第十三章-酶类药物的分析

1、1酶类药物的分析酶类药物的分析第一节第一节 概述概述第二节第二节 酶类药物的鉴别与检查酶类药物的鉴别与检查第三节第三节 酶活力测定方法酶活力测定方法第四节第四节 酶活力测定方法设计酶活力测定方法设计第五节第五节 典型酶类药物的检测典型酶类药物的检测2第一节第一节 概述概述n在生物体内，酶能降低生化反应在生物体内，酶能降低生化反应活化能活化能，加快可逆，加快可逆反应的进行速度，使之尽快达到平衡。反应的进行速度，使之尽快达到平衡。n一、酶的特性一、酶的特性n二、酶的分类二、酶的分类n三、酶的化学组成三、酶的化学组成n四、酶的催化反应机制四、酶的催化反应机制n五、酶催化反应动力学五、酶催化反应动力学

2、3一、酶的特性一、酶的特性 1酶是高效催化剂。酶是高效催化剂。 n2酶对底物的结构具有严格的选择性。酶对底物的结构具有严格的选择性。 n（1）相对专一性：）相对专一性：n（2）绝对专一性）绝对专一性:n（3）立体异构专一性）立体异构专一性:n3酶催化反应的反应条件温和。酶催化反应的反应条件温和。n4酶的催化活性在生物体内受多种因素的调节酶的催化活性在生物体内受多种因素的调节。4二、酶的分类二、酶的分类n氧化还原酶氧化还原酶n转移酶转移酶n水解酶水解酶n裂合酶裂合酶n异构酶异构酶n合成酶（或称连接酶）合成酶（或称连接酶）5三、酶的化学组成三、酶的化学组成 n分为分为简单酶和结合酶简单酶和结合酶两

3、大类。两大类。n结合酶类中除含有蛋白外，还含有某种热稳定结合酶类中除含有蛋白外，还含有某种热稳定的非蛋白质的小分子物质，二者结合起来，称的非蛋白质的小分子物质，二者结合起来，称为为“全酶全酶”，才呈现生物催化活性。，才呈现生物催化活性。n结合酶结合酶 = 酶蛋白酶蛋白 + 辅助因子辅助因子6四、酶的催化反应机制四、酶的催化反应机制 n1酶酶-底物复合物的形成底物复合物的形成 在酶促反应中，反应在酶促反应中，反应底物首先与酶分子上活性部位结合，形成底物首先与酶分子上活性部位结合，形成酶酶-底底物复合物物复合物，降低反应的，降低反应的活性能活性能，使酶促反应顺，使酶促反应顺利进行。利进行。n2酶酶

4、-底物复合物加速反应速率的原因底物复合物加速反应速率的原因n（1）定向作用与底物浓缩）定向作用与底物浓缩 n（2）酶使底物分子变形）酶使底物分子变形 n（3）酸碱催化）酸碱催化n（4）共价催化）共价催化 。7五、酶催化反应动力学五、酶催化反应动力学 n酶的活力单位酶的活力单位 酶活性单位（酶活性单位（U）是酶活性是酶活性高低的一种量度，用高低的一种量度，用U/g或或U/ml表示。表示。n酶活力单位定义：在规定的条件下，每分酶活力单位定义：在规定的条件下，每分钟能转化钟能转化1mol底物所需要的酶量，称一底物所需要的酶量，称一个酶的活力单位。个酶的活力单位。n酶的比活力酶的比活力 每毫克酶蛋白所

5、含酶活力，每毫克酶蛋白所含酶活力，U/mg。 8Michaelis-MentenMichaelis-Menten快速平衡学说快速平衡学说n底物浓度的增加，反应底物浓度的增加，反应速度上升呈速度上升呈双曲线双曲线。n在在低底物浓度低底物浓度时，反应时，反应速度呈直线上升，表现速度呈直线上升，表现为为一级反应一级反应。n在高浓度时，反应速度在高浓度时，反应速度达到一个极限值，呈现达到一个极限值，呈现零级反应零级反应。9米氏方程米氏方程n酶反应动力学方程式：酶反应动力学方程式：nV反应初速度反应初速度nVm最大反应速度最大反应速度nKs 米氏常数，米氏常数，Ks=K1/K1， Ks为为ES的解离常数

