EphA在大肠腺癌中的表达

1、EphA2在大肠腺癌中的表达第一部分大肠腺癌中EphA2表达及其与临床病理学因素、DNA倍体、细胞周期关系的研究EphA2基因的介绍基因的介绍 EphA2是Lindberg于1990年用简并引物从人角化细胞cDNA文库中筛选得到的一个Eph（Erythropoitin-produceing hepato-cellular,Eph) 亚家族成员 。 人EphA2基因定位于1p36.1,有17个外显子。 Eph受体家族是已知最大的酪氨酸蛋白激酶受体(receptor tyrosine kinase, RTK)家族最大的家庭。 Eph家族受体激酶和他们EFN配体介导的细胞信号传 导参与神经系统的基本

2、发生过程、神经系统的信号传 递，在细胞的分化、发育、增殖，组织和器官的形成、血管生成、细胞与细胞之间的粘附及肿瘤的发生和肿瘤的新生血管的形成等过程中发挥重要的和必不可少的作用。 EphA2与肿瘤的关系与肿瘤的关系 EphA2广泛高表达于不同的肿瘤组织和细胞系，如：乳腺癌、恶性黑色素瘤、前列腺癌和食管癌，肾细胞癌等，目前认为EphA2参与肿瘤的发生和发展，是功能强大的癌基因。 EphA2的高表达能诱导非转化乳腺和前列腺上皮细胞在体内、外的恶性转化，并促进其侵袭转移 。 应用EphA2蛋白的抗体靶向抑制试验，下调EphA2蛋白表达的同时，也抑制了肿瘤细胞的生长，进而降低肿瘤的恶性程度 。154例大

3、肠腺癌组织和相应正常大肠粘膜组织均来自郑州大学第一、二附属医院和河例大肠腺癌组织和相应正常大肠粘膜组织均来自郑州大学第一、二附属医院和河南省肿瘤医院南省肿瘤医院2001年年1月月2004年年12月月手术切除标本的存档蜡块手术切除标本的存档蜡块 (其中其中66例为手术切例为手术切除新鲜标本和蜡块和除新鲜标本和蜡块和88例存档蜡块例存档蜡块) 1份置份置4%多聚甲醛中固定存放多聚甲醛中固定存放另另2份置份置-82中存放中存放石蜡包埋、切片、 HE染色石蜡包埋、切片，进行免疫组化提取总mRNA、进行RT-PCR实 验 标 本FCM检侧DNA倍体、细胞周期细胞增殖率临床病理资料临床病理资料 154例（

4、88例存档石蜡包埋标本和66例手术切除新鲜大肠腺癌标本）大肠腺癌患者，术前均未接受化疗、放疗及其他治疗。其中男性 78例，女性 76例，年龄在 23-85岁之间，平均年龄为 49.7岁。 66例新鲜手术切除标本均为大肠腺癌：分化程度:高分化腺癌30例，中分化腺癌23 例，低分化腺癌13例。浸润深度:粘膜层10例，粘膜下层0例，肌层14例，浆膜层37例，外周组织5例。转移：有淋巴结转移者16例，无淋巴结转移者50例；有血道转移者1例，无血道转移者65例；无种植性转移。 88例存档蜡块全部为腺癌:分化程度：高分化腺癌21例，中分化腺癌18例，低分化29例和未分化20例；浸润深度：粘膜层62例，粘膜

5、下层1例，肌层17例、浆膜层5例，外周组织3例；转移：有淋巴结转移者14例，无淋巴结转移者74例；有血道转移者11例，无血道转移者77例；有种植性转移者10例，无种植性转移者78例 。技 术 路 线免疫组化（免疫组化（SP法法)FCMRT-PCR技术技术检测检测154例大肠腺癌组织例大肠腺癌组织和相应正常食管组织中和相应正常食管组织中EphA2蛋白表达蛋白表达检测检测66例大肠腺癌手术切例大肠腺癌手术切除新除新鲜鲜组织和相应正常大组织和相应正常大肠粘膜手术切除新肠粘膜手术切除新鲜鲜组织组织中中DNA倍体、细胞周期、倍体、细胞周期、细胞增殖率细胞增殖率探讨探讨EphA2表达与大肠腺癌病理临床因素

