手性药物的酶促合成

1、Enzymatic Synthesis and Enzymatic resolution Enzymatic Synthesis and Enzymatic resolution Enzymatic Synthesis and Enzymatic resolution of Chiral Drugsof Chiral Drugsof Chiral Drugs第四章手性药物的手性药物的酶促合成与酶促拆分酶促合成与酶促拆分2006.3本章内容本章内容1 手性药物概述手性药物概述2 手性药物的生物催化合成手性药物的生物催化合成3 手性药物的酶促拆分手性药物的酶促拆分4 本章总结本章总结1 手性药物概

2、述手性药物概述 手性：手性：英文名英文名chiralitychirality，源为希腊文，源为希腊文cheircheir，手或，手或handednesshandedness，是用来表达化合物分子结构不对称的术语。人的手是不对称的，是用来表达化合物分子结构不对称的术语。人的手是不对称的，左手和右手相互不能叠和，彼此是实物和镜像的关系。这种关系左手和右手相互不能叠和，彼此是实物和镜像的关系。这种关系在化学中称为在化学中称为“对映关系对映关系”。具有对映关系的两个物体互为。具有对映关系的两个物体互为“对对映体映体”。1.1 手性与手性药物手性与手性药物2001年10月10日瑞典皇家科学院在斯德哥尔摩

3、宣布：一半授予美国科学家William S.Knowles和日本科学家野依良治另一半授予美国科学家K.Barry Sharpless2001年诺贝尔奖 三位获奖科学家的贡献就在于他们找到了立体选择性合成的方法和催化剂，可以高效快速地合成一种手性分子而不生成另一种，这为开发具有新特性的分子和物质开创了一个全新的领域。目前人们已根据他们的研究成果研制出了抗生素、消炎药和心脏病药等许多药物。 手性药物：手性药物： 药物的药理作用是通过与体内的大分子之间严格的手性识别和匹配而实现的. 虽然对映异构体药物的理化性质基本相同，但由于药物分子所作用的受体或靶位是由氨基酸、核苷、膜等组成的手性蛋白质和核酸大分

4、子等，后者对与之结合的药物分子的空间立体构型有一定的要求。因此，对映异构体在动物体内往往呈现出药效学和药动学方面的差异。鉴于此，美国食品药品监督管理局规定，今后研制具有不对称中心的药物，必须给出手性拆分结果，欧盟也提出了相应的要求。 震动了医学界，当时以消旋体用作缓解妊娠反震动了医学界，当时以消旋体用作缓解妊娠反应药物，但后来在欧洲发现曾服用此药的孕妇产下应药物，但后来在欧洲发现曾服用此药的孕妇产下四肢呈海豚状的畸形儿。近期研究表明，两个对映四肢呈海豚状的畸形儿。近期研究表明，两个对映体都有镇静作用，原因出自代谢转化产物。体都有镇静作用，原因出自代谢转化产物。S(-)S(-)沙沙利度胺利度胺的

5、二酰亚胺进行酶水解，生成邻苯二甲酰谷的二酰亚胺进行酶水解，生成邻苯二甲酰谷胺酸，后者可渗入胎盘，干扰胎儿的发育造成畸胎，胺酸，后者可渗入胎盘，干扰胎儿的发育造成畸胎，而而R(+)R(+)异构不产生相同的代谢产物，因而不致畸。异构不产生相同的代谢产物，因而不致畸。沙利度胺沙利度胺(Thalidomide,(Thalidomide,反应停反应停) )事件事件1.2 手性药物对映体药效学差异手性药物对映体药效学差异 只有一种对映体具有所要求的药理活性只有一种对映体具有所要求的药理活性, ,而另一种对而另一种对映体没有药理活性映体没有药理活性 一种对映体中的两个化合物有等同的或接近等同的一种对映体中的