6、，的解离常数，表示酶与底物的亲和力表示酶与底物的亲和力。nKs为反应速度为反应速度V是最大反应速度是最大反应速度Vm一半时所需底物浓一半时所需底物浓度，即度，即V=1/2 Vm时，时，Ks=S。10Briggs-Haldane稳态学说稳态学说 nES的形成速度与的形成速度与ES的解离速度相等，达到的解离速度相等，达到动态平动态平衡衡，即，即“稳态稳态”，反应方程式：，反应方程式：nKm取代了取代了Ks，当当V=1/2 Vm时，时，Km=S。nKm也可表示为底物与酶的亲和力。也可表示为底物与酶的亲和力。11第二节第二节 酶类药物的鉴别与检查酶类药物的鉴别与检查n鉴别方法常用鉴别方法常用蛋白质鉴别

7、方法蛋白质鉴别方法，如在碱性条件，如在碱性条件下的双缩脲反应。下的双缩脲反应。n专用于酶的鉴别方法：专用于酶的鉴别方法：n 酶活性试验：与特异性底物反应（酶活性试验：与特异性底物反应（胰蛋白酶胰蛋白酶）。）。n 沉淀试验沉淀试验：胃蛋白酶胃蛋白酶n 动物试验：动物试验：透明质酸酶透明质酸酶水解粘多糖。水解粘多糖。 12酶类药物的检查酶类药物的检查 n酶类药物是生化产品和微生物发酵产品，在酶类药物是生化产品和微生物发酵产品，在生产过程中可能带入微量的生产过程中可能带入微量的脂肪类物质、其脂肪类物质、其他的酶类和大分子杂质他的酶类和大分子杂质，影响酶质量，需有，影响酶质量，需有含量限度。含量限度。

8、13酶类药物的检查酶类药物的检查n（一）脂肪含量限度检查一）脂肪含量限度检查n检查方法，乙醚浸提，干燥检查方法，乙醚浸提，干燥，精密称定，脂肪精密称定，脂肪不得过规定的含量不得过规定的含量。n（二）其他酶类含量限度检查二）其他酶类含量限度检查n胰蛋白酶、糜蛋白酶均是从牛、猪的胰脏中提胰蛋白酶、糜蛋白酶均是从牛、猪的胰脏中提取的蛋白分解酶。取的蛋白分解酶。提取胰蛋白酶时又易带入微提取胰蛋白酶时又易带入微量的糜蛋白酶量的糜蛋白酶。n（三）大分子活性物质含量限度检查（三）大分子活性物质含量限度检查14胰蛋白酶制品中糜蛋白酶的含量胰蛋白酶制品中糜蛋白酶的含量n每每2500U胰蛋白酶中不得多于胰蛋白酶中

9、不得多于50U的糜蛋白酶。的糜蛋白酶。n糜蛋白酶专属水解糜蛋白酶专属水解芳香氨基酸芳香氨基酸（L-酪氨酸、酪氨酸、L-苯丙氨酸）苯丙氨酸）的羧基形成的肽键、酰胺键和酯键的羧基形成的肽键、酰胺键和酯键。n用用N-乙酰乙酰-L-酪氨酸乙酯酪氨酸乙酯（N-Acetyl-L-Tyrosine Ethylester，ATEE）作底物，通过作底物，通过分光光度法测定此分光光度法测定此酶对底物的水解速率酶对底物的水解速率来检查来检查该酶的含量限度。该酶的含量限度。15第三节第三节 酶活力测定方法酶活力测定方法n固定时间法固定时间法 n连续监测法连续监测法 n （一）、需（一）、需NAD+或或NADP+作指示

