chap原核生物分子克隆的宿主和载体系统

1、本章节主要内容 用于DNA复制的特殊大肠杆菌品系 DNA克隆载体 细菌DNA转化方法 基因克隆的噬菌体系统第一节 应用广泛的细菌宿主一、E. coli K12 的生物学 革兰氏阴性细菌 没有核膜和染色体 一个环状双链DNA分子，有一个复制起点 细胞中能维持质粒DNA的复制 生活周期较短，20min分裂一次 能在发酵罐中高密度生长 能在平板上培养出单克隆A) lac operon结构以及表达特性二、乳糖操纵子lac Z: -gallactosidase (-半乳糖苷酶，水解乳糖形成半乳糖和葡萄糖）lac Y: lactose permease（半乳糖苷透性酶，运送乳糖透过细菌的细胞壁)lac A

2、: transacetylase（半乳糖苷乙酰转移酶，去除由半乳糖苷透性酶吸收的有毒的硫代半乳糖苷thiogalactoside)lac I: 乳糖阻遏蛋白基因Plac :乳糖代谢结构基因的启动子PI : 阻遏蛋白基因的启动子CAP：代谢激活蛋白结合位点 阻遏蛋白四聚体不仅能被别乳糖结合，也能被与别乳糖结构类似的物质如IPTG(异丙基-D-硫代半乳糖）结合，这种能高效诱导酶的合成，但又不被所诱导的酶分解的分子，称为安慰性诱导物二、乳糖操纵子 利用-半乳糖苷酶及其基因 -半乳糖苷酶能分解乳糖的类似物X-gal形成蓝色物质，可用此反应来检测细胞中-半乳糖苷酶的活性。a-互补显色反应（蓝白斑筛选）l

3、acZ -半乳糖苷酶-分解半乳糖iPO调控蛋白-肽段分解X-gal产物呈现蓝色诱导剂IPTG-半乳糖苷酶基因lacZ突变体M15a-互补显色反应（蓝白斑筛选）总结细菌菌株野生型突变体（Lac Z-基因）突变体+无外源片段插入质粒（ Lac Z-+ Lac Z）突变体+有外源片段插入质粒（ Lac Z-） Lac Z 蛋白有无（仅有片段）有（+片段）无（仅有片段）底物X-gal分解情况蓝色菌落白色菌落蓝色菌落白色菌落抗生素抗性无无有有第二节 质粒载体一、质粒的基本生物学特征 质粒是染色体外稳定遗传的复制体，其特点共价闭环，双链DNA分子。 大都数质粒具有复制原点，能独立进行复制，不依赖寄主的细胞

4、复制周期。质粒 质粒通常赋予寄主一些表型特征，如抗生素抗性等。 选择性标记(selectable marker):由于质粒携带的基因，可供实验室条件下进行选择的一些标记。如抗性，营养元素的利用等。显性质粒与隐性质粒.第二节 质粒载体二、质粒的大小和拷贝数 相对分子量从 1kb到250kb不等。分子量较小的适合实验室利用 拷贝数 严谨型: :少数拷贝存在于细胞中（1几个） 松弛型: :多个拷贝存在于细胞中（1010） 严谨型与松弛型是相对的。第二节 质粒载体（1）、反义RNA进行调控的机制（plasmid Col E1 ）RopdimerPRNAIIRNA IIA、在复制起点处， RNA II（

5、长555个碱基）与质粒DNA形成RNA-DNA复合物，RNA酶H的降解RNA II ，露出3自由羟基，质粒复制起始。三、调节拷贝数的机理(质粒的复制，补充知识)B、 如果RNA I和RNA II形成双链RNA螺旋，RNA酶H不能降解RNA II，复制不能进行。RopdimerPRNAIIRNA IIC、 当质粒的浓度比较高的时，RNA I和RNA II形成双链RNA螺旋，使质粒的复制不能起始。D 、 当质粒的比较低时，RNA II与质粒DNA形成RNA-DNA复合物，RNA酶H降解RNA II 质粒复制起始。E、突变RNA I或去除Rop基因导致质粒的拷贝数增加。(2 )关键蛋白与重复区域结合

6、进行调控的机理（ pS101质粒） A 复制原点区域含有37拷贝的长度为1722bp的重复区域，R1、R2、R3等。(2 )关键蛋白与重复区域结合进行调控的机理 B、复制原点附近有一个编码基因repA,编码RepA蛋白。 RepA是双功能的蛋白： 与复制原点区域的重复序列结合，起始DNA的合成；与自身基因的启动子结合，抑制自身的转录。质粒拷贝数由RepA蛋白浓度和质粒自身的浓度进行调节。 如果质粒拷贝数高， RepA蛋白与自身的启动子区域结合，抑制转录，RepA蛋白合成受阻，DNA的复制受到抑制。RepA蛋白通过结合到两个质粒的重复序列把它们连接起来，避免复制起始。 细胞分裂后，拷贝数和Rep