6、两个化合物有等同的或接近等同的药理活性药理活性 两种对映体具有不同的药理活性两种对映体具有不同的药理活性 各对映体药理活性相同但不相等各对映体药理活性相同但不相等Examples 布洛芬布洛芬( (Ibuprofen)Ibuprofen)的活性成分是的活性成分是S(+)S(+)布洛芬，布洛芬，R(-)R(-)异构体无效。异构体无效。S(+)S(+)布布洛芬对慢性炎症和风湿病的疗效与消旋体相当。但剂量仅为消旋体的一半。洛芬对慢性炎症和风湿病的疗效与消旋体相当。但剂量仅为消旋体的一半。 萘普生萘普生(Naproxen)(Naproxen)是一种常用的抗炎和解热镇痛药。目前主要以是一种常用的抗炎和解

7、热镇痛药。目前主要以S(+)S(+)异构异构体上市，其体上市，其S(+)S(+)异构体的抗炎和解热镇痛活性约为异构体的抗炎和解热镇痛活性约为R(R(一一) )异构体的异构体的1O1O一一2O2O倍倍 。 左旋左旋氧氟沙星氧氟沙星(Levofloxacin(Levofloxacin) )是广谱抗菌药，其作用是外消旋体的二倍，是广谱抗菌药，其作用是外消旋体的二倍，是右旋体的是右旋体的8-128-12倍。而右旋体无效，且未发现有任何副作用。倍。而右旋体无效，且未发现有任何副作用。 环磷酰胺环磷酰胺(Cyclophosphamide(Cyclophosphamide) )是一种常见的抗肿瘤药，目前仍以

8、外消旋体是一种常见的抗肿瘤药，目前仍以外消旋体上市，其左旋体和右旋体均有抗肿瘤作用，但左旋体的抗肿瘤作用是右旋体的上市，其左旋体和右旋体均有抗肿瘤作用，但左旋体的抗肿瘤作用是右旋体的两倍。两倍。 1R1R，2R(-)2R(-)氯霉素氯霉素(Chioramphenico1)(Chioramphenico1)有抗菌活性，其他异构体则无效。有抗菌活性，其他异构体则无效。手性药物两种对映体的不同药理作用手性药物两种对映体的不同药理作用具有互补作用具有互补作用 奈必洛尔奈必洛尔是一种降压药，它的右旋体为是一种降压药，它的右旋体为B-B-受体受体阻滞剂，而左旋体能降低外周血管阻力。并对心阻滞剂，而左旋体能

9、降低外周血管阻力。并对心脏有保护作用，因此以外消旋体给药为佳。脏有保护作用，因此以外消旋体给药为佳。 盐酸曲马多盐酸曲马多(Tramado1)(Tramado1)的左旋体和右旋体的镇的左旋体和右旋体的镇痛作用的机理分别是激动吗啡受体和抑制单胺递痛作用的机理分别是激动吗啡受体和抑制单胺递质再摄取，有协同作用，应用其消旋体使其镇痛质再摄取，有协同作用，应用其消旋体使其镇痛作用增强作用增强。1.3 相关术语及分析方法相关术语及分析方法对映体组成测定方法对映体组成测定方法手性液相色谱手性气相色谱毛细管电泳手性分离手性超临界流体色谱手性固定相法手性流动相添加法手性试剂衍生化法Daicell 公司 Chi

10、racel 柱Chiralcel ODChiralpak AD比旋光度，核磁共振，气相色谱，液相色谱等1.4 总结总结 手性药物光学异构体间表现出的药动学和药效差异显著，所以，研究一个手性药物时。仅对其外消旋体或某一个光学异构体进行生物学评价是不够的。必须对其所有的对映体分别进行生物学评价。在此基础上再确定是以外消旋体还是以其某一个光学异构体作为所要上市的新药。 美国FDA 于1992年3月公布了一系列准则。以指导这类药物的开发。要求对含有手性中心的药物，分别作每个旋光异构体的毒理和药理临床实验及其活性强度、质量和纯度的测定。证明它们都无任何有害作用，甚至对已上市的外消旋体药物也要按如此要求补