10、的连续监测法：作指示的连续监测法：n 直接测定法直接测定法 n 偶联法偶联法n 三联酶活测定三联酶活测定n （二）、不需（二）、不需NAD+或或NADP+作指示的连续监测法：作指示的连续监测法：n固定浓度法固定浓度法 16一、固定时间法一、固定时间法 n在适宜的条件下，使酶和底物共同保温在适宜的条件下，使酶和底物共同保温一定一定时间时间，然后测定，然后测定产物生成的量产物生成的量或或底物消耗的底物消耗的量量从而间接推算出酶的含量（或活力）。从而间接推算出酶的含量（或活力）。n nE表示酶浓度，表示酶浓度，P为反应产物浓度，为反应产物浓度，t 表表示酶作用时间，示酶作用时间，K为常数。为常数。1

11、7注意事项注意事项n缺点：无法了解整个反应缺点：无法了解整个反应过程是否都是零级反应。过程是否都是零级反应。n注意事项：注意事项：n1、底物饱和、底物饱和n2、时间、时间18二、连续监测法二、连续监测法 n在酶反应过程中，在酶反应过程中，连续记录不同时间的底物消耗量连续记录不同时间的底物消耗量或产物生成量或产物生成量。 n（一）、需（一）、需NAD+或或NADP+作指示的连续监测法作指示的连续监测法n（二）、不需（二）、不需NAD+或或NADP+作指示的连续监测法作指示的连续监测法19（一）、需（一）、需NAD+或或NADP+作指示的连续监测法：作指示的连续监测法：n还原型辅酶（还原型辅酶（N

12、ADH和和NADPH）在在340nm处有处有紫外吸收紫外吸收，氧化型辅酶（，氧化型辅酶（NAD+和和NADP+）在在340nm处无紫外吸收处无紫外吸收.n利用利用340nm处每分钟处每分钟吸收度升高或降低的速率吸收度升高或降低的速率与与酶活性成正比的关系，推算出酶的活力单位。酶活性成正比的关系，推算出酶的活力单位。n包括：包括：n 直接测定法直接测定法 n 偶联法偶联法n 三联酶活测定三联酶活测定 20直接测定法直接测定法n大多数需大多数需NADH（NADPH）参加的脱氢酶，参加的脱氢酶，可利用紫外分光光度法可利用紫外分光光度法直接测定反应体系在直接测定反应体系在340nm处吸收度的变化处吸收

13、度的变化，计算酶活力单位。，计算酶活力单位。n丙酮酸丙酮酸NADHH+ 乳酸乳酸NAD+ n340nm处吸收度降低的速率处吸收度降低的速率与与NADH的氧化速的氧化速率成正比，率成正比，与与LDH的活力成正比的活力成正比。21偶联法偶联法n此类酶催化反应不需此类酶催化反应不需NAD+或或NADP+，但当与需但当与需NAD+或或NADP+的脱氢酶反应偶联的脱氢酶反应偶联以后，能用以后，能用紫外紫外分光光度法测定分光光度法测定. .n由脱氢酶引起的反应为由脱氢酶引起的反应为指示反应指示反应，脱氢酶是指示酶，脱氢酶是指示酶，指示酶活力要比测定酶活力至少大指示酶活力要比测定酶活力至少大100倍倍。n例

14、如：谷草转氨酶的测定：例如：谷草转氨酶的测定：22三联酶活测定三联酶活测定n引入一个辅助酶反应，将被测酶反应系统与指示酶反应系统联引入一个辅助酶反应，将被测酶反应系统与指示酶反应系统联系起来，组成一个系起来，组成一个“三合一三合一”酶反应系统酶反应系统，使底物转化率、辅，使底物转化率、辅助酶反应和助酶反应和NADH（NADPH）氧化速率之间成正比函数关系，氧化速率之间成正比函数关系，辅助酶和指示酶的活力必须大大超过测定酶活力辅助酶和指示酶的活力必须大大超过测定酶活力。n例如：磷酸肌酸例如：磷酸肌酸+ADP 肌酸肌酸ATP (1)n 葡萄糖葡萄糖ATP G-6-P ADP (2)nG-6-P +

