分子生物学的研究方法DNA蛋白质相互作用ppt课件

1、西北师范大学西北师范大学 第五章第五章 分子生物学研究的主要方法分子生物学研究的主要方法-生命科学院生命科学院第六节第六节 研讨研讨DNADNA与蛋白质相互作用的方法与蛋白质相互作用的方法又叫做DNA迁移率变动实验，是80年代初出现的用于在体外研讨DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。简单、快捷，是当前被选作分别纯化特定DNA结合蛋白质的一种典型的实验方法。在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的DNA朝正电极挪动的间隔是同其分子量的对数成反比，假设DNA分子结合上一种蛋白质，那么由于分子量加大，在凝胶中的迁移作用便会遭到阻滞，朝正电极挪动的间隔也就相在缩短了。所以当特定的DNA片段同细

2、胞提取物混合之后，假设其在凝胶电泳中的挪动间隔变小了，这就阐明它已同提取物中的某种特殊蛋白质分子发生了结协作用。2.6.1 2.6.1 凝胶阻滞实验凝胶阻滞实验原理原理前往目录前往第二章西北师范大学西北师范大学 第五章第五章 分子生物学研究的主要方法分子生物学研究的主要方法-生命科学院生命科学院凝胶阻滞实验方法首先是用放射性同位素标志待检测的DNA片段亦称探针DNA，然后同细胞蛋白质提取物一道温育，于是便有能够构成DNA一蛋白质复合物。将它加样到非变性的凝胶中，在控制使蛋白质仍与DNA坚持结合形状的条件下进展电泳分别，并运用放射自显影技术显现具放射性标志的DNA条带位置。假设细胞层白质提取物中

3、不存在可同放射性标志的探针DNA结合的蛋白质，那么一切放射性标己都将集中出如今凝胶的底部；反之，将会构成DNA一蛋白质复合物，由于凝胶阻滞的缘故，其特有的放射性标志的探针DNA条带就将滞后出如今较接近凝胶顶部的位置。所以有的文献中也称这种实验为条带阻滞实验band retardation assay。 西北师范大学西北师范大学 第五章第五章 分子生物学研究的主要方法分子生物学研究的主要方法-生命科学院生命科学院西北师范大学西北师范大学 第五章第五章 分子生物学研究的主要方法分子生物学研究的主要方法-生命科学院生命科学院凝胶阻滞实验用途鉴定特殊细胞提取物中，能否存在可同放射性标志的探针DNA结合

4、的蛋白质分子比如特异的转录因子等研讨发生此种结协作用之准确的DNA序列的特异性：其方法是在DNA一蛋白质结合反响体系中，参与超量的非标志竞争DNA。假设竞争同一种蛋白，由于竞争DNA与探针DNA相比是极大超量的，绝大部分蛋白质都会被其竞争结合掉而使探针DNA处于自在形状，自显影图片上不出现阻滞的条带，相反，假设不竞争同一蛋白，探针DNA仍与特定蛋白复合，呈现阻滞的条带。运用竞争DNA，可间接阐明体内的DNA与蛋白质的相互作用。如，运用一种具有与知转录因子结合位点的竞争DNA，就可以判别检测到的蛋白质能否属于此类转录因子，或是与之相关的其它转录因子；假设事先引入突变，可以检测突变对其与转录因子结

5、协作用的影响。西北师范大学西北师范大学 第五章第五章 分子生物学研究的主要方法分子生物学研究的主要方法-生命科学院生命科学院西北师范大学西北师范大学 第五章第五章 分子生物学研究的主要方法分子生物学研究的主要方法-生命科学院生命科学院2.6.2 DNasel脚印实验虽然凝胶阻滞实验可以提示出在体内发生的DNA蛋白质之间相互作用的有关信息，然而它却无法确定两者结合的准确部位。要解答这个问题，那么需求运用 DNasel脚印实验footprinting assay。它是一类用于检测与特定蛋白质结合的DNA序列的部位及特性的专门的实验技术。 西北师范大学西北师范大学 第五章第五章 分子生物学研究的主要