6、、表达与大肠腺癌病理临床因素、DNA倍体、细胞周期的关系倍体、细胞周期的关系检测检测66例大肠腺癌手术切例大肠腺癌手术切除新除新鲜鲜组织和相应正常大肠组织和相应正常大肠粘膜手术切除新粘膜手术切除新鲜鲜组织中组织中EphA2mRNA表达表达一. 免疫组化v 步骤 （略） v 对照组设计：以已知EphA2阳性食管鳞癌和正常食管粘膜腺体组织切片作为阳性对照，用正常兔IgG代替一抗作为阴性对照，用PBS代替一抗作为空白对照。v 免疫组化结果判定及定量分析：EPhA2免疫组化阳性表达位于细胞胞浆，呈棕黄色。定量分析采用高清晰图像处理系统，随机取10个高倍视野进行图像分析，对免疫组化切片检测EphA2阳性

7、细胞数，依据阳性细胞所占肿瘤细胞面积的百分比和染色强度判断结果。实 验 方 法二 .组织中总RNA的提取及RT-PCR v步骤 （略）v RNA浓度的测定 （略）v对照设置 ：（1）阴性对照：以去离子水代替提取 的总RNA，结果阴性。v（2）内参对照：用-actin作为内参引物，与EphA2和KAI1引物分别同管扩增，结果在紫外灯下出现一条330bp的荧光带v结果判定v阳性判断标准为：目的EphA2基因RT-PCR产物凝胶电泳后在紫外灯下分别出现一条586bp的荧光带。实 验 方 法取大肠腺癌和正常大肠粘膜组织0.5g剪碎100、300目尼龙网上搓收集细胞液，800prm/min离心2min7

8、0%乙醇(4)中固定1h LPR染液,避光冷藏(4)5min Stain 1ml避光30min.上机检测FCM实验步骤：实验步骤：FCM对照组设计和诊断标准：对照组设计和诊断标准： 设正常对照组：用正常人外周血淋巴细胞，即二倍体细胞作为DNA含量 和肿瘤细胞DNA倍体、细胞周期的参考标准 DNA倍体分析:用Partec流式细胞仪,计数10000个细胞,具有相同DNA含 量的细胞群表现为直方图中独立的峰,即每个峰表示一定DNA含量或倍体 的细胞亚群。在正常对照组中,第1个峰代表单倍体(2C)细胞亚群,在实验 组中，第1个峰代表双倍体(G0/G1 ,2C)细胞亚群,第3个峰则代表四倍体 (G2/M

9、，4C)细胞亚群，两峰之间代表S期细胞亚群。计算机系统算出每 个峰下的面积所表示的该倍体的细胞占全部细胞的百分比。 诊断标准:根据左连富的标准,DNA倍体单倍体细胞百分数与正常对照组 单倍体细胞平均百分数相比较,在其两个标准差之内为正常,否则为异常。 FCM计算标准：计算标准： DNA指数(DI)计算公式：DI=样品细胞G1峰道数均值正常组织细胞G1峰道数均值。 DNA含量分析:以DNA指数(DI)表示细胞DNA相对含量，根据DI值判断DNA倍体。0.9DI 1. 1 为DNA二倍体;DI 1. 1 为异倍体。 细胞周期分布的计算：运用DNA细胞分析软件，计算出各时相的分布百分比，以S期细胞比

10、率(SPF)和增殖指数（PI）表示细胞的增殖活性。 SPF( %) = S ( G0/ G1 + S + G2M) 100 % PI=(S+G2)（G1+S+G2）100%统计学处理 所有数据均经SPSS 12.0软件进行统计分析。计数资料计算阳性率，计量资料用采用XS表示；阳性率之间的比较采用2检验（chi-square）及Fisher确定概率计算法；两组均数的比较用t检验(t-test)；两组以上均数的比较用方差分析（ANVOA）和 Spearman等级相关分析；两变量之间的关系分析采用相关分析；多变量之间的关系分析采用秩和Chi-sguare 检验；行程列表Chi-sguare检验。显著

11、性水准=0.05。EphA2mRNA及蛋白表达与大肠腺癌的关系：免疫组化结果 免疫组化检测结果：免疫组化检测结果： EphA2蛋白定位于癌细胞、蛋白定位于癌细胞、粘膜上皮细胞及癌组织血粘膜上皮细胞及癌组织血管内皮胞浆内，管内皮胞浆内，呈棕黄色。呈棕黄色。 阴性对照均无阳性显示。阴性对照均无阳性显示。正常粘膜 116(75.3) 6(3.9) 26（16.9） 6（3.9） 1.3690.663 腺 癌 12（7.8）32（20.8）48（22.7） 62（40.3）4.7890.542 组别 EphA2蛋白表达（例数%）a 阳性细胞面积（XS)b 0级 I级 II级 III级正常粘膜组织中正常