7、A蛋白的浓度降低， RepA蛋白自身合成增加，结合到重复区域起始DNA的合成 。(2 )关键蛋白与重复区域结合进行调控的机理问题：在寄主复制后，质粒是如何分配到子细胞中？ Par原件会附着在细胞膜上，随着细胞的分裂，质粒正确 分配到子细胞中，维持相对稳定的质粒拷贝数。第二节 质粒载体四、相容性 在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一寄主细胞系中稳定地共存的现象，称为质粒的不相容性，或称为不亲和性（Plasmid incom- patibility)。这样的两种质粒称为不亲和质粒第二节 质粒载体 引起质粒的不相容的机理 A 具有相同的复制调控机制 B 控制质粒分配的pa

8、r元件相同,也会引起质粒的不相容 不相容群：指那些具有不相容性的质粒组成的一个群体，一般具有相同的复制子ColE1/pMB1五、基于大肠杆菌的克隆载体克隆载体：是一种能携带外源DNA片段进入受体细胞，并在受体细胞中得到维持或表达的DNA分子。通常由天然的质粒、噬菌体或动植物的病毒改造而成。1 质粒克隆载体的命名法pBR322“p” 代表质粒“BR”代表构建的实验室“322”区别于其他的质粒五、基于大肠杆菌的克隆载体2、质粒载体的一般特性（1）具有复制起点，在宿主细胞中能自主复制。（2）具有选择标记基因（3）具有若干限制酶单一位点（4）具有较小的分子量和较高的拷贝数R7268ApRR1 drd

9、19ApR CmR SmRSuR KmRpMB3ApRpSF2124ApRpBR312ApR TcRpSC101TcR12pM88pMB9TcR34ColE1566pBR313ApRTcRpBR322ApR TcR78pMB1(b)五、基于大肠杆菌的克隆载体3、第一个人工构建的遗传载体4、改进了的载体（pUC载体乳糖选择质粒） 具有更高的拷贝数 重组体的识别只需要一步 拥有更多的多克隆单酶切位点五、基于大肠杆菌的克隆载体pUC载体乳糖选择质粒p(1)来自pBR322质粒的复制起点(ori)；p(2)氨卞青霉素抗性基因(AmpR)，但它的DNA核苷酸序列已经发生了变化，不再含有原来的限制酶的单识

10、别位点；p(3)大肠杆菌-半乳糖苷酶(lacZ)的启动子及其编码该基因氨基端-肽链的DNA序列,此结构特称为lacZ基因；p(4)多克隆位点(MCS)区段：位于lacZ 基因中的靠近5端，内含十几个单一的限制性内切酶识别切割位点，使含有不同粘端的目的DNA片段可方便地定向插入载体中。但它并不破坏lacZ 基因的功能。BamHIpUC182686 bpAprlacZoriGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT396452EcoRISstIKpnI SmaIXbaISalIPstISphIHindIIIpGEM载体克隆DN

11、A的体转录p 加入了两个短片段，这两个片段在限制性酶切位点的两侧，可被T7噬菌体的RNA聚合酶或SP6 T7噬菌体的RNA聚合酶的识别p 方便了克隆DNA的体外转录，便于研究RNA加工，合成蛋白质等的研究等五、基于大肠杆菌的克隆载体多拷贝装有多克隆位点（MCS）正选择颜色标记 lacZ装有两个噬菌体的强启动子用于外源基因的高效表达 注意：T7和SP6启动子特异性地由噬菌体DNA编码的RNA聚合酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNA聚合酶，如E.coli BL21（DE3） 等2743 bpMCSlacZPT7oriAprpGEM-3ZPSP6pGEM-3Z：第三节 噬菌体克隆载体 1

12、噬菌体的基本特征 裂解周期 溶源 2 溶源性噬菌体 原噬菌体 溶源菌 噬菌体，M13 噬菌体颗粒中的DNA是一线性双链DNA分子，长48 502bp。 基因簇集排列 线噬菌体上有些基因可被取代而不影响其生活周期 线性噬菌体两端各有12个碱基的5凸出黏性末端是互补的,该互补序列相互作用形成cos位点。 作用：进入细胞的DNA通过两端的黏性末端环化。 作为内切酶的识别位点一、 噬菌体的生物学1、对野生噬菌体的改进 A、 删除多余的限制性内切酶的位点。 B 、切除一些非必需序列，增加载体的容量。 C、设计阳性选择重组子的方法。 D、设计可方便地通过转录作用制备外源插入DNA的RNA探针的载体 E、发