15、 NADP+ 葡萄糖酸葡萄糖酸-6-磷酸磷酸 NADPH H+ (3)n(1) 被测反应，被测反应，(2)辅助反应，辅助反应，HK（己糖激酶）辅助酶，己糖激酶）辅助酶，(3) 指示反应，指示反应， G-6-PDH（6磷酸葡萄糖脱氢酶）指示酶。磷酸葡萄糖脱氢酶）指示酶。23（二）不需（二）不需NAD+或或NADP+指示的连续监指示的连续监测法：测法：n酶底物大多是人工合成的酶底物大多是人工合成的“色素元色素元”，其本，其本身无色，经身无色，经酶作用后释放出有色的反应产物酶作用后释放出有色的反应产物。根据反应过程中吸收度增高速率，算出酶活根据反应过程中吸收度增高速率，算出酶活力单位。力单位。n例如

16、：例如：n磷酸对硝基苯酚酯磷酸对硝基苯酚酯 对硝基苯酚对硝基苯酚24三、固定浓度法三、固定浓度法n根据酶催化反应，使根据酶催化反应，使反应产物反应产物达到额定的浓达到额定的浓度时其度时其反应时间与酶浓度成反比反应时间与酶浓度成反比的原理进行的原理进行设计的。设计的。n P=KEtn测定时间测定时间.n以所需时间的倒数（以所需时间的倒数（1/t）对酶浓度作图即对酶浓度作图即可制备标准曲线。可制备标准曲线。n优点：优点：1、记录时间。、记录时间。2、准确、准确25二、底物与产物的测定方法二、底物与产物的测定方法 （酶反应的检酶反应的检测方法测方法） 1、化学方法化学方法：用化学法测定其中某一底物或

17、产物的变化值。：用化学法测定其中某一底物或产物的变化值。n2、分光光度法分光光度法： 常用的有常用的有比色法比色法和和紫外分光光度法紫外分光光度法。n3、荧光测定法：荧光测定法： 简单、灵敏、快速简单、灵敏、快速。n4、电化学分析法电化学分析法n（1） 离子选择性电极分析法离子选择性电极分析法n（2） 微电流法微电流法n5、其他方法其他方法n如测定气体的测压法，测定产物旋光度变化值的旋光测定法。如测定气体的测压法，测定产物旋光度变化值的旋光测定法。26第五节第五节 酶类药物的检测酶类药物的检测 n肽键水解酶肽键水解酶 n 1、胰蛋白酶胰蛋白酶n 2、弹性蛋白酶弹性蛋白酶n 3、尿激酶尿激酶（气

18、泡上升法气泡上升法）n脂键水解酶脂键水解酶胰脂肪酶胰脂肪酶 n糖苷键水解酶糖苷键水解酶 溶菌酶溶菌酶n其它其它（超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶）27一、肽键水解酶一、肽键水解酶n1、胰蛋白酶、胰蛋白酶n2、弹性蛋白酶、弹性蛋白酶n3、尿激酶、尿激酶281、胰蛋白酶、胰蛋白酶比色法比色法n胰蛋白酶：由牛、羊、猪等胰蛋白酶：由牛、羊、猪等动物的胰脏中提取动物的胰脏中提取的一种蛋白水解酶的一种蛋白水解酶。n牛胰蛋白酶：牛胰蛋白酶：233个氨基酸，分子量个氨基酸，分子量24000，等电点等电点10.1。n猪胰蛋白酶：猪胰蛋白酶：214个氨基酸，分子量个氨基酸，分子量23400，等电点等电点10.8。n胰

19、蛋白酶最胰蛋白酶最适适pH为为7.68.0，电泳纯的胰蛋，电泳纯的胰蛋白酶的比活为白酶的比活为8000单位单位/mg。29原理原理n胰蛋白酶专一作用于赖氨酸、精氨酸等胰蛋白酶专一作用于赖氨酸、精氨酸等碱性氨基酸碱性氨基酸的羧的羧基组成的基组成的肽键、酰胺键及酯键肽键、酰胺键及酯键，水解速度为酯键，水解速度为酯键酰胺酰胺键键肽键。肽键。nBAEE(Benzoyl-L-Arginine-Ethyl-Ester)nBAA(Benzoyl-L-Arginine-Anide)n苯甲酰苯甲酰L精氨酸乙酯（精氨酸乙酯（BAEE）在胰蛋白酶的作用下，在胰蛋白酶的作用下，酯键被水解生成苯甲酰酯键被水解生成苯甲酰