12、粘膜组织中EphA2蛋白表达蛋白表达 SP法法 200大肠腺癌组织中大肠腺癌组织中EphA2蛋白表达蛋白表达 SP法法 200二二.EphA2蛋白表达在大肠腺癌癌细胞蛋白表达在大肠腺癌癌细胞与癌组织中血管内皮细胞的比较与癌组织中血管内皮细胞的比较 EphA2蛋白表达例数(%) 组别 0级 I级 II级 III级 肿瘤细胞 200(11.2) 930(45.6) 700（35.0） 170（8.2） 血管内皮细胞 170（8.3） 940（46.1） 690（34.5） 200（11.2） 注:2=1562.1481，2 =90.272， P70 30 5 (16.7) 8 (26.8) 9(3

13、0.0) 8(26.8) 0.577 性别b 男 78 7(9.0) 21 (26.8) 26(33.3) 2 4(30.9) 女 76 5 (6.6) 11(14.5) 22 (28.9) 38 (50.0) 0.074a: 2=7.580; b:2=6.928临床病理 EphA2蛋白表达例数(%) 学因素 例数 0级 I级 II级 III级 P肿 瘤部 位c 升结肠 14 0 (0.0) 1 (7.1) 2 (14.3) 11 (78.6) 横结肠 6 1（16.7） 1(16.7) 3(50.0) 1（16.7） 降结肠 4 0(0.0) 1(25.0) 2(50.0) 1(25.0)

14、乙状结肠 23 3(13.0) 3(13.0) 8(34.8) 9(39.1) 直 肠 86 4(4.7) 24(28.0) 28(32.6) 29(33.7) 结肠 24 4(16.7) 2(8.3) 5(20.8) 11(45.2) 0.0798大体类型d 隆突型 108 6（5.55） 25（23.14）31（28.7） 46（42.59） 溃疡型 6 0 （0.00） 3（50.0） 3（50.0） 0（0.00） 浸润型 27 3（11.11） 3（11.11）12（44.44） 9（33.33） 管周型 13 3（23.08） 1（7.70） 5（38.46） 7（53.85） 0

15、.0228c:2=9.8600; d：2=7.5625三、EphA2蛋白表达与大肠腺癌患者临床病理学因素的关系 （B)详细部位不清EphA2蛋白表达与大肠腺癌患者临床病理学因素的关系(C) 临床病理 EphA2蛋白表达例数(%) 学因素 例数 0级 I级 II级 III级 P肿瘤体积(直径cm) 9.1 7 2(28.6) 2(28.6) 2(28.6) 1(14.2) 0.5332=10.723EphA2蛋白表达与大肠腺癌患者临床病理学因素的关蛋白表达与大肠腺癌患者临床病理学因素的关系系(D) 临床病理 EphA2蛋白表达例数(%) 学因素 例数 0级 I级 II级 III级 P分化程度a

16、高分化 51 3(5.0) 7(13.7) 18(35.3) 23(45.1) 中分化 41 1(2.4) 9 (22.0) 18(43.9) 13(2.4) 低分化 42 7 (16.7) 13(31.0) 10(23.8) 12(28.6) 未分化 20 1(5.0) 3（15.0） 2(10.0) 14(70.0) 0.007a 浸润深度b 粘膜层（T0） 72 6(8.3) 21(29.2) 24(33.3) 21(29.1) 粘膜下层(T1) 1 0(0.0) 1(100) 0(0.0) 0(0.0) 肌层(T2) 31 2(6.5) 6 (19.4) 13(41.7) 10(32.

17、3) 浆膜层(T3) 42 4(9.5) 2(4.8) 7 (16.7) 29(69.0) 外周组织(T4) 8 0(0.0) 2(25.0) 4(50.0) 2(25.0) 0.004bA:2=22.730 ； b:2=29.225 EphA2蛋白表达与大肠腺癌的关系蛋白表达与大肠腺癌的关系 (E)淋巴道转移c 有 30 4 (13.3) 7(23.3) 12(40.0) 7(23.3) 无 124 8(6.5) 25(20.2) 36(29.0) 55(44.3) 0.1207c血道转移d 有 12 0 (0.0) 1(8.3) 7(58.3) 4(33.3) 无 142 12(8.5)