6、方法分子生物学研究的主要方法-生命科学院生命科学院DNasel脚印实验过程p首先是将待检测的双链DNA分子用32P作末端标志，并用限制酶去掉其中的一个末端，得到只一条链单末端标志的双链DNA分子p体外同细胞蛋白质提取物混合。待二者结合之后，再参与少量的 DNasel它可沿着靶 DNA作随机单链切割消化DNA分子，并控制酶的用量使之到达平均每条链只发生一次磷酸二脂键的断裂。假设蛋白质提取物中不存在与DNA结合的特异蛋白质，经DNasel消化之后便会产生出距放射性标志末端1个核苷酸、2个核苷酸、3个核苷酸等一系列前后长度均仅相差一个核苷酸的、不延续的、延续的DNA片段梯度群体。西北师范大学西北师范

7、大学 第五章第五章 分子生物学研究的主要方法分子生物学研究的主要方法-生命科学院生命科学院p从此混合物中除去蛋白质之后，将DNA片段群体加样在变性的DNA测序凝胶中进展电泳分别，经放射自显影，便可显现出相应于DNasel切割产生的不同长度DNA片段组成的序列梯度条带。但是，假设有一种蛋白质曾经结合到DNA分子的某一特定区段上，那么它就将维护这一区段的DNA免受DNasel的消化作用，因此也就不能够产生出相应长度的切割条带。所以在电泳凝胶的放射自显影图片上，相应于蛋白质结合的部位是没有放射标志条带的，出现了一个空白的区域，人们笼统地称之为“脚印 。西北师范大学西北师范大学 第五章第五章 分子生物

8、学研究的主要方法分子生物学研究的主要方法-生命科学院生命科学院西北师范大学西北师范大学 第五章第五章 分子生物学研究的主要方法分子生物学研究的主要方法-生命科学院生命科学院脚印实验的优点可以笼统地展现出一种特殊的蛋白质因子同特定DNA片段之间的结合区域。假设运用较大的DNA片段，经过脚印实验便可确定其中不同的核苷酸序列与不同蛋白质因子之间的结合位点的分布情况。好像凝胶阻滞实验一样，也可以参与非标志竞争DNA，来消除特定的脚印，据此确定其核酸序列的特异性。 西北师范大学西北师范大学 第五章第五章 分子生物学研究的主要方法分子生物学研究的主要方法-生命科学院生命科学院DNasel脚印实验开展 目前

9、还出了假设干种其它类型的脚印实验。例如，自在羟基脚印实验及菲咯琳铜脚印实验等。其中最有趣的是硫酸二甲脂DMS脚印实验。它所根据的原理是，DMS可以促进DNA中裸露的G甲基化，而六氢吡啶又会对甲基化的G残基作特异的化学切割。假设有一种蛋白质同DNA分子中的某一区段结合，在它的维护下，区域内的G免受六氢吡啶的切割，于是在DNA片段的序列梯中，便不存在具这些G残基末端的DNA片段，故出现个空白区域，此即通常所说的脚印。 与其它脚印实验不同，由于DMS脚印实验中被切割的是G残基，因此可用来鉴定同转录因子蛋白质结合的DNA区段中的特异碱基。 西北师范大学西北师范大学 第五章第五章 分子生物学研究的主要方

10、法分子生物学研究的主要方法-生命科学院生命科学院2.6.3 甲基化干扰实验运用甲基化干扰实验methvlation interference assay技术，可以检测靶DNA中特异G残基的优先甲基化对尔后的蛋白质结协作用终究会有什么效应，从而更加详细地提示DNA与蛋白质之间相互作用的方式。 西北师范大学西北师范大学 第五章第五章 分子生物学研究的主要方法分子生物学研究的主要方法-生命科学院生命科学院甲基化干扰实验的详细操作先用硫酸二甲脂DMS处置靶DNA，控制反响条件，使平均每条DNA分子只需一个G甲基化，而后将这些部分甲基化的DNA群体同含有DNA结合蛋白的适当的细胞提取物一道温育，并作凝胶

11、阻滞实验。经电泳分别之后，从凝胶中切取出具有结合蛋白质的DNA条带和没有结合蛋白质的DNA条带，并用六氢吡啶处置之，于是甲基化的G残基被切割，非甲基化的G残基那么不被切割。显而易见，假设某个G因甲基化而不与蛋白质结合，那么六氢吡啶对这个甲基化G残基的切割作用，就只能在没有同蛋白质结合的DNA分子上表现出来。相反地，假设一个特殊的G残基在DNA与蛋白质的结合中不起作用，那么六氢吡啶对这个G残基的切割作用，那么在同蛋白质结合的DNA分子及不同蛋白质结合的DNA分子中均可察看到图244 西北师范大学西北师范大学 第五章第五章 分子生物学研究的主要方法分子生物学研究的主要方法-生命科学院生命科学院西北

