微生物基础技术第六章 微生物育种技术

1、第六章 微生物育种技术十二五十二五“职业教育国家规划教材职业教育国家规划教材 技术节点1 菌种选育流程(一)采样 从一特定生态系统中分离出具有代表性的细菌菌群，特别是分离那些在唯一微环境区域中出现的菌群时， 所采集的样本。十二五十二五“职业教育国家规划教材职业教育国家规划教材采样的注意事项1、采样时应尽可能保持相对无菌；2、所采集的样本必须具有某种代表性；3、采好的样必须完整地标上样本的种类及采集日期、地点以及采集地点的地理、生态参数等；4、应充分考虑采样的季节性和时间因素，因为真正的原地菌群的出现可能是短暂的；十二五十二五“职业教育国家规划教材职业教育国家规划教材5、采好的样应及时处理，暂不

2、能处理的也应贮存于4下，但贮存时间不宜过长。这是因为一旦采样结束，试样中的微生物A群体就脱离了原来的生态环境，其内部生态环境就会发生变化，微生物群体之间就会出现消长。十二五十二五“职业教育国家规划教材职业教育国家规划教材（二）增殖培养（二）增殖培养 在分离培养基中添加若干抗生素、复杂底物及生长因子等物质来激活细菌某一特殊基因组使其增殖。十二五十二五“职业教育国家规划教材职业教育国家规划教材（三）培养分离（三）培养分离 分离培养使菌种纯化。方法：稀释分离法 划线分离法 组织分离法十二五十二五“职业教育国家规划教材职业教育国家规划教材（四）筛选1、可疑菌落2、菌种鉴定3、筛选目的菌十二五十二五“职

3、业教育国家规划教材职业教育国家规划教材（五）毒性试验 对分离鉴定的菌种，按规定作毒性试验，对人无毒的菌株，才可以用于食品生产。十二五十二五“职业教育国家规划教材职业教育国家规划教材技术节点2 微生物的诱变育种出发菌株的选择同步培养处理菌悬液的制备诱变处理中间培养分离和筛选十二五十二五“职业教育国家规划教材职业教育国家规划教材(一)出发菌株的选择1自然界新分离的野生型菌株，对诱变处理较敏感，容易达到好的效果；2在生产中经生产选种得到的菌株与野生型较相像，也是良好的出发菌株；3每次诱变处理都有一定提高性能的菌株；4出发菌株开始时可以同时选23株，在处理比较后，将更适合的出发菌株留作继续诱变；十二五

4、十二五“职业教育国家规划教材职业教育国家规划教材 5要尽量选择单倍体细胞、单核或核少的多细胞体来作出发诱变细胞； 6正确选择诱变剂，根据采用的诱变剂或根据细胞生理状态或诱变谱选择诱变剂。十二五十二五“职业教育国家规划教材职业教育国家规划教材（二）同步培养最好用同步生长的细胞进行诱变育种十二五十二五“职业教育国家规划教材职业教育国家规划教材 (三)单细胞悬液的制备制备单细胞和单孢子状态的、活力类似的菌悬液。方法：离心，洗涤，过滤。十二五十二五“职业教育国家规划教材职业教育国家规划教材(四) 诱变处理1、诱变剂2、诱变处理方法： 物理因素 化学因素十二五十二五“职业教育国家规划教材职业教育国家规划

5、教材 (五) 中间培养 由于在发生了突变尚未表现出来之前，有一个表现延迟的过程，需三代以上的繁殖才能将突变性状表现出来。十二五十二五“职业教育国家规划教材职业教育国家规划教材 方法： 细胞变异处理 液体培养基中培养 得到纯的变异细胞十二五十二五“职业教育国家规划教材职业教育国家规划教材(六)分离和筛选筛选分初筛和复筛初筛以迅速筛出大量的达到初步要求的分离菌落为目的，以量为主。复筛则是精选，以质为主。十二五十二五“职业教育国家规划教材职业教育国家规划教材微生物诱变育种操作过程出发菌种（砂土管或冷冻管）斜面（或肉汤培养24h） 单孢子悬液（或细菌悬液） 诱变处理（处理前后的孢子液或细菌悬液活菌计数