18、31(21.8) 41(28.9) 58(40.8) 0.1348d种植性转移e 有 0 0 (0.0) 0(0.0) 7(70.0) 3(30.0) 无 144 12(8.3) 32(22.2) 41(28.5) 59(41.0) 0.0783e 临床病理 EphA2蛋白表达例数(%) 学因素 例数 0级 I级 II级 III级 Pc:2=5.8205; d：2=5.565；e:2=6.8070 EphA2在大肠腺癌中的表达 SP法200EphA2免疫染色定位于肿瘤细胞和血管内皮细胞的胞浆,强度I级EphA2在大肠腺癌中的表达 SP法200EphA2免疫染色定位于肿瘤细胞和血管内皮细胞的胞浆

19、, 强度II级EphA2在大肠腺癌中的表达 SP法200EphA2免疫染色定位于肿瘤细胞和血管内皮细胞的胞浆,强度III级EphA2在大肠腺癌组织中的表达 SP法200EphA2蛋白阳性染色定位在肿瘤区域和血管内皮细胞EphA2基因RT-PCR结果EphA2基因RT-PCR结果：- 经RT-PCR扩增，目的条带为586bp。与EphA2引物同管扩增的-actin内参引物为 330bp的荧光条带。以去离子水代替提取的总RNA的阴性对照无任何荧光条带显示。 大肠腺癌癌组织和正常粘膜中EphA2mRNA表达 1 2 3 4 5 6 M A Epha2 600bp B -actin 200bp 一一.

20、EphA2mRNA表达与大肠腺癌临床病理学因素的关系表达与大肠腺癌临床病理学因素的关系临床病理临床病理 Eph2mRNA EphA2/-actin 学因素学因素 例数例数 + P (XS) P 正常组织 66 21 45 0.70750.3576 癌组织 66 22 44 0.26a 0.85010.4610 0.54k 性别 男 33 13 20 0.36210.2314 女 33 9 24 0.296b 0.20280.2996 0.888l 年龄 30 1 0 1 0.35400.446 30-60 40 19 21 0.79210.2364 60 25 3 22 0.006c 0.36

21、910.4328 0.001mEphA2mRNA表达与大肠腺癌临床病理学因素的关系(A)A：2=0.161; b: 2=1.091; c: 2=10.322k: F=6.277;l: F=0.20 ; m: F=11.405 EphA2mRNA表达与大肠腺癌临床病表达与大肠腺癌临床病理学因素的关系理学因素的关系(B)临床病理 Eph2mRNA EphA2/-actin 学因素 例数 + P (XS) P分化程度 高分化 30 6 24 0.51620.6321 中分化 23 11 12 0.74210.3261 低分化 13 5 8 0.089d 0.50260.6741 0.499n浸润深度

22、 粘膜层 5 2 3 0.50260.6459 粘膜下层 5 2 3 0.36540.6598 肌层 14 4 10 0.86210.3654 浆膜层 38 11 27 0.30110.3224 外周组织 5 2 3 0.038e 0.71490.1190 0.000od: 2=4.837; e: 2=10.120; n:F=0.474; o: F=48465; EphA2mRNA表达与大肠腺癌临床病表达与大肠腺癌临床病理学因素的关系理学因素的关系(C)临床病理 Eph2mRNA EphA2/-actin 学因素 例数 + P (XS) P转移 淋巴道转移 有 16 6 10 0.34620.

23、1791 无 50 16 34 0.685f 0.38960.1779 0.161p 血道转移 有 1 1 0 0.24960.7961 无 65 21 44 0.154g 0.24170.8192 0.953qf: 2=0.165; g: 2=2.031; p: F=2.119; q: F=0.004; EphA2mRNA表达与大肠腺癌临床病理学因素的关表达与大肠腺癌临床病理学因素的关系系(D)临床病理 Eph2mRNA EphA2/-actin学因素 例数 + P (XS) P部位 升结肠 9 4 5 0.19850.751 横结肠 2 1 1 0.24170.8192 降结肠 0 0 0

24、 0.00000.0000 乙状结肠 16 6 10 0.24130.7231 直 肠 39 11 28 0.720h 0.19510.7950 0.795r 肿瘤大体类型 隆起型 38 17 21 0.24130.7231 溃疡型 22 4 18 0.24960.7211 浸润型 3 0 3 0.23150.2339 管周型 3 1 2 0.112i 0.23510.2996 0.366s 肿瘤体积(直径cm) 5 32 14 18 0.43620.665 5 34 8 26 0.082j 0.44610.674 0.060t h: 2=1.337; i: 2=7.081; j: 2=3.0