20、L精氨酸，在精氨酸，在253nm波长处波长处的吸收度随酶促反应递增，根据活力单位定义计算酶活的吸收度随酶促反应递增，根据活力单位定义计算酶活力。力。30测定法：测定法：n取呈取呈直线的吸收度直线的吸收度，按下式计算：，按下式计算：nP为为每每mg供试中含胰蛋白酶的量供试中含胰蛋白酶的量，U；A1为直线上终止的吸收度；为直线上终止的吸收度；nA2为直线上开始的吸收度；为直线上开始的吸收度；nT为为A1至至A2读数的时间，读数的时间，min；nW为测定液中供试品的量，为测定液中供试品的量，mg；n吸收度每分钟改变吸收度每分钟改变0.003，即相当于，即相当于1个胰蛋白酶单位个胰蛋白酶单位 。31

21、2、胰胰弹性蛋白酶弹性蛋白酶n胰弹性蛋白酶：胰弹性蛋白酶：为肽链内断酶为肽链内断酶，存在于哺乳动，存在于哺乳动物胰脏。物胰脏。n弹性酶用于治疗高血脂症、动脉粥样硬化和脂弹性酶用于治疗高血脂症、动脉粥样硬化和脂肪肝。肪肝。n胰弹性蛋白酶是由胰弹性蛋白酶是由240个氨基酸组成的单一肽链，个氨基酸组成的单一肽链，有四对二硫键。分子量为有四对二硫键。分子量为25900，等电点等电点为为pH9.5。n胰弹性蛋白酶除水解弹性蛋白外，还可以水解胰弹性蛋白酶除水解弹性蛋白外，还可以水解血红蛋白、酪蛋白等蛋白。血红蛋白、酪蛋白等蛋白。n刚果红弹性蛋白刚果红弹性蛋白。32原理原理n刚果红弹性蛋白法刚果红弹性蛋白法

22、：以刚果红弹性蛋白为底物，由以刚果红弹性蛋白为底物，由于刚果红弹性蛋白酶结合的共价键能被弹性酶水解，于刚果红弹性蛋白酶结合的共价键能被弹性酶水解，根据根据刚果红在刚果红在495nm处有最大吸收，由标准曲线即可查处有最大吸收，由标准曲线即可查得弹性酶单位数。得弹性酶单位数。n单位：单位：20分钟水解分钟水解1mg刚果红弹性蛋白所需的酶量为刚果红弹性蛋白所需的酶量为一个弹性酶活力单位。一个弹性酶活力单位。33方法方法:n 343、尿激酶、尿激酶n由人尿中分离提纯后制得的一种碱性蛋白水解酶。由人尿中分离提纯后制得的一种碱性蛋白水解酶。n主要作用是激活人体内主要作用是激活人体内纤维蛋白溶解酶原纤维蛋白

23、溶解酶原使其成使其成为有为有活性的纤维蛋白溶酶活性的纤维蛋白溶酶，从而解聚血纤维蛋白，从而解聚血纤维蛋白，溶解血栓。溶解血栓。n天然尿激酶的分子量为天然尿激酶的分子量为54000，其作用于纤维蛋其作用于纤维蛋白溶解酶原的赖氨酸或精氨酸键使其裂解成纤维白溶解酶原的赖氨酸或精氨酸键使其裂解成纤维蛋白溶解酶蛋白溶解酶。35效价测定原理效价测定原理(气泡上升气泡上升法法)n尿激酶尿激酶激活人体内激活人体内纤维蛋白溶解酶原纤维蛋白溶解酶原使其转化成使其转化成纤维蛋白溶酶纤维蛋白溶酶；n纤维蛋白原纤维蛋白原在在凝血酶凝血酶的作用下，转变成的作用下，转变成纤维蛋白凝块纤维蛋白凝块，此凝块在，此凝块在纤维蛋纤