6、） 涂布平板挑取单菌落传种斜面摇瓶初筛挑出高产菌株留种保藏传种斜面摇瓶复筛挑出高产菌株做稳定性试验和菌种特性考察中试考察大型投产实验十二五十二五“职业教育国家规划教材职业教育国家规划教材抗药性突变株的分离基本原理1微生物产生抗药性的原因1）基因突变：是微生物DNA分子的每一特定位置的特定结果改变所致，导致细菌发生不同的生理、生化变化，与药物的存在无关。2）耐药性基因转移：2抗生素诱导的微生物抗药性产生1）获得性耐药性：是指以前敏感细菌，接触抗生素后，由于遗传基因的变化、生存代谢途径的改变而产生的耐药性十二五十二五“职业教育国家规划教材职业教育国家规划教材梯度浓度平板法：为了便于选择适当的药物浓

7、度，分离抗药性突变菌株常用梯度平板法仪器1菌株 大肠杆菌2培养基 LB液体培养基3溶液或试剂 链霉素4仪器或其他用具 1ml 无菌吸管 盛有70%乙醇的烧杯，玻璃涂棒，水浴锅等方法和仪器十二五十二五“职业教育国家规划教材职业教育国家规划教材操作步骤1.菌种培养 接种大肠杆菌与盛有5ml LB液的试管中，37震荡培养24h2梯度平板制作（1）在热水中熔化LB琼脂培养基。（2）倒10已熔化的LB于无菌平板，并将平板一端垫起，使培养基在倾斜的位置凝固。（3）在已凝固的平板底部高琼脂的一边标上十二五十二五“职业教育国家规划教材职业教育国家规划教材第一节 遗传变异的物质基础十二五十二五“职业教育国家规划

8、教材职业教育国家规划教材遗传遗传： 亲代将自身一整套遗传因子传递给下一代的行为和功能，变异：指生物体在某种外因或内因的作用下所引起的遗传物质结构或数量的改变，亦即遗传型的改变。变异的几率极低（一般 为105 1010 ），变化的性状是稳定的、可遗传的。遗传（inheritance）和变异（variation）是生命的最本质特性之一遗传型遗传型：又称基因型，指某一生物个体所含有的全部遗传因子即基因组所携带的遗传信息。表型（表现型）表型（表现型）：指某一生物个体所具有的一切外表特征和内在特性的总和。是遗传型在合适环境条件下通过代谢和发育而得到的具体体现。n遗传型（可能性）环境条件表型（现实性）表型

9、是由遗传型所决定，但也和环境有关。表型是由遗传型所决定，但也和环境有关。一、概念十二五十二五“职业教育国家规划教材职业教育国家规划教材表型的差异只与环境有关特点：暂时性、不可遗传性、表现为全部个体的行为橘生淮南则为橘，生于淮北则为枳。遗传型变异（基因变异、基因突变）遗传型变异（基因变异、基因突变）：遗传物质改变，导致表型改变特点：遗传性、群体中极少数个体的行为 （自发突变频率通常为10-6-10-9）回本节十二五十二五“职业教育国家规划教材职业教育国家规划教材二、三个经典实验（一）（一）经典转化实验经典转化实验（transformation）：F.Griffith，v研究对象：Streptoc

10、occus pneumoniae（肺炎双球菌）vS型菌株：有致病性，菌落表面光滑，有荚膜vR型菌株：无致病性，菌落表面粗糙，无荚膜1928年，Griffith进行了以下几组实验：（1）动物实验对小鼠注射活R菌或死S菌 小鼠存活对小鼠注射活S菌小鼠死亡对小鼠注射活R菌和热死S菌 小鼠死亡 抽取心血分离活的S菌十二五十二五“职业教育国家规划教材职业教育国家规划教材（2）细菌培养实验热死S菌不生长活R 菌长出R菌热死S菌+活R 菌长出大量R菌和10-6S菌（3）S型菌的无细胞抽提液试验活R菌+S菌无细胞抽提液长出大量R菌和少量S菌以上实验说明：加热杀死的S型细菌细胞内可能存在一种转化物质，它能通过某

