如何从动物肝脏中提取一种酶ppt课件

1、设计实验报告 1103018 宋 跃1103019 胡嘉健1103020 刘炫邑1103021 石雨晴 Experimental design report一，如何正确设计从生物样品中分别纯化生物大分子的道路和正确的设计方案？二，案例实验：从动物肝组织样品中分别提取纯化鉴定一种酶如何正确设计从生物样品中分别纯化生物大分子的道路和正确的设计方案？ 1，确定生物大分子的种类2，查阅文献资料确定生物大分子的性质例如，分子量，等电点，沉降细数溶解度，耐热性等3，查阅分别纯化鉴定的方法以及其各有何特点和适用范围4，根据所测生物大分子的知条件和实践情况选择适宜的分别纯化方法5，根据选取的方法设计实验详细步

2、骤1，正确选材 总的来说，资料选择应遵照的原那么是：有效成分含量多，稳定性好；来源丰富、坚持新颖；提取容易、工艺简单；杂质有综合利用价值。2，资料预处置 及时运用防止有效成分丧失，否那么应及时冰冻或枯燥储存，同时把易于除去的非需求物质如脂质除去。3，初分 根据目的大分子的性质确定初分方法，保证回收率高。4，纯化 按照先选用粗放、快速、有利于减少样品体积和后工序处置的方法，后选择准确、费时和需样品量少的方法的原那么确定分别方法的排布顺序。5，鉴定 用于鉴定性质和含量的方法有：光谱法、气候层析法和生物芯片法等。用于鉴定生物样品纯度的方法有：电泳法、免疫分析。 根据实验目确实定鉴定方法，操作务必准确

3、，尽量防止目的物质的流失案例实验：从动物肝组织样品中分别提取纯化鉴定一种酶实验目的：1，掌握从肝细胞中分别提取纯化鉴定某种酶的实验方法 2，培育灵敏选择并综合运用各种生物实验方法的才干3， 培育探求精神及团队协作认识 一，资料预处置1，因动物肝脏中的酶往往结合较多的脂质、核酸的物质，所以取饥饿24小时的动物肝脏为实验资料。2，由于细胞膜的半透膜性质，将细胞置于低渗溶液中，细胞易胀破，经过搅碎研磨可以得到细胞质中的胞液以及细胞核等各种细胞器和少量的细胞器碎片。3，由于目前未知该酶的详细位置，因此对胞液，细胞核和线粒体应该分开研讨，使得提取物中杂质尽量减少。实验原理 实验原理 实验原理 实验原理

4、五，离子交换柱层析(Ion exchange column chromatography )，按照可交换离子的类型分为阳离子交换柱色谱法和阴离子交换柱色谱法。根据物质酸碱性、极性等差别，经过离子间的吸附和解吸而将电解质各组分分开。在离子交换过程中，可以将杂蛋白选择性地结合到离子交换剂上，其他蛋白存在于过柱液中;或将欲分别蛋白选择性地结合到离子交换剂上，杂蛋白存在于过柱液中;或几种带同性电荷的蛋白均结合到交换剂上，利用其结合的结实程度不同(即带电荷的数目不同)，静电引力不同，分步洗脱下来，到达分别的目的。实验原理 六，脱盐经过各种纯化手段提取的蛋白质溶液经常含有较高的盐离子浓度，需求将多余的盐离

5、子去除，称为蛋白质的脱盐，脱盐的主要方法有透析法，超滤法，凝胶过滤法等。实验原理 七，SDS电泳(SDS electrophoresis )该方法中，由于该蛋白质有三个大小不同的亚基，所以将会构成三条不同的区带。到达了实验鉴定的目的。SDS-PAGE：运用阴离子去污剂十二烷基硫酸钠，先将蛋白质大分子变性，并与其蛋白质分子结合构成带负电荷蛋白质-SDS复合体沿着以聚丙烯酰胺凝胶构成的分子筛向电场的正极方向挪动，从而将蛋白质根据它们分子量的大小而分开。由于小分子量的蛋白质挪动速度大于分子量较大的，所以在垂直凝胶中其蛋白质分子量由上至下递减。实验原理 实验步骤实验取材因动物肝脏中的酶往往结合较多的脂