11、做研究工作，完善其研究资料。 因而近年来手性药物的研究开发倍受关注。单一对映体药物不断上市。已有许多手性药物经“手性转换”以单一对映体代替了过去的消旋体。 2 手性药物的生物催化合成手性药物的生物催化合成 尤其是利用水解酶类如脂肪酶、酯酶、蛋白酶拆分制备手性尤其是利用水解酶类如脂肪酶、酯酶、蛋白酶拆分制备手性化合物，利用微生物中酶的多样性和立体选择性，可以合成一些化合物，利用微生物中酶的多样性和立体选择性，可以合成一些化学方法难以实现的手性中间体。化学方法难以实现的手性中间体。 例如麻黄碱例如麻黄碱(Ephedrine)(Ephedrine)可用发酵法制取，由苯甲醛和蔗糖可用发酵法制取，由苯甲

12、醛和蔗糖在啤酒酵母存在下缩合，生成左旋体中间体，再与甲胺缩合，催在啤酒酵母存在下缩合，生成左旋体中间体，再与甲胺缩合，催化氢化后得化氢化后得(1R(1R，2S)2S)一一( (一一) )麻黄碱。麻黄碱。 2.1 概述概述生物催化高度立体选择性，底物专一性副反应少，反应条件温和，可避免消旋，重排，异构化的产生工艺和产品绿色Enantioselectivity立体选择性生物催化信息素、萜类甾体等的合成氰醇的手性合成及氰醇裂解酶的应用一些手性药物中间体的合成光学纯2-芳基丙酸的制备脂肪酶催化的酯化反应制备手性合成子其它酶催化的立体选择性反应全细胞生物催化剂的立体选择性反应酵母介导的立体选择性生物催化

13、 手性识别的原因：接受体或酶的活性位点对不同对映体，手性识别的原因：接受体或酶的活性位点对不同对映体，匹配度不一样。匹配度不一样。有机溶剂水溶性水不溶性有机溶剂水均一相水有机溶剂水双液相水饱和有机溶剂均一相水水水有机溶剂二连续相有机溶剂分散相水连续相水分散相有机溶剂连续相反应介质反应介质2.2 非水介质中的生物催化反应非水介质中的生物催化反应反相胶束体系超临界流体体系离子液体体系 反应介质的影响反应介质的影响通过影响底物、产物在水相和有机相中的分配， 从而影响它们在酶必需水层中的浓度来改变酶催化反应速度直接与 酶必需水作用，强极性有机溶剂可溶解大量水，有夺走必需水的趋势，导致酶失活对酶的直接影

14、响l 有机溶剂使底物基态能级下降或使酶底复合物能级升高l 有机溶剂分子进入酶活性中心，降低中心内部极性并加强底物与酶 之间形成的氢键l 有机溶剂侵入会造成酶的三级结构变化，间接改变酶活性中心结构有机溶剂的极性有机溶剂的极性 溶剂的极性对酶的催化活力也有较大的影响。一般认为酶在非极性溶剂中的活力较高。logP越大，疏水越大，疏水性越强，酶的活力越大性越强，酶的活力越大。 但是过于增大溶剂的疏水性，酶的活力反而降低。这可能是因为溶剂的疏水性太强，疏水性的底物不容易从溶剂中扩散到酶分子的周围，导致酶的活力降低。 同时也有资料表明，若溶剂的分子结构和底物的结构相似时，溶剂会作为酶活性中心的抑制剂而降低

15、酶的活力。表表 3 3 各种有机溶剂对各种有机溶剂对 NovozymeNovozyme 435435 催化酮洛芬酯化的影响催化酮洛芬酯化的影响 有机溶剂 LogP 值 ees 转化率 E 二氧六环 -1.1 2 3 3 乙腈 -0.33 5 7 4 异丁基甲基酮 1.32 17 19 6 二氯甲烷 1.47 3 4 7 异丙醚 1.90 17 43 2 甲苯 2.50 84 67 6 四氯甲烷 3 97 76 7 正己烷 3.5 81 89 2 值得说明的是溶剂在提高选择性的同时并不一定会使反应速率增加，也可能使反应速率变慢。一个非常慢的反应即使有很高的选择性，也难有实际用途，而一个快速反应即