13、展可以使插入的真核cDNA与半乳糖苷酶形成融合蛋白的载体。 二、基于噬菌体的克隆载体2 、噬菌体基因组可删除的部分不影响生存能力 噬菌体基因组中可以删除的序列与噬菌体进入从裂解状态进入溶源状态以及从溶源状态进入裂解状态有关，即与噬菌体整合和脱离大肠杆菌的染色体相关 删除了这部分序列的噬菌体只能进行裂解循环二、基于噬菌体的克隆载体3、噬菌体载体可分为q 插入型载体：只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点。失去了非必需区切点又位于报告基因上，故在切开DNA并插入外源基因后，报告基因失活，即可依此进行重组体的筛选可插入长度为10kb的外源DNA 二、基于噬菌体的克隆载体两种报告基因的插入型载体 cI

14、基因内保留HindIII和EcoRI单酶切位点，当有外源DNA在这酶切位点插入时，使cI基因失活，感染hf-大肠杆菌后可形成空斑（ 如gt10） 。 在噬菌体DNA插入的lacZ基因末端设有单一的EcoR酶切位点。在此处插入外源基因，可表达-半乳糖苷酶的融合蛋白，利用特异性抗体或DNA测序方法可筛选重组DNA。这类载体适宜构建cDNA文库(如ZAPII)二、基于噬菌体的克隆载体q替换型载体：具有成对的克隆位点，在这两个位点之间的 DNA区段可以被外源插入的DNA所取代。可克隆的片段大，最大可达23kb23kb，而质粒最大仅10 kb10 kb左右；DNADNA的长度大于野生型噬菌体DNADNA

15、长度的7575而不超过其105105时，才能被包装成噬菌体颗粒，当DNADNA的长度短于野生型的75%75%或超过105%105%时，噬菌体的活性就急剧下降，因此要求载体DNADNA和外源DNADNA长度之和在393953kb53kb之间。二、基于噬菌体的克隆载体三 克隆载体的体外包装体外包装： 模拟噬菌体DNA分子在宿主细胞内发生的包装过程，将重组的噬菌体DNA分子包装成成熟的具有感染能力的噬菌体颗粒必要性： 噬菌体重组分子直接感染大肠杆菌的效率较低，而在试验过程中，因内切酶的处理，DNA的连接产生的有效分子等原因，使得转染效率更低三 克隆载体的体外包装三 克隆载体的体外包装 单菌株体系 缺

16、陷型噬菌体在cos位点有突变， 噬菌体的DNA复制不能完成，但可形成外壳蛋白，可以制备包装所必须的各种外壳蛋白。三 克隆载体的体外包装3 双菌株的体外包装原理A 噬菌体的头部和尾部的包装是分开进行B 头部基因发生突变的噬菌体只能形成尾部C 尾部基因发生突变的噬菌体只能形成头部D 两种不同突变的噬菌体混合起来，能在体外装备形成有活性的噬菌体颗粒Lyse, mixAdd ATP and concatemerized DNAMature phage particles重组噬菌体的鉴别 lacZ基因功能选择方法类似于质粒中的蓝白斑筛选 cI基因功能选择法cI 插入失活的噬菌斑是“清澈”的，而野生型正常

17、的噬菌斑是“浑浊”的5.4 重组噬菌体的鉴别Spi-（sensitive to P2 inhibition）正选择 A 野生型噬菌体，不能在P2噬菌体溶源性细菌中生长，为Spi+，即对在P2噬菌体的抑制成敏感反应。B 噬菌体载体中的red和gam区段被外源片段取代后， 噬菌体就能在P2噬菌体溶源性细菌中生长。5.4 重组噬菌体的鉴别基于基因组大小的筛选 包装体系只能将大小3752Kb的DNA分子插入到噬菌体的头部结构中 插入型载体（第六章）通常删除了噬菌体的中非必须的基因部分，因此中有重组后介于3752Kb的分子才能被包装。二、M13 噬菌体克隆载体M13噬菌一般特点 仅6407 个核苷酸 有