25、33; r: F=0.342; s: F=1.076 t:F=9.286 1 2 3 4 5 6 M A Epha2 700bp B -actin 300bp M:标准分子量(100bp DNA ladder);A: EphA2 cDNA，片段大小586bp;B：内参照-actin, 片段大小330bp; 1: 阳性对照：2：: 癌浸润浆膜层;3： 癌浸润肌层;4： 癌浸润粘膜下层;5： 对应的正常粘膜6: 阴性对照EphA2在大肠腺癌组织中的RT-PCR结果 二二.大肠腺癌中大肠腺癌中EphA2蛋白表达与蛋白表达与EphA2 mRNA表达的表达的关系关系 大肠腺癌中EphA2蛋白表达与Eph

26、A2 mRNA表达的关系 EphA2 mRNA EphA2 protein + 合计 + 17 23 40 5 21 26 合计 22 44 66 2=0.25 ，P=0.6171不同级别不同级别EphA2蛋白表达的大肠腺癌中的蛋白表达的大肠腺癌中的EphA2 mRNA表达表达 EphA2蛋白表达分级 例数 EphA2/-actin (XS) 0 5 0.310.22 I 3 1.120.30 II 5 1.600.25 III 9 1.390.31 注: 0:I:II:III F=17.811 P0.01；0:I t=0.601 P0.05；0:II t=0.601 P0.05；0:III

27、t=0.95 P0.05EphA2与DNA倍体、细胞周期和细胞增殖率关系FCM检测结果检测结果一一.大肠腺癌和正常组织中大肠腺癌和正常组织中DNA含量和含量和DNA倍体倍体一一.大肠腺癌和正常组织中大肠腺癌和正常组织中DNA含量和含量和DNA倍体的比较倍体的比较病理临床因素 例数 DI (XS) DNA倍体 P 二倍体 异倍体 P 正常 组织 66 1.00.1 66 0 癌组织 66 1.670.19 0.005 7 59 0.005 a : F=6.086;b：F=3.697; 二二.大肠腺癌大肠腺癌DNA含量和含量和DNA倍体与病理临床因素的关系倍体与病理临床因素的关系二二.大肠腺癌大肠

28、腺癌DNA含量和含量和DNA倍体倍体与病理临床因素的关系与病理临床因素的关系(A)病理临床因素 例数 DI (XS) DNA倍体 P 二倍体 异倍体 P 年龄 30 1 1.100.17 1 0 30-60 40 1.260.21 5 35 60 25 1.110.15 0.215c 1 24 0.086m分化程度 高分化 30 1.160.21 3 27 中分化 23 1.230.16 2 21 低分化 13 1.320.17 0.489d 2 11 0.455nc: F=1.701;d：F=0.770; m:F=2.644;n: F=0.890 大肠腺癌大肠腺癌DNA含量和含量和DNA倍体

29、与病理临床因倍体与病理临床因素的关系（素的关系（B)病理临 例数 DI (XS) DNA倍体 床因素 P 二倍体 异倍体 P 性别 男 33 1.320.12 4 29 女 33 1.280.11 0.056 3 30 0.056F=6.277;F=3.697大肠腺癌大肠腺癌DNA含量和含量和DNA倍体倍体与病理临床因素的关系与病理临床因素的关系(C)病理临床因素 例数 DI (XS) DNA倍体 P 二倍体 异倍体 P浸润深度 粘膜层 5 1.270.23 1 4 粘膜下层 5 1.310.21 0 5 肌层 14 1.300.22 2 12 浆膜层 38 1.490.29 2 36 外周组

30、织 5 1.370.15 0.11e 2 3 0.550o淋巴道转移 有 16 1.310.20 2 16 无 50 1.430.16 0.224f 5 45 0.224p血道转移 有 1 1.430.33 0 1 无 65 1.390.20 0.938g 7 58 0.967qe：F=4.016; f：F=1.684; g：F=0.006; o: F=0.363;p: F=1.684;q: F=0.086 大肠腺癌大肠腺癌DNA含量和含量和DNA倍体倍体与病理临床因素的关系（与病理临床因素的关系（D)病理临床因素 例数 DI (XS) DNA倍体 P 二倍体 异倍体 P部位 升结肠 9 1.