16、使对映体选择性稍差，也有可能得到高光学纯度的产物。所以在选择拆分介质时，对酶的催化活力，对映体选择性和反应速率三者要兼顾。PSL脂肪酶催化潜手性二氢吡啶二羧基酯类衍生物的选择性水解在不同的有机溶剂中，酶具有不同的立体选择性，相同的酶在不同的有机体系反应所得产物的构型相反。 有机溶剂中酶的催化作用，水仍然是必需的基本条件。酶蛋白分子周围紧密结合着一层水，成为必需水必需水。在绝对无水的体系中，酶不表现催化活性。 酶在有机相中必需水的含量有一个最佳值最佳值，当有机溶剂中必需水的含量超过最佳含水量时，酶容易形成聚集体而变得不稳定，且催化活力降低。酶在不同的有机溶剂中保持一定的活力所需必需水的含量并不相

17、同。 同时，必需水的含量与溶剂的极性溶剂的极性有直接的关系。极性溶剂易与酶争夺必需水，但当增加水的含量时，酶也可以在极性较大的溶剂中保持一定的活力。有机相含水量有机相含水量CRL催化2溴丙酸的酯化反应COOHBrCRLn-BuOHhexaneCOBuBrCOOHBrR-S-Rac-溶剂含水量初速度选择性E011170.0521210.07566390.12510081 酶催化的还原反应能使分子内的酶催化的还原反应能使分子内的酮基和碳碳双酮基和碳碳双键键立体选择性地还原产生特定构型的化合物，而常立体选择性地还原产生特定构型的化合物，而常规化学法还原酮和烯烃则产生消旋体，因此酶催化规化学法还原酮和

18、烯烃则产生消旋体，因此酶催化的还原反应在手性药物合成中有重要的应用。的还原反应在手性药物合成中有重要的应用。2.3 手性药物的生物催化合成u 还原反应还原反应NHOMeOOCF3NHOMeOOCF3NHOMeOOCF3NHOMeOCF3NOMeOCF3OHOHNH3CCH3.HC橙色诺卡菌Yield 97%ee 99.9% 钙拮抗剂类抗心绞痛药，橙色诺卡菌（Nocardia salmonicolor）可以立体选择还原酮。 SQ31765a. SQ31765b. 肉碱肉碱(L-Carnitine)肉碱(L-Carnitine) 6已在工业中得到应用(图2)。L-肉碱又称维生素BT，其异构体对人体

19、有营养保健，减肥健美的作用，而D-肉碱无生理活性且对L-肉碱有拮抗作用。利用酵母菌酵母菌BakersYeastBakersYeast催化不对称还原得到目标产物。 c. BMS-210 620BMS-210 620 BMS-210 620(3)的合成中间体R)-醇(2)可由Spiwmonas Spiwmonas paucirrtobilispaucirrtobilis SC16113 SC16113菌株菌株催化还原1制得。反应釜中加人树脂使产物的回收过程简单有效。 d.d. 3-3-吡啶乙醇胺吡啶乙醇胺3-吡啶乙醇胺(6)也是一种肾上腺能受体激动剂，一条实用的合成路线就是利用酵母菌酵母菌Cand

20、ida Candida sorbophilasorbophila催化不对称还原4得到关键的手性3-吡啶乙醇胺中间体5，达到75%的产率和99.5%以上的ee值。当用啤酒醉母还原时只得到了70%-80%的ee值。( R ) - 地 诺 帕 明(Denopamine, 9)是首例具有口服活性和长效治疗心脏病的药物，利用一株高还原活力的白地白地霉菌株霉菌株GeotrichumGeotrichum sp. sp. G. 38还原-羰基羧酸酯(7)，得到相应光学纯的羟基酸(8)成功合成了（9）。e. (R)-地诺帕明地诺帕明(Denopamine)f.f. 索他洛尔索他洛尔(Sotalol(Sotalo