18、双链环状，单链环状存在形式 基因组采取滚环复制形式 适合做载体 具有比噬菌体更大的装载能力 单链形式在某些实验过程很重要，如测序、体外突变等第四节 外源DNA和载体的连接1、互补黏性末端之间的链接同一限制酶切割位点连接： 由同一限制性核酸内切酶切割的不同DNA片段具有完全相同的末端。只要酶切割DNA后产生单链突出（5突出及3突出）的粘性末端，同时酶切位点附近的DNA序列不影响连接，那么，当这样的两个DNA片段一起退火时，粘性末端单链间进行碱基配对，然后在DNA连接酶催化作用下形成共价结合的重组DNA分子。一、外源DNA和载体连接的方法一、外源 DNA 和载体的连接方法2、平末端之间的链接DNA

19、连接酶可催化相同和不同限制性核酸内切酶切割的平端之间的连接。原则上讲，限制酶切割DNA后产生的平端也属配伍末端，可彼此相互连接；若产生的粘性末端经特殊酶处理，使单链突出处被补齐或削平，变为平端，也可实行平端连接。操作方法同黏性末端之间的链接，增加酶的用量。3 、将粘末端加到平末端分子上 DNA 接头 同聚物加尾产生粘性末端 PCR产物的克隆连接（特例）一、外源 DNA 和载体的连接方法DNA 接头 同聚物加尾连接是利用同聚物序列，如多聚A与多聚T之间的退火作用完成连接。在末端转移酶(terminal transferase)作用下，在DNA片段端制造出粘性末端，而后进行粘性末端连接。这是一种人

20、工提高连接效率的方法，也属于粘性末端连接的一种特殊形式。同聚物加尾产生粘性末端dATPdTTPPCR产物的克隆连接 PCR反应中所使用的聚合酶具有末端转移酶的活性，通常在3末端加上A。 经特使处理的载体具有3 突出T碱基，通过T/A互补，进行克隆。属于黏性末端的连接，该克隆方式特称TA克隆。从生物秀网站下载二、定向克隆 将外源DNA按正确的方向插入载体。通常采用不同的内切酶分别处理载体和片段，使线性载体和片段的两段带有不同的粘性末端，通过载体与片段之间的连接，实现定向克隆。第五节 ：一个基因在E. coli 中的调节表达一、研究目的 研究拟南芥中钙结合蛋白肌钙网蛋白在花中的功能。 需制备该蛋白

21、的抗体二、研究基础 获得了基因的cDNA克隆 获得了原核表达载体和细菌菌株 获得了纯化蛋白质用的金属螯合层析柱 具备免疫家兔的实验技术三、研究策略 1、构建原核表达载体 2、纯化蛋白 3、免疫家兔 4、检测该蛋白质在花中的表达MCS2、原核表达载体pET系统能够表达外源基因的原理（a）分别利用 T7 RNA聚合酶转录目标基因，用大肠杆菌自身的系统翻译合成目标蛋白质。（b）需要大肠杆菌能表达T7 RNA聚合酶（c）加入诱导物（IPTG，异丙基-D-硫代半乳糖苷 ）同时开启T7 RNA聚合酶和目标基因的表达。（d）对SD序列与AUG之间的距离进行了优化lac OT7 gene 1lac promo

22、terE.Coli, RNA 聚合酶lac I genelac I repressorIPTG 诱导Host cellT7 RNA 聚合酶lac OT7 promotertarget genelac I genelac I repressorpETT7 RNA polimeraseIPTG induction克隆到pET载体中的基因表达调控策略lac OT7 gene 1lac promoterE.Coli, RNA polimeraselac I genelac I repressorIPTG inductionHost cellT7 RNA polimeraselac OT7 promot

23、ertarget genelac I genelac I repressorpETT7 RNA polimeraseIPTG inductionpLysS Or ET7 lysozme geneT7 lysozmeinactive克隆到pET载体中的基因表达调控策略-控制T7 RNA聚合酶本底表达lac OT7 gene 1lac promoterE.Coli, RNA polimeraselac I genelac I repressorIPTG inductionHost cellT7 RNA polimeraselac OT7 promotertarget genelac I genelac I repressorpETT7 RNA polimeraseIPTG inductionpLysS Or ET7 lysozme geneT7 lysozmeinactive克隆到pET载体中的基因表达调控策略-控制T7 RNA聚合酶本底表达(1)(2)(3)ABSampleWashingElutionXBLigand containing NiXBAAu诱导融合蛋白表达后，用裂解液将细菌裂解，释放蛋白。u将裂解液过一个镍柱u将污染的蛋白洗涤后，将目标蛋白洗脱第二节 质粒载体四、相容性 在没有