31、480.23 1 8 横结肠 2 1.390.31 1 1 降结肠 0 1.100.20 0 0 乙状结肠 16 1.460.26 2 14 直 肠 39 1.430.21 0.765h 3 36 0.909r 肿瘤大体类型 隆起型 38 1.430.21 3 35 溃疡型 22 1.360.20 2 20 浸润型 3 1.390.31 1 2 管周型 3 1.660.23 0.432i 1 2 0.371s肿瘤体积(直径cm) 5 32 1.490.31 4 28 5 34 1.660.23 0.086 j 3 31 0.761t h：F=0.274; i：F=0.913; j:F=2.64

32、4; r: F=0.097; s:F=0.816;t:F=0.094 正常大肠粘膜组织的细胞周期分布 和DNA倍体 大肠腺癌的细胞周期分布， 出现异倍体峰 三三.大肠腺癌组织中大肠腺癌组织中EphA2蛋白和蛋白和EphA2mRNA表达表达与与DNA倍体和倍体和DI的的关系关系大肠腺癌组织中大肠腺癌组织中EphA2蛋白和蛋白和EphA2mRNA表达表达与与DNA倍体和倍体和DI的关系的关系EphA2 例数 DI (XS) DNA倍体 P 二倍体 异倍体 P 蛋白表达 阳性 40 1.760.26 4 36 阴性 26 1.690.32 0.903a 3 23 0.745c mRNA表达 阳性 2

33、2 1.790.31 4 18 阴性 44 1.870.39 0.273b 3 41 0.518d a: F=0.016;b: F=1.243;c: F=0.413;d: F=0.426四四.大肠腺癌大肠腺癌DNA倍体与倍体与SPF、PI的关系的关系 大肠腺癌大肠腺癌DNA倍体与倍体与SPF、PI的关系的关系 DNA倍体 例数 SPF( XS) P PI(XS) P 二倍体 7 11.062.52 20.732.52 异倍体 59 13.142.04 0.042a 23.32.66 0.032b 注：a: 2 =1.2; b: 2 =1.1EphA2蛋白的表达结果分析蛋白的表达结果分析 一一.

34、 EphA2在正常大肠粘膜上皮中的表达结果分在正常大肠粘膜上皮中的表达结果分析析 1.EphA2 在正常大肠粘膜上皮低表达，阳性率仅为24.67%（38/154），且阳性细胞III级染色仅占3.9%，阳性细胞大部分定位于大肠粘膜隐窝上皮基底部的胞浆,少量阳性细胞亦可见于表面粘膜腺体，提示可能EphA2作用于增殖期上皮细胞，也可能参与细胞分化。2.本研究发现的EphA2在正常大肠粘膜上皮和血管内皮细胞的表达和分布模式提示，EphA2可能参与了正常大肠粘膜上皮的增殖过程。 二二. EphA2在大肠腺在大肠腺癌中癌中的表达结果分的表达结果分析析 (1) EphA2广泛高表达于许多人类肿瘤，无论从肿瘤

35、细胞还是肿瘤组织的检测都高表达，包括：乳腺癌、恶性黑色素瘤、前列腺癌、食管癌、肺癌和宫颈癌。本研究发现，相比正常大肠粘膜上皮，EphA2在腺癌组织中高表达，统计学分析差异有明显显著性(P0.001)，表明EphA2高表达可能与大肠腺粘膜上皮的癌变相关。 EphA2高表达与大肠腺癌的生长方式、癌的组织学分级、癌细胞浸润深度相关，表明EphA2的高表达导致癌细胞恶性程度和侵袭性增加，使其更易发生浸润。 EphA2高表达与淋巴道转移、血道转移、种植性转移无关，表明EphA2的高表达与大肠腺癌癌细胞的转移潜能无关。二. EphA2在大肠腺癌中的表达结果分析(2) 三三. EphA2蛋白在大肠腺癌组织中

36、血管内皮细胞的蛋白在大肠腺癌组织中血管内皮细胞的阳性表达结果分析阳性表达结果分析 本研究发现在大肠腺癌组织中，EphA2阳性表达也见于血管内皮细胞，通过大肠腺癌细胞和血管内皮细胞EphA2阳性表达细胞计数对比，两者呈正相关，表明EphA2参与肿瘤组织中的血管形成，从而促进肿瘤的生长、发展。 EphA2mRNA 的结果分析的结果分析一、一、EphA2mRNA表达与大肠腺癌表达与大肠腺癌临床病理学因素关系的结果分析临床病理学因素关系的结果分析 应用RT-PCR技术，本研究发现在大肠腺癌组织中，EphA2mRNA表达与大肠腺癌患者的发病年龄相关，可能随着肿瘤患者年龄变化，与体细胞存在基因突变的积累或