6、质、核酸的物质，所以取饥饿24小时的动物肝脏为实验资料。细胞破碎细胞破碎参与蛋白质抑制剂，防止蛋白酶参与蛋白质抑制剂，防止蛋白酶水解作用常用的丝氨酸蛋白酶水解作用常用的丝氨酸蛋白酶抑制剂有苯甲基磺酰氟抑制剂有苯甲基磺酰氟PMSF、二异丙基氟磷酸；、二异丙基氟磷酸；金属蛋白酶抑制剂有金属蛋白酶抑制剂有EDTA和和EGTA乙二醇四乙酸乙二醇四乙酸 除核酸：除核酸：普通微生物和植物的粗酶液中有普通微生物和植物的粗酶液中有大量的核酸污染。除核酸的常用大量的核酸污染。除核酸的常用方法是沉淀法，沉淀剂的选择需方法是沉淀法，沉淀剂的选择需求大量的实验来选定，知的有求大量的实验来选定，知的有1%2%的链霉素硫

7、酸盐、溶菌的链霉素硫酸盐、溶菌酶等。酶等。破碎方法：机械研磨破碎方法：机械研磨将剪碎的兔肝置于研钵中用将剪碎的兔肝置于研钵中用研磨棒研碎，参与一定的研磨棒研碎，参与一定的石英可提高研磨效果也可石英可提高研磨效果也可用匀浆器进展匀浆，参与低用匀浆器进展匀浆，参与低渗溶液。运用差速离心法在渗溶液。运用差速离心法在1600r/min 离心机中离心得离心机中离心得到上清一和沉淀一。将沉淀到上清一和沉淀一。将沉淀参与一定浓度蔗糖溶液后在参与一定浓度蔗糖溶液后在3500r/min离心机离心得到上离心机离心得到上清二和沉淀二细胞核。清二和沉淀二细胞核。将上清一二混合，取少量上将上清一二混合，取少量上清液在清

8、液在6600r/min离心机中离离心机中离心得到沉淀三是线粒体，弃心得到沉淀三是线粒体，弃去上清液微粒体与溶酶体去上清液微粒体与溶酶体最后得到上清液为胞液，沉最后得到上清液为胞液，沉淀二为细胞核，沉淀三为线淀二为细胞核，沉淀三为线粒体粒体以下步骤分别对三部分进展以下步骤分别对三部分进展操作操作酶的分别提取酶的分别提取盐溶液提取适用于大多数酶。盐溶液提取适用于大多数酶。 用用0.02mol/L磷酸盐缓冲液提取线粒体和磷酸盐缓冲液提取线粒体和细胞核中的酶细胞核中的酶一，初分，盐析一，初分，盐析运用饱和硫酸铵以一定的恰当比例，使蛋运用饱和硫酸铵以一定的恰当比例，使蛋白质析出，视详细情况经过过滤和离心

9、的白质析出，视详细情况经过过滤和离心的方法沉淀分别出来，得到的沉淀即为蛋白方法沉淀分别出来，得到的沉淀即为蛋白质质等电点沉淀法等电点沉淀法将上一步得到的沉淀溶解在将上一步得到的沉淀溶解在ph为为6.2的缓的缓冲液中，离心后得到上清液和沉淀，冲液中，离心后得到上清液和沉淀，弃去上清，沉淀即为一切弃去上清，沉淀即为一切pI为为6.2的蛋白质的蛋白质二，精分，离子交换柱层析法二，精分，离子交换柱层析法利用利用DEAE纤维素为作为纤维素为作为阴离子交换剂，带有正电荷可以吸附带有阴离子交换剂，带有正电荷可以吸附带有负电荷的蛋白质负电荷的蛋白质DEAE预处置，装柱，平衡样品上样与洗预处置，装柱，平衡样品上

10、样与洗脱搜集得到相对纯真的蛋白质脱搜集得到相对纯真的蛋白质利用利用CM-纤维素纤维素ph为为5.0作为阳离子作为阳离子交换剂，吸附带正电荷的酶交换剂，吸附带正电荷的酶DEAE的再生与保管的再生与保管实验步骤如何使线粒体和细胞核破碎？脱盐，运用透析袋脱盐脱盐，运用透析袋脱盐SDS电泳，电泳，1，制备待测蛋白质样品：，制备待测蛋白质样品：2，垂直板状聚丙烯酰胺凝胶的灌制：垂直板状聚丙烯酰胺凝胶的灌制：3，加，加样：样：4，电泳：，电泳：5，剥胶：，剥胶：6，染色和褪色。，染色和褪色。实验步骤实验结果：察看脱色后凝胶中的蛋白质区带，假设被测蛋白质样品分别纯化的好，纯度高，应出现三条区带，假设在同一凝