分子内产生张力，原子位置发生重值互相盘绕，从而在分子内产生张力，原子位置发生重排，分子本身发生扭曲，这种空间结构叫超螺旋。可分排，分子本身发生扭曲，这种空间结构叫超螺旋。可分为正超螺旋和负超螺旋，在特殊情况下可以相互转变。为正超螺旋和负超螺旋，在特殊情况下可以相互转变。（在拓扑异构酶和溴乙锭的作用下）（在拓扑异构酶和溴乙锭的作用下）n超螺旋是超螺旋是DNA三级结构的一种普遍形式，双螺旋三级结构的一种普遍形式，双螺旋DNA的的松开导致形成负超螺旋，而拧紧则导致形成正超螺

21、旋。松开导致形成负超螺旋，而拧紧则导致形成正超螺旋。超螺旋使超螺旋使DNA形成高度致密状态以容纳于有限的空间中，形成高度致密状态以容纳于有限的空间中，而且推动着结构的转化以满足功能上的需要。而且推动着结构的转化以满足功能上的需要。 （一）（一） 超螺旋超螺旋（Supercoiling） DNA的三级结构的三级结构检测检测DNA三级结构的方法：三级结构的方法： 密度梯度离心 凝胶电泳 电镜观察引自 ：.徐晋麟，徐沁，陈淳。（2005） 现代遗传学原理 （第二版）。科学出版社。 （二）（二）三链三链和四链和四链DNAn这些这些DNA分子的结构单元分别是分子的结构单元分别是三碱基体三碱基体和和四四碱

22、基体碱基体；n这些碱基体通过这些碱基体通过Watson-Crick氢键氢键配对配对和和Hoogsteen氢键氢键配对相互作用而结合成共平面聚合体：配对相互作用而结合成共平面聚合体：nWatson-Crick Hoogsteen三链三链DNAn基本结构：基本结构：nPy-Pu-Py构象构象(如如T-A.T, C-G.C+)nPu-Pu-Py构象构象(如如A.A-T, G.G-C) HDNA鸟嘌呤四聚体第二节第二节 核酸的变性和复性核酸的变性和复性 一 DNA的变性 DNA的变性是指在一系列物理化学因素的作用下，DNA的分子量不变，二级结构中的氢键遭到破坏，DNA的双螺旋结构部分解体，或维系DNA

23、分子二级结构的氢键全部被破坏，双螺旋解旋分离成DNA单链的过程叫做DNA的变性（Denaturation）。下列因素可导致DNA变性：n高温、n酸、n碱、n尿素、甲酰胺：增加碱基在水中的溶解度，从而减弱碱基的疏水交互作用而造成。DNA变性后物理性质发生的变化：（1）流体力学的性质发生改变：粘度下降，而沉降速度增加；（2）提高了对紫外线的吸收能力，此称为增色效应（hyperchromic effect）。n 双链DNA的A260=1.00（浓度为50g/ml时，对波长260nm紫外线的吸收能力）；n单链DNA的A260=1.37；n游离碱基或核苷酸的A260=1.60。引自 ：.徐晋麟，徐沁，陈

24、淳。（2005） 现代遗传学原理 （第二版）。科学出版社。 解链温度（melting temperature, Tm）或熔点，Tm是A260的升高达到极大值一半时的温度。即是变性温度范围的中点。影响Tm值的因素外部条件：外部条件：如温度和正离子的浓度。浓度低于0.4mol/L，单价阳离子增高10倍，Tm增加16.6内部条件：内部条件：GC含量及分子类型: 当GC的含量上升1%，则Tm上升0.4马默多蒂（Marmur-Doty）关系式： Tm = 69.3+0.41(G +C)%， 或 GC%=（Tm-69.3） 2.44二 DNA的复性热变性的热变性的DNA缓慢冷却，已分开的互补链按原有碱基排

25、缓慢冷却，已分开的互补链按原有碱基排列顺序借助于氢键重新配对结合，致使列顺序借助于氢键重新配对结合，致使DNA分子的许分子的许多天然性状得以恢复的特性，称为多天然性状得以恢复的特性，称为DNA的复性的复性（Renaturation），也称退火），也称退火(annealing)。 DNA的复性对片段有两个要求：的复性对片段有两个要求： (1) 互补顺序的碰撞和排列；互补顺序的碰撞和排列； (2) 碱基的正确配对和氢键的形成。碱基的正确配对和氢键的形成。 影响复性反应的因素(1)DNA片段的大小；(2)DNA的浓度；(3)DNA复杂性;(4)温度：最佳复性温度一般比Tm低25C。(5)盐的浓度：复性时要求盐的浓度达到足够高;为什么？三三 核酸分子杂交：核酸分子杂交：n分子杂交分子杂交(简称杂交简称杂交,hybridization)是核是核酸研究中一项最基本的实验技术。酸研究中一项最基本的实验技术。n其基本原理就是应用核酸分子的变性其基本原理就是应用核酸分子的变性和复性的性质和复性的性质,使来源不同的使来源不同的DNA(或或RNA)片段片段,按碱基互补关系形成杂交双按碱基互