37、基因修复系统功能低下或DNA甲基化相关。 EphA2mRNA表达与大肠腺癌的浸润深度相关，表明：EphA2调节大肠腺癌细胞的迁移和黏附能力，参与大肠腺癌的演进过程。二、二、EphA2mRNA表达与其蛋白表达的关系表达与其蛋白表达的关系 EphA2蛋白0级表达的mRNA水平明显低于蛋白表达13级的mRNA，但二者在蛋白表达13级的样本中mRNA水平并无差异，这与前述的报道类似，提示在大肠腺癌中EphA2蛋白与其mRNA表达水平不完全一致。这种结果的确切机制还不是很清楚，EphA2mRNA的表达水平高而蛋白水平低，提示二者在大肠腺癌中并不完全在转录水平调节，某种转录后翻译水平的调控机制可能存在。F

38、CM的结果分析的结果分析一、大肠腺癌组织中一、大肠腺癌组织中DNA倍体、细胞周期、倍体、细胞周期、癌细胞增殖率与临床病理因素的关系癌细胞增殖率与临床病理因素的关系 (1) 大肠腺癌中异倍体细胞群占83.39%，明显高于正常大肠粘膜组织。表明大肠腺癌有较高的恶性程度，但异倍体细胞群增高与临床病理因素无关，可能是取材标本组织成份为肿瘤细胞与间质正常细胞混合群体，影响检测分析。 本实验结果表明癌组织中异倍体癌及明显高于二倍体癌组织，而我们66例大肠腺癌标本中89.39%出现异倍体癌，表明大肠腺癌癌细胞增殖分裂能力异常强大，具有无限分裂增殖的特性。一、大肠腺癌组织中一、大肠腺癌组织中DNA倍体、细胞周

39、期、倍体、细胞周期、癌细胞增殖率与临床病理因素的关系癌细胞增殖率与临床病理因素的关系 (2)二、二、EphA2表达与表达与DNA倍体、细胞增殖的倍体、细胞增殖的关系关系 大肠腺癌组织中DNA倍体、DI值、及细胞殖率明显增高，表明癌细胞增值能力强，具有无限分裂增殖的特性。但与EphA2基因的表达无关，提示EphA2基因的表达与细胞的增值速度无关。1EphA2蛋白的阳性表达在大肠腺癌组织中明显高于正常大肠粘膜组织，且EphA2蛋白的高表达与癌的大体类型、分化程度及浸润深度相关，提示EphA2的高表达可能与大肠腺癌的癌变有关，并提示癌细胞具有更强的侵袭力。2EphA2蛋白也定位于大肠腺癌的血管内皮细

40、胞，提示EphA2基因表达参与了大肠腺癌的微血管生成，有望成为大肠腺癌基因治疗的新靶点。 4EphA2表达与KAI1的表达无相关性，提示在大肠腺癌中，EphA2和KAI1可能通过不同的调节通路参与大肠腺癌的发生及浸润转移。 5大肠腺癌组织中DNA异倍体、DI值及细胞增殖率明显增高，表明癌细胞增殖能力强，但与 EphA2基因的表达无关，提示EphA2基因的表达与细胞的增殖速度无关。 谢谢！谢谢！陈壬寅：陈壬寅： 88例存档蜡块全部为腺癌:分化程度：高分化腺癌21例，中分化腺癌18例，低分化29例和未分化20例；浸润深度：粘膜层62例，粘膜下层1例，肌层17例、浆膜层5例，外周组织3例；转移：有淋

41、巴结转移者14例，无淋巴结转移者74例；有血道转移者11例，无血道转移者77例；有种植性转移者10例，无种植性转移者78例 。FCM对照组设计和诊断标准：对照组设计和诊断标准： 设正常对照组：用正常人外周血淋巴细胞，即二倍体细胞作为DNA含量 和肿瘤细胞DNA倍体、细胞周期的参考标准 DNA倍体分析:用Partec流式细胞仪,计数10000个细胞,具有相同DNA含 量的细胞群表现为直方图中独立的峰,即每个峰表示一定DNA含量或倍体 的细胞亚群。在正常对照组中,第1个峰代表单倍体(2C)细胞亚群,在实验 组中，第1个峰代表双倍体(G0/G1 ,2C)细胞亚群,第3个峰则代表四倍体 (G2/M，4

42、C)细胞亚群，两峰之间代表S期细胞亚群。计算机系统算出每 个峰下的面积所表示的该倍体的细胞占全部细胞的百分比。 诊断标准:根据左连富的标准,DNA倍体单倍体细胞百分数与正常对照组 单倍体细胞平均百分数相比较,在其两个标准差之内为正常,否则为异常。 临床病理 EphA2蛋白表达例数(%) 学因素 例数 0级 I级 II级 III级 P肿 瘤部 位c 升结肠 14 0 (0.0) 1 (7.1) 2 (14.3) 11 (78.6) 横结肠 6 1（16.7） 1(16.7) 3(50.0) 1（16.7） 降结肠 4 0(0.0) 1(25.0) 2(50.0) 1(25.0) 乙状结肠 23