11、种方式进入R型细胞并使R型细胞获得稳定的遗传性状十二五十二五“职业教育国家规划教材职业教育国家规划教材1944年O.T.Avery、C.M.MacLeod和M。McCarty从热死S型S. pneumoniae中提纯了可能作为转化因子的各种成分，在离体条件下进行了转化试验：活R菌v加S菌DNAv加S菌DNA及DNA酶以 外的酶v加S菌的DNA和DNA酶v加S菌的RNAv加S菌的蛋白质v加S菌的荚膜多糖长 出 S菌只 有 R菌只有S型细菌的DNA才能将S. Pneumoniae的R型转化为S型。且DNA纯度越高，转化效率也越高。说明S型菌株转移给R型菌株的，是遗传因子。十二五十二五“职业教育国家

12、规划教材职业教育国家规划教材Avery在四十年代以更精密的实验设计重复了以上实验分别用降解DNA、RNA、蛋白质的酶作用于有毒的S型菌细胞抽提物只有DNA被酶降解破坏的抽提物无转化活性DNA是转化所必需的转化因子经典转化实验十二五十二五“职业教育国家规划教材职业教育国家规划教材 A. D. Hershey和M. Chase， 1952年噬菌体感染实验（1）含32P-DNA的一组：放射性85%在沉淀中（2）含35S-蛋白质的一组：放射性75%在上清液中所以，进入细胞的是噬菌体的核酸而不是蛋白质。十二五十二五“职业教育国家规划教材职业教育国家规划教材T2噬菌体感染实验（1952年）十二五十二五“职

13、业教育国家规划教材职业教育国家规划教材植物病毒的重建实验v为了证明核酸是遗传物质，H. Fraenkel-Conrat（1956）用含RNA的烟草花叶病毒（TMV）进行了著名的植物病毒重建实验。v将TMV在一定浓度的苯酚溶液中振荡，就能将其蛋白质外壳与RNA核心相分离。分离后的RNA在没有蛋白质包裹的情况下，也能感染烟草并使其患典型症状，而且在病斑中还能分离出正常病毒粒子。十二五十二五“职业教育国家规划教材职业教育国家规划教材v选用TMV和霍氏车前花叶病毒（HRV），分别拆分取得各自的RNA和蛋白质，将两种RNA分别与对方的蛋白质外壳重建形成两种杂合病毒： （1）RNA（TMV）- 蛋白质（H

14、RV）（2）RNA（HRV）- 蛋白质（TMV）v用两种杂合病毒感染寄主：（1）表现TMV的典型症状病分离到正常TMV粒子（2）表现HRV的典型症状病分离到正常HRV粒子。v上述结果说明，在RNA病毒中，遗传的物质基础也是核酸。十二五十二五“职业教育国家规划教材职业教育国家规划教材生化提取分别获得含RNA的烟草花叶病毒蛋白质外壳（病毒1）和核酸（病毒2）抗血清处理，证明杂种病毒的蛋白质外壳来自病毒1，而非病毒2杂种病毒的后代的蛋白质外壳表现为病毒2，而非病毒1遗传物质是核酸（RNA）而非蛋白质十二五十二五“职业教育国家规划教材职业教育国家规划教材 1、细胞水平 2、细胞核水平 ：遗传物质存在于

15、细胞核和核区。另外存在核外染色体，如真核生物细胞质基因（线粒体，叶绿体）；和原核生物的质粒。 3、染色体水平：核内DNA与组蛋白结合在一起形成一种在光学显微镜能见的核染色体。一个细胞中含有一套染色体称为单倍体；一个细胞中含有两套相同的染色体称为双倍体。三、遗传物质在微生物细胞内存在的部位和方式十二五十二五“职业教育国家规划教材职业教育国家规划教材4、核酸水平 核酸类型： DNA、 RNA DNA结构：高分子化合物，分子量从几万到百亿，双螺旋结构，由四种核苷酸（AMP、GMP、TMP、CMP）组成。每个核苷酸均有环状碱基、脱氧核糖和磷酸根三种组分。DNA长度即基因组大小一般以碱基对bp（ bas

16、e pair）作单位。RNA结构： RNA结构与DNA，只是尿嘧啶（U） 代替了胸腺嘧啶（T）核酸的复制：半保留复制十二五十二五“职业教育国家规划教材职业教育国家规划教材 5、基因水平：基因是生物体人一切具有自主复制能力的最小功能单位。其物质基础是一条直线排列、具有特定核苷酸序列的核酸片断。 6、密码子水平：遗传密码是指DNA链上决定各具体氨基酸的特定核苷酸排列顺序。遗传密码的信息单位是密码子，每个密码子由3个核苷酸序列（1个三联体）所组成 7、核苷酸水平：四种脱氧核苷酸（腺苷酸AMP,鸟苷酸GMP,胸苷酸TMP,胞苷酸CMP)十二五十二五“职业教育国家规划教材职业教育国家规划教材四、朊病毒的