24、维蛋白溶酶白溶酶作用下，水解为可溶性小分子多肽。作用下，水解为可溶性小分子多肽。n在在纤维蛋白溶酶原纤维蛋白溶酶原过量的情况下，过量的情况下，尿激酶量尿激酶量与与纤维蛋白凝块的溶解时间纤维蛋白凝块的溶解时间的对数成直线关系。的对数成直线关系。36操作操作n试管中加试管中加纤维蛋白原溶液纤维蛋白原溶液0.3ml（37水浴）水浴）n标准品溶液标准品溶液1.0mln加混合溶液加混合溶液0.4mln立即摇匀计时，立即摇匀计时，反应系统应在反应系统应在3045秒内凝结秒内凝结，当当凝块内小气泡上升到系统体积一半时凝块内小气泡上升到系统体积一半时作为反应作为反应终点。终点。n以尿激酶的浓度为横坐标，以反应

25、时间的对数为以尿激酶的浓度为横坐标，以反应时间的对数为纵坐标纵坐标。37二、脂键水解酶二、脂键水解酶胰脂肪酶胰脂肪酶n胰脂肪酶是一种水解酶，在一定条件下把胰脂肪酶是一种水解酶，在一定条件下把甘甘油三脂类脂肪油三脂类脂肪逐步水解，最后生成逐步水解，最后生成甘油及相甘油及相应的脂肪酸应的脂肪酸。n底物底物:橄榄油橄榄油npH指示连续滴定法：稳定指示连续滴定法：稳定pH条件下避免因条件下避免因pH值改变而引起酶活力的改变。值改变而引起酶活力的改变。n用已知浓度的用已知浓度的标准碱溶液标准碱溶液滴定，可定量地测滴定，可定量地测定定脂肪酸脂肪酸的量，从而得知的量，从而得知脂肪酶脂肪酶活力活力。38测定测

26、定n 39计算计算n每分钟每分钟水解橄榄油水解橄榄油产生产生1mol脂肪酸脂肪酸的酶量，的酶量，为为1个活力单位。个活力单位。n每克含有的胰脂肪酶单位每克含有的胰脂肪酶单位nA:供试品消耗供试品消耗NaOH （0.1mol/L）的体积的体积nB:空白消耗空白消耗NaOH （0.1mol/L）的体积的体积nW:供试品取样量（供试品取样量（g）nN:供试品稀释倍数。供试品稀释倍数。40三、糖苷键水解酶三、糖苷键水解酶 溶菌酶溶菌酶n蛋清中提取的能蛋清中提取的能分解粘多糖的碱性水解酶分解粘多糖的碱性水解酶。n主要作用于革兰氏阳性菌，使胞壁中的肽聚糖主要作用于革兰氏阳性菌，使胞壁中的肽聚糖分解导致细菌

27、溶解。分解导致细菌溶解。n溶菌酶具有抗菌、抗病毒等作用。溶菌酶具有抗菌、抗病毒等作用。n溶菌酶分子量为溶菌酶分子量为1400015000，由，由129个氨基个氨基酸残基组成，等电点为酸残基组成，等电点为10.011.1。n溶菌酶属糖苷水解酶，能以某些细菌细胞中的溶菌酶属糖苷水解酶，能以某些细菌细胞中的多糖为底物。多糖为底物。41效价测定比浊法效价测定比浊法n以以溶酶小球菌溶酶小球菌为底物，主要成分为粘多糖，粘多为底物，主要成分为粘多糖，粘多糖由糖由NAG和和NAM重复而成。重复而成。n溶菌酶水解专属性强，它只能水解溶菌酶水解专属性强，它只能水解NAM C1 和和NAG C4之间之间的的1，4糖

28、苷键。糖苷键。n溶酶小球菌胞壁中的粘多糖经过溶菌酶的水解作溶酶小球菌胞壁中的粘多糖经过溶菌酶的水解作用后，菌体因渗透压不平衡，导致用后，菌体因渗透压不平衡，导致溶菌溶菌，溶液的，溶液的吸收度下降吸收度下降。n在一定的条件下，每分钟在一定的条件下，每分钟吸收度下降吸收度下降0.001为一为一个酶活力单位。个酶活力单位。42比浊法测定比浊法测定n计算：计算：n酶活力单位（酶活力单位（u/mg） =nW为测试液中供试品为测试液中供试品的重量（的重量（g）43比色法测定溶菌酶活性比色法测定溶菌酶活性 n用染料艳红用染料艳红K2BP标记的标记的M.Lysodeikticus为底物，酶催化细胞壁分解时游离