21、l) )索他洛尔(Sotalol)因为含有酸性的甲磺酰胺部分，是一种独特的抗心率失常新药。其d-型异构体是一种纯的类抗心率失常药物。利用白地霉菌株白地霉菌株GeotrichumGeotrichum sp. G. sp. G.催化还原-氯代酮(10)得到光学活性的相应氯代醇产物(11)成功制备了d-索他洛尔(12)(Scheme 3)。g.g. 托莫西汀托莫西汀 (Tomoxetine(Tomoxetine) )托莫西汀 (Tomoxetine,17)是首例去甲肾上腺素再摄取抑制剂，是一种抗抑郁药，其(R)-(+)-异构体药效比其对映体高9倍。氟西汀(Fluoxetine,18)也是一种强效的抗

22、抑郁药，而且其对许多病症，如焦虑、酒精中毒、慢性痛、肥胖、善饥以及厌食等均有很好疗效。利用啤酒酵母啤酒酵母催化不对称还原苯甲酸乙酸乙酯(13)或3-氯苯丙酮(15)得到相应的手性醇再经化学转化径基的构型翻转分别制得两种对映体产物。利用固定化的白白地霉菌株地霉菌株CeotrichumCeotrichum sp.G.38 sp.G.38催化还原13得到(S)-14合成了(R)-氟西汀(18)。Omapatrilat (1)是一种抗高血压药物酶法酶法/ /微生物法微生物法合成单一对映体是合成Omapatrilat的关键。利用谷氨酸酯脱氢酶还原胺化2-酮-6-羟基己酸得到6-羟基正亮氨酸。h. Oma

23、patrilati.索他洛尔索他洛尔u 氧化反应氧化反应生物催化的氧化反应可以使分子内非活泼的碳氢键立体选择性氧化，产生特定构性的羟基化合物羟基化合物，这种碳氢键非活泼氢用化学法很难氧化。甾体激素的微生物转化是生物催化法在手性合成研究中应用最早和最成功的例子，从而推动了生物催化的手性合成研究与发展。生物催化的氧化反应较多的应用在手性环氧化合物手性环氧化合物的合成当中。手性环氧化合物是非常重要的手性中间体，有广泛的药用价值。Shell和Gist-Brocades公司利用微生物的-羟基酶对丙烯醚进行了不对称环氧化，生成了具有很大光学活性的(S)-环氧化物。这些方法同样在合成-受体阻滞剂(S)-美托

24、洛尔(Metropolo1)和(S)-阿替洛尔(Atenolo1)工业工业得到了应用。此外，可用于环氧化的微生物还有血红素单氧化酶；甲烷单氧化酶和卤素过氧化物酶。 利用微生物生物转化制备甾体类药物已有多年的历史。常规化学方法很难氧化非活泼碳氢键，但是生物催化法却能奏效。例如蓝色梨头酶（Absidia coerulea）AS3.65 能使17-羟基-11-脱氢皮质酮（31）甾体环氧化产生氢化可的松（hydrocotison，32）。OOCH2OHOHOOCH2OHOHHO蓝色梨头霉50%-60%3132a. 甾体类激素甾体类激素 黑根霉（Rhizopus niger）能使孕酮（gestone，3

25、3）甾环环氧化产生11-羟基孕酮（34）。 OOCH3OOCH3HO黑根霉90%3334另外也可用微生物降解甾体的侧链，例如谷甾醇（sitosterol，35）是植物油产生中的副产物，它被偶发分支杆菌（Mycobacterium fortuitum）的突变体氧化降解可出去侧链生成雄甾二酮（androstenedione，36），后者是一种有价值的甾体类化合物合成的起始原料。OO偶发分支杆菌HO3536b. 卡托普利卡托普利卡托普利（captopril，38），又名巯甲丙脯酸。分子中含有两个手性中心，活性取决于含巯基烷链的构型，药物分子其（S,S）-对映体是（R,S）-构性药物活性的100倍以上