12、师范大学西北师范大学 第五章第五章 分子生物学研究的主要方法分子生物学研究的主要方法-生命科学院生命科学院甲基化干扰实验的用途甲基化干扰实验不仅可以用来研讨蛋白质与G残基之间的联络，而且同样也可以用来研讨DNA结合蛋白质与结合位点中的腺嘌呤A残基之间的联络作用。头一个方法是使一切的嘌呤残基甲基化，以便同时研讨甲基化的G和A残基对蛋白质与DNA结合的干扰效应。第二种方法是运用焦碳酸二乙脂DEPC特异性修饰A，而使之易受六氢吡啶的切割作用。对于研讨诸如像具有相对少数G残基的八聚体基序例如 OCt1，OCt2等，它们可与八聚体结合蛋白质结合这样的序列而言，这些甲基化干扰实验技术具有特别的价值，由于只

13、需研讨G残基的甲基化干扰，就可获得有用的信息。 西北师范大学西北师范大学 第五章第五章 分子生物学研究的主要方法分子生物学研究的主要方法-生命科学院生命科学院DMS化学干扰的主要局限性它只能使G和A残基甲基化，而不能使T和C残基甲基化。虽然如此，它仍不愧为脚印实验的一种有效的补充手段，可以鉴定脚印区段中DNA与蛋白质相互作用的准确位置。 西北师范大学西北师范大学 第五章第五章 分子生物学研究的主要方法分子生物学研究的主要方法-生命科学院生命科学院2.6.4 体内脚印实验上面所讨论的这三种方法有一个共同的缺乏之处，即它们都是在体外进展的实验。因此人们自然会问，这些结果可以确切地反映活细胞内发生的

14、DNA一蛋白质相互作用的真实情况吗？为了解答这个问题，科学任务者又设计出了一种体内脚印实验体系。然而究其本质而言，这种技术无非是体外DMS脚印实验的一个变种而已。 西北师范大学西北师范大学 第五章第五章 分子生物学研究的主要方法分子生物学研究的主要方法-生命科学院生命科学院体内脚印实验的方法用有限数量的化学试剂DMS处置完好的游离细胞，并使其浸透到细胞内的浓度恰好导致天然染色质DNA中的G残基发生甲多化。而后从这些细胞中提取DNA，并参与六氢吡啶作体外消化。结果情况就好像体外脚印实验一样，能同某种特殊蛋白质因子结合的DNA区段，其上的G残基就不会被DMS甲基化，因此也就不会被六氢吡啶所切割。因

15、此，同对照的体外裸露DNA所构成的序列梯比较，就会发现由完好的活细胞染色质DNA构成的序列梯中，短少了G残基没有被切割的相应条带图245。 西北师范大学西北师范大学 第五章第五章 分子生物学研究的主要方法分子生物学研究的主要方法-生命科学院生命科学院西北师范大学西北师范大学 第五章第五章 分子生物学研究的主要方法分子生物学研究的主要方法-生命科学院生命科学院体内脚印实验优缺陷显而易见，与运用克隆DNA片段所作的体外脚印实验的结果相比，经体内脚印实验从染色质总DNA中所获得的任何一种特异DNA的数量，都是微缺乏道的。因此，有必要经过PCR扩增特异的靶DNA，以获得足够数量的DNA样品。如今体内脚印实验已开展成为研讨在完好的活细胞内，DNA一蛋白质结合位点及检测结合位点中碱基突变效应的一种极有效的手段。 西北师范大学西北师范大学 第五章第五章 分子生物学研究的主要方法分子生物学研究的主要方法-生命科学院生命科学院运用凝胶阻滞实验、DNasel脚印实验、甲基化干扰实验，以及体内脚印实验等多种用于研讨DNA与蛋白质相互作用的根本实验手段，将有助于深化地讨论基因启动子元件的构造与功能，及其与蛋白质转录因子之间相互作用的有关细节；提示mRNA转录超始和终止的分子本质与主要步骤；阐明在发育过程中基因表达调理的时空特异性；以及外源基因在转基因植株中表达的分子机理，等等。这些研讨结