未知病原菌的分离鉴定

1、未知病原菌的分离鉴定 病原菌检测程序药物敏感试验直接涂片、染色、镜检分离、鉴定生化试验(书p17-18)血清学试验(玻片凝集法)动物试验(产毒性、分离)初步诊断分子生物学技术(核酸杂交、PCR、基因芯片 核酸 ) 其他检测技术观察培养特征、形态特征病原菌抗原检测形态结构临床标本中未知病原性球菌的分离鉴定程序 临床标本直接涂片、革兰染色、镜检(形态,排列,染色性) 血琼脂平板/巧克力血琼脂平板(菌落性状,溶血性,色素)可疑菌落 涂片,染色,镜检 纯培养 生化反应 致病性测定 药敏试验 思考：如何从脓拭子、咽拭子中分离并鉴定病原性球菌？查病原标本脓血便、肛拭子选择/鉴别培基生化反应血清学鉴定双糖发

2、酵, 橘橼酸盐利用试验,尿素,靛基质试验玻片凝集试验SS平板,中国兰,EMB未知肠道杆菌的分离鉴定程序 伊红美蓝平板- EMBEosin-methylene blue agar,EMB克氏双糖铁试验Double sugar iron slant枸橼酸盐利用试验Citrate slant吲哚试验Indole broth玻片凝集一、材料： 5人/组 1.待检标本： 脓拭子、咽拭子、尿液标本、肛拭子1#、肛拭子2# 2.培养基：血平板 3块/组 EMB平板 3块/组 克氏双糖铁斜面 3支/组 动力-靛基质-尿素半固体3支/组3.其他：革兰染液、玻片、10%胆盐、靛基质试剂、NS、兔血浆、 3%H2O

3、2、沙门氏菌多价血清、志贺氏菌多价血清二、方法 (实验程序)三、结果四、讨论设计性实验临床标本中病原菌的分离与鉴定实验目的 熟悉临床标本中常见病原菌的分离鉴定程序 学习脓汁、痰、粪便、尿液等临床标本的检查方法实验要求 针对病例，对临床标本中的病原菌进行分离和鉴定 实验前制定方案，实验后写出实验报告 实验分组 5人/组 1套标本/组（脓汁、痰、尿液、粪便） 进程安排 实验分3次进行实验材料实验材料 脓汁 标本：脓拭子 培养基：血琼脂平板 其他：3%H2O2、兔血浆、生理盐水、革兰染液、玻片等 实验方实验方案案第1次课第2次课实验操作与观察实验操作与观察触酶实验+-触酶实验：1.挑取菌落置玻片上；

4、2.滴加12滴3%H2O2，观察结果；实验操作与结果实验操作与结果血浆凝固酶实验+-凝固酶实验：1.取生理盐水于玻片上，挑取待检菌置于生理盐水中，制成菌悬液，观察有无自凝现象。2.向菌悬液中加1滴兔血浆并混合，观察结果。实验材料实验材料 痰 标本：咽拭子 培养基：血琼脂平板 其他：生理盐水、10%胆盐、Optochin纸片、革兰染液、玻片等 实验方案实验方案第1次第2次第3次实验操作实验操作奥普托辛实验：1. 挑取菌落涂于血平板上，将optochin纸片贴于接种处；2. 37培养1824小时，观察结果。胆汁溶菌实验（平板法）：1.在血平板上标记单个菌落2.直接在菌落上加一接种环去氧胆酸纳溶液3

5、.将平板37孵育2030分钟，观察结果实验操作实验操作荚膜染色：石炭酸复红单染 1.涂片、自然干燥、火焰固定； 2.1滴石炭酸复红，立即冲去，镜下观察。实验操作实验操作实验材料实验材料 尿 标本：尿液 培养基： EMB平板 克氏双糖铁斜面培养基 动力-靛基质-尿素半固体琼脂培养基 其他：革兰染液、靛基质试剂、玻片等 实验方案实验方案第1次第2次第3次实验材料实验材料 粪便 标本：肛拭子（1#、2#） 培养基： EMB平板 克氏双糖铁斜面培养基 动力-靛基质-尿素半固体琼脂培养基 其他：生理盐水、靛基质试剂、沙门菌多价血清、志贺菌多价血清、玻片等实验方案实验方案第1次第2次第3次讨论内容 针对实

