DNA的酶切与连接二

1、实验八 DNA的酶切与连接 （二）2017-5-24实验目的 1. 掌握DNA连接酶的一般性质 和作用机制。 2. 掌握DNA连接体系的建立以及连接样品的检测。 实验原理连接 核酸片段可以通过连接酶的作用连接起来而获得重组分子 。 D N A 连 接 酶 催 化 双 链DNA分子中相邻碱基的5 P 末 端 与 3 - O H 间 形 成3,5-磷酸二酯键。 一个DNA片段的5-P末端与另一个3-OH末端相互靠近时，在DNA连接酶的作用下，有Mg2+，ATP存在的缓冲系统中可以被连接起来而形成重组子。实验原理连接连接反应中值得注意的几个问题1.DNA连接酶 常用的DNA连接酶有两种（二者作用机理

2、类似）： 来自大肠杆菌的DNA连接酶 来自噬菌体的T4 DNA连接酶（最常用）T4连接酶的活性用Weiss单位表示，Weiss单位是指在37 下20min内催化1mol32P从焦磷酸根置换到,-32PATP所需的酶量。连接反应中值得注意的几个问题2. 连接反应的温度 DNA连接酶的最适反应温度为37 。 但在此温度下， 粘性末端的氢键结合很不稳定，折中办法是12过夜。连接反应中值得注意的几个问题3. DNA的平末端和粘性末端 由于内切酶产生的DNA末端有平末端和粘性末端，因而连接反应中就有平末端连接和粘性末端连接。二者连接效率不同。 粘性末端效率高，因而在底物浓度，酶浓度选择上是有差异的。连接

3、反应中值得注意的几个问题4. 连接反应的检测 连接反应成功与否，最后的检测要通过下一步实验，转化宿主菌，阳性克隆的筛选来确定。实验原理转化 感受态细胞：经过CaCl2溶液处理的E.coli细胞对外源DNA的吸收变得非常敏感，其细胞内的酶限制-修饰系统被抑制，有利于外源基因的转化、表达和繁殖，这种细胞被称作感受态细胞。 转化：感受态细胞吸收外源DNA的过程。 热激：将DNA与宿主细胞混合后，将宿主细胞放入42度温水中保温1.5分钟以增加转化效率的过程。DNA克隆的简单流程基因组DNA、PCR产物（片段）质粒DNA（载体）限制性酶切（修饰DNA末端）连接载体与片段转化（将重组质粒导入宿主细胞）分析

4、重组子实验试剂 1. 纯化后的酶切质粒载体和目的基因。 2. 10 x T4DNA连接酶buffer 3. T4 DNA 连接酶实验方法DNA分子的体外连接 在无菌离心管中加入一下溶液 混匀后，置于调好温度12-14度的PCR仪过夜。成分体积加入量DNA片段11.5 ul100 ng质粒1 ul10 ngT4 连接缓冲液1.5 ulT4连接酶1 ul思考题 1. 连接反应中应注意些什么问题及如何提高连接效率？ 2. 简述一个完整外源DNA的克隆过程。 3. 简述T4 DNA 连接酶的作用机理。连接反应中值得注意的几个问题4. 连接反应的检测 连接反应成功与否，最后的检测要通过下一步实验，转化宿主菌，阳性克隆的筛选来确定。实验试剂 1. 纯化后的酶切质粒载体和目的基因。 2. 10 x T4DNA连接酶buffer 3. T4 DNA 连接酶实验方法DNA分子的体外连接 在无菌离心管中加入一下溶液 混匀后，置于调好温度12-1