17、发现与思考 元病毒含有微量的核酸，仍未发现？ 元病毒仅由蛋白质构成 元病毒的遗传物质为蛋白质？十二五十二五“职业教育国家规划教材职业教育国家规划教材四、朊病毒的发现与思考亚病毒的一种：具有传染性的蛋白质致病因子，迄今为止尚未发现该蛋白内含有核酸。其致病作用是由于动物体内正常的蛋白质PrP c改变折叠状态为PrP sc所致，而这二种蛋白质的一级结构并没有改变。十二五十二五“职业教育国家规划教材职业教育国家规划教材人的库鲁病(kuru)、克雅氏病(Creutzfeldt Jakob disease, CJD)等羊搔痒症(scrapie)牛海绵状脑病(spongiform encephalopath

18、y)十二五十二五“职业教育国家规划教材职业教育国家规划教材引起人与动物的致死性中枢神经系统疾病十二五十二五“职业教育国家规划教材职业教育国家规划教材Prusiner (1982)提出羊搔痒病因子是一种蛋白质侵染颗粒（proteinaceous infectious particle），并将之称做Prion或Virino。 -朊病毒1997年，Stanley B. Prusiner荣获诺贝尔奖十二五十二五“职业教育国家规划教材职业教育国家规划教材1）蛋白质是否可以作为遗传物质？ prion是生命的一个特例？还是仅仅为表达调控 的一种形式？2）蛋白质折叠与功能的关系，是否存在折叠密码？DNARNA

19、RNA肽链肽链蛋白质蛋白质十二五十二五“职业教育国家规划教材职业教育国家规划教材l凡把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子间的重新组合，形成新遗传型个体的方式，称为基因重组（gene recombination）或遗传重组。 l作用：重组可使生物体在未发生突变的情况下，也能产生新遗传型的个体。 第三节 原核微生物的基因重组十二五十二五“职业教育国家规划教材职业教育国家规划教材第二节 原核微生物的遗传物质传递的方式 受体菌直接吸收来自供体菌的游离受体菌直接吸收来自供体菌的游离DNADNA片段，并把它整片段，并把它整合到自己的基因组中，而获得部分新的遗传性状的基因转合到自己的基因组

20、中，而获得部分新的遗传性状的基因转移过程，称为转化。移过程，称为转化。 转化后的的受体菌称为转化子（转化后的的受体菌称为转化子（transformant）。）。 来自供体菌的来自供体菌的DNA片段称为转化因子片段称为转化因子十二五十二五“职业教育国家规划教材职业教育国家规划教材十二五十二五“职业教育国家规划教材职业教育国家规划教材2、转导（transduction） 以噬菌体为媒介，将供体菌的一部分遗传物质导入受体菌，使受体菌的遗传性状发生变异。 获得新遗传性状的受体细胞称为转导子（transductant）。 转导过程不需要细胞接触，而是以噬菌体为载体 。十二五十二五“职业教育国家规划教材职

21、业教育国家规划教材十二五十二五“职业教育国家规划教材职业教育国家规划教材3 接合(conjugation） 通过供体菌与受体菌直接接触，传递遗传物质，使受体菌获得供体菌的遗传性状的现象，称为接合。 通过接合而获得新性状的受体细胞就是接合子（conjugant）。 十二五十二五“职业教育国家规划教材职业教育国家规划教材十二五十二五“职业教育国家规划教材职业教育国家规划教材4、溶源性转变l当温和噬菌体感染宿主而使其发生溶源化时，因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上，而使后者获得新性状的现象，称为溶源转变。 l性质：表面上与转导相似，而本质上不同于转导。 十二五十二五“职业教育国家规划教材职业教育国家规划教材与转导的区别： 1、当宿主丧失其原噬菌体时，通过溶源转变而获得的新性状也随之消失。 2、温和噬菌体不携带来自供体菌的外源基因，是噬菌体自身基因使宿主获得新性状。 3、获得新性状的是溶源化的宿主细胞，不是转导子。十二五