6、验步骤的讨论； 对结果的分析； 还需要进一步做哪些实验； 此次实验成功或需要改进的地方； 其他预习：肥达反应实验报告 临床标本中病原菌的分离与鉴定 班级_ 组别_ 姓名_ 学号_ 日期_ 材料 1. 待检标本： 2. 培养基： 3. 其他： 方法 结果 讨论（包括对结果的分析、结论以及尚需追加实验等） 肥 达 试 验肥 达 试 验 ( W i d a l test) 用已知的用已知的伤寒沙门菌伤寒沙门菌O O、H H抗原抗原、甲型副伤寒沙门菌甲型副伤寒沙门菌、肖氏肖氏、希希氏沙门菌氏沙门菌H H抗原抗原的诊断菌液，与的诊断菌液，与患者患者血清血清作作定量凝集试验定量凝集试验，检测，检测患者血清

7、中的相应抗体，患者血清中的相应抗体，辅助诊辅助诊断伤寒、副伤寒断伤寒、副伤寒。Widal test 正常值正常值： 诊断伤寒：诊断伤寒：O凝集效价凝集效价1:80, H凝集效价凝集效价1:160; 诊断副伤寒：诊断副伤寒：O凝集效价凝集效价1:80, H凝集效价凝集效价1:80 才有诊断价值才有诊断价值. 动态观察动态观察：抗体效价随病程延长而上升；：抗体效价随病程延长而上升； 双份血清升高双份血清升高4倍或以上；倍或以上； O与与H抗体的诊断意义抗体的诊断意义： O，H-肠热症肠热症(伤寒或副伤寒伤寒或副伤寒)的可能性大的可能性大 O，H-患病的可能性小患病的可能性小 O不高，不高，H-预防

8、接种预防接种 / 非特异性回忆反应非特异性回忆反应 O，H不高不高-感染早期或与伤寒沙门菌感染早期或与伤寒沙门菌O抗抗原有原有 交叉反应的其他沙门菌感交叉反应的其他沙门菌感染染 少数病例在整个病程中，肥达试验始终呈少数病例在整个病程中，肥达试验始终呈“-”: 早期使用抗生素治疗或患者免疫功能低下早期使用抗生素治疗或患者免疫功能低下Widal test (5人/组)材料：病人未知血清：1#，2#，3#菌液：O、H、PAH、PBH（已知Ag）方法：每组1块多孔板/24支试管； 每人2支吸管； 弃0.5ml于消毒缸 1 2 3 4 5 6 NS 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5ml未知

9、血清(1:10) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5菌液(摇匀) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5ml (4种,1种/人) 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 (阴性对照) 37，水浴过夜（完成一个完整的检验）方法 TO TH TAH TBH TCH TO TH TAH TBH TCH 意义意义 1:640 1:320 1:640 1:320 1:640 1:160 1:640 1:160 发病早期不久前患过伤寒/菌苗接种/非特异回忆伤寒副伤寒甲肖氏副伤寒 “O”抗原凝集现象：（呈颗粒状薄膜） 100100凝集：“”： 上层清亮，底部完全凝集，呈颗粒状薄膜（有卷边）。 7575凝集：“”： 上层不太清亮，底部凝集明显。 5050凝集：“”： 上层混浊，下层凝集。孔底中央中间约 5050白色沉淀，周围膜状凝集，约5050。 2525凝集：“”：液体比较混浊，膜状凝集少。 0 0凝集：“”：如第6 6孔，混悬后，混浊均匀，底部无凝集。 “H”抗原凝集现象：（呈絮状凝集） 100凝集：“”：液体清亮，底部中央完全凝集，呈蓬松絮状；混悬起来，液体仍然清亮，分散开的絮状凝集块漂浮于液体中。 75凝集：“”：上层不太清亮，底部絮状凝集明显。 50凝