26、。COOHCOOHClONCOOHHSONCOOHCandida rugosaNaSH1) SOCl22), NaOHNHCOOH也可以采用假单胞菌脂肪酶或黑曲霉脂肪酶水解拆分-甲基-乙酰硫代丙酸得到（S）-对映体，再经酰氯化及与L-脯氨酸缩和可得到。COOHHSONCOOHSCOOCH3OCH3COSH1) 脯氨酸2) CH3OH, NH3SCOClSOCl2脂肪酶u 水解反应和酯化反应水解反应和酯化反应青霉素和头孢菌素青霉素和头孢菌素 青霉素G，青霉素V和头孢菌素C可以由发酵法生物合成，将他们的侧链水解可以制备6-氨基青霉烷酸（6-aminopenicillanic acid， 6-APA

27、）、7-氨基头孢烷酸（7-amino-cephalosporanic acid，7-ADCA），他们是半合成青霉素和半合成头孢菌素衍生物的母核，是重要的制药工业原料。D-苯甘氨酸和D-4-羟基苯甘氨酸是四种广泛使用的抗生素的侧链。通过酶法拆分消旋体海因类衍生物（53）可以得到D-4-羟基苯甘氨酸（54）。OHCCOOH+H2NCOOH+OHHNNHOOHOHNNHOOOH+HNNHOOHOHNH2OHOHHOHOONHH2NOOHH自发消旋化（少量）消旋体海因D-海因酶酰胺水解酶奥硝唑和赛克硝唑奥硝唑和赛克硝唑 奥硝唑（ornidazole，57）和赛克硝唑（secnidazole，58）是广

28、泛用于治疗厌氧菌、滴虫等感染的新一代5-硝基米唑类抗菌素。它们分子中有一个和不对称碳相连的仲醇，用酶催化拆分是比较快捷的方法。NNROHHO2NCH3NNRO2NCH3NNRO2NCH3+HHAcOAcOAmano Lipase AK3.手性药物的酶促拆分手性药物的酶促拆分定义：定义：生物催化手性拆分是以酶或生物选择性催化外消旋底物中的某个对映体优先反应，再利用其与未反应对映体的物理性能差异达到拆分目的。原理：原理：1）酶实际上是一个手性分子，和外消旋化合物中的两个对映体以不同的速度进行反应，从而达到动力学拆分的目的。2）如果两个对映体以相同的速度反应，但酶对一个反应中心所产生的构型是相同的，

29、结果产生两个非对映体而被拆分。3）若一个底物为前手性的，它发生不对称反应而生成光学活性化合物。C*esterEnzymedl-体S-alcoholR-esterR2C*OHR1R2+C*R2R3R1R3OHROR3R1AcylationHydrolysisa.a.环氧化物水解环氧化物水解3.1 手性药物的酶促拆分不对称水解反应不对称水解反应药物中间体A. niger strains (SC 16310, SC 16311)Rhodotorula glutinis SC 1629345的产率，e.e.值95，E值在25左右甲基叔丁基醚 (MTBE)产率45，e.e.值达到99.9b.b. 腈水解

30、腈水解腈水解酶无须辅酶，催化氰基直接水解成羧基，而腈水合酶具有紧密结合的金属离子(Co或Fe)作为辅酶，首先催化氰基生成相应的酰胺，再经过酰胺酶或蛋白酶催化水解为羧基。(R)-a-氟苯乙酸(R)-异构体的氰基水解为羧酸，(S)-异构体不发生反应通常是将要拆分的外消旋的底物进行酯化，然后再用脂肪酶立体选择性水解，从而获取其中一个对映体而另外一个不反应的对映体仍以酯的形式存在。c.c. 酯水解酯水解ee%=99%ArOCF3CH3OAr = 3-benzoylphenylH2OlipaseorganicsolventArOHOArOCF3O+rac-2S-2R-1CH3HHCH3S-酮洛芬Koul