43、3(13.0) 3(13.0) 8(34.8) 9(39.1) 直 肠 86 4(4.7) 24(28.0) 28(32.6) 29(33.7) 结肠 24 4(16.7) 2(8.3) 5(20.8) 11(45.2) 0.0798大体类型d 隆突型 108 6（5.55） 25（23.14）31（28.7） 46（42.59） 溃疡型 6 0 （0.00） 3（50.0） 3（50.0） 0（0.00） 浸润型 27 3（11.11） 3（11.11）12（44.44） 9（33.33） 管周型 13 3（23.08） 1（7.70） 5（38.46） 7（53.85） 0.0228c:2

44、=9.8600; d：2=7.5625三、EphA2蛋白表达与大肠腺癌患者临床病理学因素的关系 （B)详细部位不清临床病理临床病理 Eph2mRNA EphA2/-actin 学因素学因素 例数例数 + P (XS) P 正常组织 66 21 45 0.70750.3576 癌组织 66 22 44 0.26a 0.85010.4610 0.54k 性别 男 33 13 20 0.36210.2314 女 33 9 24 0.296b 0.20280.2996 0.888l 年龄 30 1 0 1 0.35400.446 30-60 40 19 21 0.79210.2364 60 25 3

45、22 0.006c 0.36910.4328 0.001mEphA2mRNA表达与大肠腺癌临床病理学因素的关系(A)A：2=0.161; b: 2=1.091; c: 2=10.322k: F=6.277;l: F=0.20 ; m: F=11.405 大肠腺癌大肠腺癌DNA含量和含量和DNA倍体倍体与病理临床因素的关系（与病理临床因素的关系（D)病理临床因素 例数 DI (XS) DNA倍体 P 二倍体 异倍体 P部位 升结肠 9 1.480.23 1 8 横结肠 2 1.390.31 1 1 降结肠 0 1.100.20 0 0 乙状结肠 16 1.460.26 2 14 直 肠 39 1

46、.430.21 0.765h 3 36 0.909r 肿瘤大体类型 隆起型 38 1.430.21 3 35 溃疡型 22 1.360.20 2 20 浸润型 3 1.390.31 1 2 管周型 3 1.660.23 0.432i 1 2 0.371s肿瘤体积(直径cm) 5 32 1.490.31 4 28 5 34 1.660.23 0.086 j 3 31 0.761t h：F=0.274; i：F=0.913; j:F=2.644; r: F=0.097; s:F=0.816;t:F=0.094三三.大肠腺癌组织中大肠腺癌组织中EphA2蛋白和蛋白和EphA2mRNA表达表达与与DN

47、A倍体和倍体和DI的的关系关系大肠腺癌组织中大肠腺癌组织中EphA2蛋白和蛋白和EphA2mRNA表达表达与与DNA倍体和倍体和DI的关系的关系EphA2 例数 DI (XS) DNA倍体 P 二倍体 异倍体 P 蛋白表达 阳性 40 1.760.26 4 36 阴性 26 1.690.32 0.903a 3 23 0.745c mRNA表达 阳性 22 1.790.31 4 18 阴性 44 1.870.39 0.273b 3 41 0.518d a: F=0.016;b: F=1.243;c: F=0.413;d: F=0.426 本实验结果表明癌组织中异倍体癌及明显高于二倍体癌组织，而我

48、们66例大肠腺癌标本中89.39%出现异倍体癌，表明大肠腺癌癌细胞增殖分裂能力异常强大，具有无限分裂增殖的特性。一、大肠腺癌组织中一、大肠腺癌组织中DNA倍体、细胞周期、倍体、细胞周期、癌细胞增殖率与临床病理因素的关系癌细胞增殖率与临床病理因素的关系 (2)EphA2基因的介绍基因的介绍 EphA2是Lindberg于1990年用简并引物从人角化细胞cDNA文库中筛选得到的一个Eph（Erythropoitin-produceing hepato-cellular,Eph) 亚家族成员 。 人EphA2基因定位于1p36.1,有17个外显子。 Eph受体家族是已知最大的酪氨酸蛋白激酶受体(receptor tyrosine kinase, RTK)家族最大的家庭。 Eph家族受体激酶和他们EFN配体介导的细胞信号传 导参与神经系统的基本发生过程