29、出染色碎片为底物，酶催化细胞壁分解时游离出染色碎片（产物）（产物）n反应后离心除去未分解底物，上清液比色，反应后离心除去未分解底物，上清液比色，吸吸收度为溶菌酶活力的函数收度为溶菌酶活力的函数。44溶菌酶效价测定比色法溶菌酶效价测定比色法n 45四、超氧化物歧化酶四、超氧化物歧化酶n由由哺乳动物红细胞哺乳动物红细胞分离而得的金属酶，能分离而得的金属酶，能催催化超氧化物游离基转化成过氧化氢和氧化超氧化物游离基转化成过氧化氢和氧。n来源于牛、猪、人红血球的超氧化物歧化酶来源于牛、猪、人红血球的超氧化物歧化酶（SOD）含铜和锌，分子量含铜和锌，分子量32000左右。左右。nSOD对热较稳定，对热较稳

30、定，在在pH5.39.5范围内对范围内对酶活性影响不大。酶活性影响不大。n牛红细胞牛红细胞SOD PI为为4.95。46效价测定效价测定nSOD测定方法：测定方法：n直接法：直接测定反应过程中直接法：直接测定反应过程中 O2- 的变化。的变化。n间接法：同时使用间接法：同时使用氧自由基指示清除剂氧自由基指示清除剂， SOD与指与指示剂清除剂竞争示剂清除剂竞争O2- ，从而抑制指示剂清除剂与从而抑制指示剂清除剂与O2- 的结合，根据的结合，根据指示剂清除剂与指示剂清除剂与O2- 反应速度的变化反应速度的变化可可间接测定间接测定SOD的活性。的活性。n间接法包括：间接法包括：黄嘌呤氧化酶细胞色素黄

31、嘌呤氧化酶细胞色素C法法和和联苯三联苯三酚法酚法。47黄嘌呤氧化酶细胞色素黄嘌呤氧化酶细胞色素C法法n原理：原理：在有氧条件下，黄嘌呤氧化酶能催化黄嘌呤成在有氧条件下，黄嘌呤氧化酶能催化黄嘌呤成尿酸，与此同时产生尿酸，与此同时产生O2- ，氧化型细胞色素氧化型细胞色素C被被O2- 还还原为还原型细胞色素原为还原型细胞色素C，后者在后者在550nm有最大吸收，因有最大吸收，因此测定氧化性细胞色素此测定氧化性细胞色素C在加入在加入SOD前后的光吸收变前后的光吸收变化可间接计算酶活性。化可间接计算酶活性。48方法方法n 49注意点注意点n在特定条件下，在特定条件下，25 （pH7.8）每分钟抑制细每

32、分钟抑制细胞色素胞色素C还原速率达还原速率达50所需要的酶量为一个活所需要的酶量为一个活力单位。力单位。n注意事项：注意事项：n重金属离子易使黄嘌呤氧化酶失活，因此反应体重金属离子易使黄嘌呤氧化酶失活，因此反应体系中必须添加系中必须添加EDTA。n反应体系中含过氧化氢酶可引起还原型细胞色素反应体系中含过氧化氢酶可引起还原型细胞色素C发生过氧化作用，从而干扰检测的正确。发生过氧化作用，从而干扰检测的正确。50联苯三酚法联苯三酚法n原理：原理：在碱性条件下，联苯三酚会发生自氧化在碱性条件下，联苯三酚会发生自氧化生成红生成红 酚，同时生成酚，同时生成O2- 。n定义定义:在一定条件下，在一定条件下，