31、等人用Trichosporon sp. (TSL)，一种在当地乡村发酵干酪分离出的菌种通过不对称水解反应得到光化学纯度的萘普生，大批量生产已经达到千克级水平。 酰化反应酰化反应酯化反应酯交换反应酰胺化反应LiapseMY(triacylglycerol ester hydrolases, EC 3.1.1.3) from Candida rugosa (30 unites/mg of solid)通过不对称酯交换反应得到光化学纯度的萘普生酯，然后进一步水解即可得到目标产物利用脂肪酶催化的选择性酯化反应，还可以直接用酸而不用酯。例如，外消旋酮洛芬的拆分。在含水0.1-0.5%（v/v）的四氯甲烷

32、中用脂肪酶Candida antarctica Lipase催化酮洛芬R异构体与乙醇发生酯交换反应可以将外消旋酮洛芬加以分离。产物酯的对映体过剩值超过95%，其异构体酸可以游离状态回收。OHO Ethanol LipaseOrganic solventOCH3OHOOCH3OROOCH3+呋喃型木酚醇(6)有保肝抗菌以及促进伤口愈合的功能，(2S，3R )-(6)的疗效远大于(2R，3S)-(6)。脂肪酶区域选择性催化其中一个羟基酯化并同时在另一个羟基上表达出立体选择性(见下图)。影响酶促拆分的几个因素影响酶促拆分的几个因素 酶源的影响 溶剂的影响 温度的影响 底物结构的影响 反应时间的影响b

33、iocatalystoldnew固定化酶的纯化酶的改性酶的修饰新的菌种微生物Enzyme activity（aw，pHenzyme form，solvent）Medium engineeringSolvent engineeringEnzyme engineeringProtein engineering3.2 提高立体选择性的方法提高立体选择性的方法酶酶 商品酶或粗酶中的杂酶或添加剂会降低酶的对映体选择性，因此纯化酶可以提高起其选择性。酶的修饰也是提高反应专一性和产率行之有效的方法。酶的纯化酶的修饰酶的改性酶的预处理1.酶的活化酶的活化其他化学或物理修饰蛋白质工程基因工程添加剂赋形剂盐、大环

34、化合物、酸、碱表面活性剂、印记分子等固定化技术交联、结晶、PEG定向进化定点突变过量表达OOOO由于生物转化反应所用的酶几乎都来源于微生物，如何筛选出含有所需酶的微生物显得尤为重要。筛选中要注意以下3个要点：设计酶催化反应过程以确定所需酶的种类；确定将作选择性培养的微生物类别；确定便捷灵敏的检测方法以便选择所培养的微生物。随着科技的发展，新酶层出不穷。英国的Snell等从当地筛选出一种能降解乙腈的细菌Rhodococcus AJ270，其含有的一种腈水合酶具有单一的酰胺酶活力，能用于腈与酰胺的转化反应。David用该酶对消旋布洛芬酰胺进行动力学拆分，由于其对S布洛芬酰胺的选择性，水解速度快，经

35、过适当反应时间后，可得到ee值为90%94%的S布洛芬。但若反应时间多短，则转化率不完全，底物利用率低；若反应时间过长，则底物完全水解，得到的将是产物的消旋混合体。发展新酶反应介质溶剂工程溶剂工程(solvent engineering) ：通过改变溶剂可以调节酶的活性和选择性，改变酶的动力学特性和稳定性等酶学性质该技术不必改变蛋白质本身，只要改变反应介质就可以改变酶的催化特性，它在生物催化剂的开发与利用中将起着重要作用。溶剂的选择需注意溶剂的选择需注意：溶剂对底物和产物的溶解性要好，能促进底物和产物的扩散，防止由于产物在酶分子周围的积累，而影响酶的催化反应；溶剂对反应必须是惰性的，不参与酶的催化反应；溶剂的毒性、成本以及产物从溶剂中分离、纯化等问题。多相反应体系离子液体 多相反应体系 水有机溶剂两相体系（biphasic aqu