33、每分钟抑制联苯三酚自每分钟抑制联苯三酚自氧化速率达氧化速率达50的酶量的酶量为一个酶活力单位。为一个酶活力单位。51操作操作n定义定义:在一定条件下，在一定条件下，每分钟抑制联苯三酚自每分钟抑制联苯三酚自氧化速率达氧化速率达50的酶量的酶量为一个酶活力单位。为一个酶活力单位。52实例：尿激酶（实例：尿激酶（urokinase） n本品系从本品系从新鲜人尿中提取新鲜人尿中提取的一种的一种激活纤维蛋激活纤维蛋白溶酶原白溶酶原的酶。的酶。n由高分子量由高分子量54000和低分子量和低分子量33000组成的组成的混合物，混合物，高分子量含量不得少于高分子量含量不得少于90%，每，每1mg蛋白中尿激酶活

34、力不得少于蛋白中尿激酶活力不得少于12万万U，蛋蛋白分解药物。白分解药物。53尿激酶尿激酶n（一）性状（一）性状n本品为白色非结晶状粉末本品为白色非结晶状粉末n（二）鉴别（二）鉴别n取比活力测定项下的取比活力测定项下的供试品供试品溶液，用巴比妥溶液，用巴比妥-氯化钠氯化钠缓冲液（缓冲液（pH7.8）稀释成每稀释成每1ml中含中含20U的溶液，的溶液，吸取吸取1ml，加加纤维蛋白原纤维蛋白原溶液溶液0.3ml，再依次加入再依次加入纤维蛋白溶酶原纤维蛋白溶酶原溶液溶液0.2ml，凝血酶凝血酶溶液溶液0.2ml，迅迅速摇匀，立即置速摇匀，立即置370.5恒温水浴中保温，记时，恒温水浴中保温，记时，反

35、应系统反应系统应在应在3045s内凝结，且凝块在内凝结，且凝块在15min内内重新溶解重新溶解。以。以0.9%氯化钠溶液作空白，同法操作，氯化钠溶液作空白，同法操作，凝块在凝块在2h内不溶。内不溶。54（三）检查（三）检查 n1溶液的澄清度与颜色，溶液的澄清度与颜色， 应澄清无色。应澄清无色。n2分子组分比分子组分比 取本品，加水制成每取本品，加水制成每1ml中含中含2mg的溶液后，加入等体积的缓冲液（取浓缩胶缓冲液的溶液后，加入等体积的缓冲液（取浓缩胶缓冲液2.5ml，20%十二烷基磺酸钠溶液十二烷基磺酸钠溶液2.5ml，20%十十二烷基磺酸钠溶液的二烷基磺酸钠溶液的10ml），），置水浴中

36、置水浴中3min，放放冷，作为供试品溶液；取供试品溶液冷，作为供试品溶液；取供试品溶液10l，加至样加至样品孔，照电泳法测定，按下式计算高分子尿激酶相品孔，照电泳法测定，按下式计算高分子尿激酶相对含量（对含量（%）。）。55（三）检查（三）检查n3干燥失重干燥失重 取本品，以五氧化二磷为干燥剂，在取本品，以五氧化二磷为干燥剂，在60减压干燥至恒重，减失重量不得过减压干燥至恒重，减失重量不得过5.0%。 n4异常毒性取本品，加氯化钠注射液制成每异常毒性取本品，加氯化钠注射液制成每1ml中含中含5000U的溶液，依法检查的溶液，依法检查，按静脉注射法给药，按静脉注射法给药，应符合规定。应符合规定。n5热原热原 取本品，加氯化钠注射液制成每取本品，加氯化钠注射液制成每1ml中含中含20000U的溶液，依法检测的溶液，依法检测，按家兔体重每按家兔体重每1kg注注射射1ml，应符合规定。应符合规定。566. 凝血质样活性物质凝血质样活性物质n（1）血浆的制备）血浆的制备 。n（2）复钙试验）复钙试验 取小试管，加取小试管，加血浆血浆0.1ml、6-氨基己酸溶液氨基己酸溶液0.1ml及巴比及巴比妥缓冲液妥缓冲液0.1ml，再加入再加入氯化钙氯化钙溶液观察凝固时间。以凝固时间最